SNAP-tag e CLIP-tag sistemi di etichettatura attivare la proteina specifica, attacco covalente di molecole, tra cui coloranti fluorescenti, ad una proteina di interesse in cellule vive. Una volta clonato ed espresso, la proteina tag può essere utilizzato con una varietà di supporti per numerose applicazioni a valle senza dover clonare di nuovo.
SNAP-tag e CLIP-tag sistemi di etichettatura attivare la proteina specifica, attacco covalente di molecole, tra cui coloranti fluorescenti, ad una proteina di interesse in cellule vive. Questi sistemi offrono una vasta gamma di substrati fluorescenti ottimizzato per una vasta gamma di strumenti di imaging. Una volta clonato ed espresso, la proteina tag può essere utilizzato con una varietà di supporti per numerose applicazioni a valle senza dover clonare di nuovo. Ci sono due passi a utilizzare questo sistema: la clonazione e l'espressione della proteina di interesse come SNAP-tag di fusione, e l'etichettatura della fusione con la SNAP-tag substrato di scelta. Lo SNAP-tag è una piccola proteina umana sulla base di O<sup> 6</sup>-Alkylguanine-DNA-alkyltransferase (hAGT), una proteina di riparazione del DNA. SNAP-tag le etichette sono coloranti coniugati con guanina o chloropyrimidine gruppi lasciando tramite un linker benzilico. Nella reazione di etichettatura, il gruppo sostituito benzilico del substrato è covalentemente attaccato al SNAP-tag. CLIP-tag è una versione modificata di SNAP-tag, progettato per reagire con benzylcytosine piuttosto che derivati benzylguanine. Quando utilizzato in combinazione con SNAP-tag, CLIP-tag permette l'etichettatura ortogonale e complementare di due proteine contemporaneamente nelle stesse cellule.
Ci sono diverse variabili influenzano i risultati osservati, come messa a fuoco, l'intensità del laser, capacità delle apparecchiature, obiettivo utilizzato, ecc fotostabilità del fluoroforo determina la velocità di fluorescenza deve essere catturato prima di svanire.
Questo metodo di etichettatura delle proteine è versatile e adatto per molte applicazioni. Tecnologie SNAP-tag e CLIP-tag per l'etichettatura specifica di proteine di fusione con sonde sintetiche consentono vari aspetti della funzione della proteina, tra cui una varietà di processi dinamici in cellule vive e in lisati cellulari. SNAP-,-CLIP, MCP-e ACP-tag tecnologie offrono versatilità e semplicità straordinaria per l'imaging di proteine in cellule vive e fissi e allo studio delle proteine in vitro. La creazione di un costrutto singolo gene produce una proteina di fusione con tag in grado di formare un legame covalente a una varietà di gruppi funzionali, tra cui fluorofori, biotina, o perline. La proteina di interesse deve essere clonato ed espresso una sola volta e poi la fusione può essere utilizzata con una varietà di substrati fluorescenti per numerose applicazioni a valle come l'etichettatura proteina simultanea all'interno delle cellule vive, la localizzazione delle proteine e la traslocazione, pulse-chase esperimenti, studi di internalizzazione del recettore , selettivo etichettatura superficie cellulare, la proteina abbattere analisi, la rilevazione delle proteine in SDS-PAGE, citometria a flusso, analisi di legame high-throughput in micropiastre, esperimenti di interazione biosensore, e saggi di binding FRET-based.
The authors have nothing to disclose.
Kai Johnsson
Ivan Correa
Andreas Brecht
Katrin Müentener
Chris Noren
Luo Dom
Ming Xu
Theodore Davis
Salvatore Russello
Aihua Zhang
Inca Ghosh
Elissa Maunus
Nicholas Labarthe
James MacFarland
John Buswell
Brenda Desmond
James Ellard
Don Pettine
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
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CHO-K1 Cells | ATCC | CCL-61 | ||
Serum free F-12K | ||||
Lab-Tek II Chambered Coverglass with #1.5 borosilicate coverglass chambers | Nalgene Nunc Int. | 155409 | Lot: 100808-8-0 | |
DMEM | ||||
Hoechst 33342, trihydrochloride, trihydrate (10 mg/ml solution in water, 16.2 mM solution) | Invitrogen Molecular Probes | H3570 | 470519 | |
Zeiss Apotome Axiovert 200M fluorescent microscope | Zeiss | |||
Transpass V | New England Biolabs | M2561S | 0030709 | |
Transpass D2 | New England Biolabs | M2554S | 0060802 | |
SNAP-Cell TMR Star | New England Biolabs | S9105S | 0010811 | |
pSNAP-ADBR2 Control Plasmid | New England Biolabs | N9178S | 0010811 | |
pSNAP-H2B Control Plasmid | New England Biolabs | N9179S | 0010811 |