SNAP-tag och clip-taggen protein märkningssystem aktivera specifika, kovalent bindning av molekyler inklusive fluorescerande färger, till ett protein av intresse i levande celler. När klonade och uttryckt kan taggade proteinet användas med en mängd av substrat för många efterföljande program utan att behöva klona igen.
SNAP-tag och clip-taggen protein märkningssystem aktivera specifika, kovalent bindning av molekyler inklusive fluorescerande färger, till ett protein av intresse i levande celler. Dessa system erbjuder ett brett urval av fluorescerande substrat optimerade för en rad imaging instrumentering. När klonade och uttryckt kan taggade proteinet användas med en mängd av substrat för många efterföljande program utan att behöva klona igen. Det finns två steg för att använda detta system: kloning och uttryck av proteinet av intresse som ett SNAP-tagg fusion, och märkning av fusion med SNAP-taggen substrat val. Den SNAP-taggen är ett litet protein som bygger på mänskliga O<sup> 6</sup>-Alkylguanine-DNA-alkyltransferase (hAGT), en DNA-reparation protein. SNAP-tagg etiketter färgämnen konjugerade med guanin eller chloropyrimidine lämnar grupper via en bensyl länkare. I märkningen reaktionen är ersatt bensyl grupp av underlaget kovalent bifogas SNAP-taggen. CLIP-tagg är en modifierad version av SNAP-taggen, konstruerade för att reagera med benzylcytosine snarare än benzylguanine derivat. När den används tillsammans med SNAP-taggen gör CLIP-tagga ortogonala och kompletterande märkning av två proteiner samtidigt i samma celler.
Det finns flera variabler som påverkar observerade resultat som fokus, laser intensitet, utrustning kapacitet, objektiv etc. fotostabilitet av fluoroforen bestämmer hur snabbt fluorescens fångas innan de bleknar.
Denna metod för protein märkning är mångsidig och lämplig för många applikationer. SNAP-tag och clip-tagg teknik för särskild märkning av fusionsproteiner med syntetiska sonder att olika aspekter av proteiners funktion, bl.a. olika typer av dynamiska processer i levande celler och i cell lysates. SNAP-, CLIP-, MCP-och AVS-taggen teknik ger enkelhet och extra mångsidighet till avbildning av proteiner i levande och fasta celler och till studiet av proteiner in vitro. Skapandet av en enda gen konstruktion ger en taggad fusionsprotein i stånd att bilda ett kovalent koppling till en rad olika funktionella grupper, däribland fluoroforer, biotin, eller pärlor. Proteinet av intresse måste klonas och uttryckte bara en gång och sedan fusion kan användas med en rad olika fluorescerande substrat för många nedströms applikationer såsom samtidiga protein märkning inuti levande celler, protein lokalisering och translokation, puls-jakt experiment, receptor internalisering studier , selektiv cellytan märkning, protein dra ner analyser, protein upptäckt i SDS-PAGE, flödescytometri, med hög genomströmning bindande tester på mikrotiterplattor, Biosensor experiment interaktion och FRET-baserade bindande analyser.
The authors have nothing to disclose.
Kai Johnsson
Ivan Correa
Andreas Brecht
Katrin Müentener
Chris Noren
Luo sön
Ming Xu
Theodore Davis
Salvatore Russello
Aihua Zhang
Inca Ghosh
Elissa Maunus
Nicholas Labarthe
James MacFarland
John Buswell
Brenda Desmond
James Ellard
Don Comb
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
CHO-K1 Cells | ATCC | CCL-61 | ||
Serum free F-12K | ||||
Lab-Tek II Chambered Coverglass with #1.5 borosilicate coverglass chambers | Nalgene Nunc Int. | 155409 | Lot: 100808-8-0 | |
DMEM | ||||
Hoechst 33342, trihydrochloride, trihydrate (10 mg/ml solution in water, 16.2 mM solution) | Invitrogen Molecular Probes | H3570 | 470519 | |
Zeiss Apotome Axiovert 200M fluorescent microscope | Zeiss | |||
Transpass V | New England Biolabs | M2561S | 0030709 | |
Transpass D2 | New England Biolabs | M2554S | 0060802 | |
SNAP-Cell TMR Star | New England Biolabs | S9105S | 0010811 | |
pSNAP-ADBR2 Control Plasmid | New England Biolabs | N9178S | 0010811 | |
pSNAP-H2B Control Plasmid | New England Biolabs | N9179S | 0010811 |