SNAP-etiqueta y una etiqueta CLIP-los sistemas de etiquetado de proteínas permiten la conexión específico, covalente de moléculas, incluyendo tintes fluorescentes, con una proteína de interés en las células vivas. Una vez clonado y expresado, la proteína marcada se puede utilizar con una variedad de sustratos para numerosas aplicaciones posteriores sin tener que clonar otra vez.
SNAP-etiqueta y una etiqueta CLIP-los sistemas de etiquetado de proteínas permiten la conexión específico, covalente de moléculas, incluyendo tintes fluorescentes, con una proteína de interés en las células vivas. Estos sistemas ofrecen una amplia gama de sustratos fluorescentes optimizado para una amplia gama de instrumentos de imagen. Una vez clonado y expresado, la proteína marcada se puede utilizar con una variedad de sustratos para numerosas aplicaciones posteriores sin tener que clonar otra vez. Hay dos pasos para usar este sistema: la clonación y expresión de la proteína de interés como una fusión SNAP-etiqueta, y el etiquetado de la fusión con el sustrato SNAP-etiqueta de la elección. El SNAP-tag es una pequeña proteína humana sobre la base de O<sup> 6</sup>-Alkylguanine-DNA-alquiltransferasa (hAGT), una proteína de reparación del ADN. Etiqueta de SNAP-etiquetas son tintes conjugados con guanina o cloropirimidina grupos salientes a través de un conector de bencilo. En la reacción de marcaje, el grupo bencilo sustituido del sustrato se une covalentemente a la SNAP-etiqueta. CLIP-etiqueta es una versión modificada de la SNAP-tag, diseñado para reaccionar con benzylcytosine en lugar de derivados bencilguanina. Cuando se utiliza junto con SNAP-tag, CLIP-etiqueta permite el etiquetado ortogonales y complementaria de dos proteínas simultáneamente en las mismas celdas.
Hay algunas variables que afectan los resultados observados, tales como la intensidad del láser se centran, las capacidades del equipo, la lente utilizada, etc fotoestabilidad del fluoróforo determina la rapidez con la fluorescencia debe ser capturado antes de desaparecer.
Este método de etiquetado de proteínas es muy versátil y útil para muchas aplicaciones. Tecnologías de la etiqueta de SNAP-y CLIP etiquetas para el etiquetado específico de proteínas de fusión con sondas sintéticas permiten diversos aspectos de la función de las proteínas, incluyendo una variedad de procesos dinámicos en células vivas y en lisados celulares. SNAP-, CLIP-, MCP y ACP-tag tecnologías proporcionan una versatilidad sencillez y extraordinaria a la imagen de las proteínas en células vivas y fijos y al estudio de las proteínas in vitro. La creación de una única construcción génica produce una proteína de fusión etiquetados capaz de formar un enlace covalente a una variedad de grupos funcionales, incluyendo fluoróforos, biotina, o de granos. La proteína de interés debe ser clonado y expresado una sola vez y después de la fusión se puede utilizar con una variedad de sustratos fluorescentes para numerosas aplicaciones posteriores, como el etiquetado de proteínas simultáneamente dentro de células vivas, localización de la proteína y el traslado, el pulso-caza experimentos, estudios de internalización del receptor , el etiquetado selectivo de la superficie celular, proteínas desplegable ensayos, la detección de proteínas en SDS-PAGE, citometría de flujo, de alto rendimiento de los ensayos de unión en placas de microtitulación, experimentos biosensor interacción, y FRET basado en ensayos de unión.
The authors have nothing to disclose.
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
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CHO-K1 Cells | ATCC | CCL-61 | ||
Serum free F-12K | ||||
Lab-Tek II Chambered Coverglass with #1.5 borosilicate coverglass chambers | Nalgene Nunc Int. | 155409 | Lot: 100808-8-0 | |
DMEM | ||||
Hoechst 33342, trihydrochloride, trihydrate (10 mg/ml solution in water, 16.2 mM solution) | Invitrogen Molecular Probes | H3570 | 470519 | |
Zeiss Apotome Axiovert 200M fluorescent microscope | Zeiss | |||
Transpass V | New England Biolabs | M2561S | 0030709 | |
Transpass D2 | New England Biolabs | M2554S | 0060802 | |
SNAP-Cell TMR Star | New England Biolabs | S9105S | 0010811 | |
pSNAP-ADBR2 Control Plasmid | New England Biolabs | N9178S | 0010811 | |
pSNAP-H2B Control Plasmid | New England Biolabs | N9179S | 0010811 |