对活细胞成像的SNAP - Tag融合蛋白的荧光标记的COS - 7

Summary

SNAP标签和剪辑标签蛋白标签制度，包括荧光染料分子，使特定的共价结合，一个活细胞中的兴趣的蛋白质。一旦克隆和表达，标记蛋白可用于许多下游应用的各种基材，而无需再次进行克隆。

Abstract

SNAP标签和剪辑标签蛋白标签制度，包括荧光染料分子，使特定的共价结合，一个活细胞中的兴趣的蛋白质。这些系统提供了一个广阔的选择优化一系列的成像仪器的荧光底物。一旦克隆并表达，标记蛋白可用于许多下游应用的各种基材，而无需再次进行克隆。使用这个系统有两个步骤：利益作为一个SNAP标签的融合，并选择SNAP标签基材的融合标签蛋白的克隆和表达。管理单元的标签是一种小分子蛋白基于人类Ø⁶ alkylguanine的DNA – alkyltransferase（hAGT），DNA修复蛋白。 SNAP – TAG标签染料标记的鸟嘌呤或通过一个苄连接器氯嘧啶离开组。在标记反应，基板取代的苄基共价连接的SNAP标签。夹子标签是SNAP标签的修改后的版本，设计benzylcytosine而不是苄基鸟嘌呤衍生物反应。 SNAP标签一起使用时，夹子标记允许的两种蛋白质的正交性，互补性的标签，同时在相同的细胞。

Protocol

电镀CHO – K1细胞： CHO – K1细胞已根据完整的F – 12K6毫升的标准协议胰酶消化新增50 -100μL。 移液器向上和向下几次混合细胞悬液，然后分装胰酶消化的细胞悬液300μL1.5硼硅玻璃罩商会（每孔8室无菌实验室TEK二腔盖玻片NALGENE NUNC诠释;产品＃155409;批次：100808-8-0）。 在37℃，5％的CO 2过夜孵育样品。 瞬时转染CHO – K1细胞pSNAP ADRB2和pSNAP – H2B： 接种前一天看细胞密度和健康检查的细胞培养商会。 标签适当数量的离心管。 在层流罩，成立转复杂的混合物，根据下面的示例图表，使用或0.3微克pSNAP ADBR2控制质粒DNA pSNAP – H2B控制质粒DNA，1μL的TransPass D2和1μLTransPass V或0.3微克每个反应。 质粒反应数 μl的无血清培养基 μL的TransPass D2 μL的TransPass V μL的质粒DNA μL的TransPass D2/reaction μL的TransPass V /反应 ng的DNA /反应 DNA的浓度。 （ng /μL的） μL的质粒DNA /反应 SNAP – ADRB2 5 236.5 5 5 3.5 1 1 300 472.34 0.7 H2B – SNAP 5 237 5 5 3 1 1 300 515.89 0.6 嘲笑 5 240 5 5 0 1 1 0 0 0 未转染 5 250 0 0 0 0 0 0 0 0 首先，混合无血清的F – 12K与相应的质粒DNA，然后添加TransPass D2转染试剂，然后添加TransPass V转染试剂。向上和向下轻轻吹打几次后，每个试剂此外混合组件。 在室温下孵育30分钟的反应。 在孵化过程中，洗细胞一次，600μL完全DMEM，并添加到每个样品450μL完全DMEM 将每个样品50μL转染的复杂混合物，缓慢而明智的下拉时尚。 孵育的样品在37℃过夜，5％的CO 2。 SNAP细胞的TMR与pSNAP ADRB2和pSNAP – H2B瞬时转染CHO – K1细胞之星标签： 小心地从每个样品由真空抽吸转复杂的媒体。 600μL完整的F – 12K和洗涤细胞两次取代，每孔600μL完整的F – 12K的媒体。 混合染料标签介质，加入995μL的完整的F – 12K和51μL0.6毫米的SNAP -细胞的TMR明星基板。 SNAP细胞的TMR明星终浓度应采用3mm。移液器向上和向下几次混合后的基板此外。 小心取出样品生长介质，每孔加200μL染色标记媒体。在37样本℃，5％CO 2为30分钟。 虽然样品孵化，准备为核染色样品混合1μL赫希斯特33342 trihydrochloride，三水（10毫克/毫升溶液中水，16.2 mM的解决方案; Invitrogen公司的分子探针）赫斯特33342解决方案在10毫升的完整的​​F – 12K 。 媒体从所有样本中删除，并添加600μL稀赫斯特解决每个样品。在37样本℃，5％CO 2为5分钟。 洗净样品600μL完整的F – 12K的三倍。 样品在37℃，5％CO2的一个额外的30分钟2，允许非法人的荧光团弥漫的细胞。 30分钟后，媒体上的SNAP -细胞样本最后一次更改，并进行成像。 使用蔡司Apotome AXIOVERT 200M荧光显微镜图像的细胞。 代表性的成果 图1。使用标准的现场COS – 7细胞表达的SNAP -标签融合的荧光显微镜，荧光成像的一些具有代表性的结果。这第一个图像显示现场COS – 7细胞表达pSNAP – H2B（核组蛋白）标记的SNAP -细胞的TMR明星的。 pSNAP H2B构造生成使用pSNAP标记（M）载体。细胞标记的SNAP -细胞为30分钟（TMR）明星，并用Hoechst 33342（蓝色）counterstained的原子核。粉红色的荧光，表明组蛋白是目前除了蓝色荧光显示细胞核红色荧光的叠加。 H2B蛋白的表达清楚，容易辨识。 图2和3。下面两个图像显示现场的COS – 7细胞瞬时转染pSNAP的ADRβ2 。 细胞标记的SNAP -细胞TMR明星（红色），并用Hoechst 33342（蓝色）counterstained。 pSNAPADRβ2构造生成使用pSNAP标记（M）载体。细胞标记的SNAP -细胞为30分钟（TMR）明星，并用Hoechst 33342（蓝色）counterstained的原子核。红色荧光，表明细胞表面的受体蛋白ADRB2的存在，而蓝色荧光标识的核。

Discussion

有几个变量的影响，如聚焦，激光强度，设备的能力，所使用的镜头，等的荧光耐光决定之前，必须先褪色捕获如何快速的荧光观察到的结果。

这种蛋白质的标签方法是灵活，适用于许多应用。 SNAP – tag和剪辑标记合成探针的融合蛋白与特定的标签技术，使蛋白质功能的各个方面，包括在活体细胞和细胞裂解液中的各种动态过程，。 SNAP -，夹具，MCP – ACP标签技术提供的简单性和非凡的多功能蛋白质在活细胞和固定细胞成像和蛋白质在体外研究。建立一个单一的基因构造产生一个标签的融合蛋白能够形成一个共价键，多种功能组别，包括荧光，生物素，或珠子。感兴趣的蛋白质必须被克隆，并表示只有一次，然后融合，可以使用各种众多的下游应用，如活细胞内蛋白质的同时标签，蛋白定位和移位脉冲追逐实验，受体的内化研究用荧光底物，有选择性的细胞表面的标签，蛋白质下拉检测，蛋白SDS – PAGE电泳，流式细胞仪，高通量微孔板，生物传感器相互作用实验结合实验检测，以及基于FRET的结合实验。

Materials

Material Name	Type	Company	Catalogue Number	Comment
CHO-K1 Cells		ATCC	CCL-61
Serum free F-12K
Lab-Tek II Chambered Coverglass with #1.5 borosilicate coverglass chambers		Nalgene Nunc Int.	155409	Lot: 100808-8-0
DMEM
Hoechst 33342, trihydrochloride, trihydrate (10 mg/ml solution in water, 16.2 mM solution)		Invitrogen Molecular Probes	H3570	470519
Zeiss Apotome Axiovert 200M fluorescent microscope		Zeiss
Transpass V		New England Biolabs	M2561S	0030709
Transpass D2		New England Biolabs	M2554S	0060802
SNAP-Cell TMR Star		New England Biolabs	S9105S	0010811
pSNAP-ADBR2 Control Plasmid		New England Biolabs	N9178S	0010811
pSNAP-H2B Control Plasmid		New England Biolabs	N9179S	0010811