COS - 7の蛍光標識は、生細胞イメージングのためにSNAP - Tag融合タンパク質を発現する

Summary

SNAP – tagとCLIP -タグタンパク質のラベリングシステムは生細胞で目的のタンパク質に、蛍光色素を含む分子の特定の、共有結合を、有効にしてください。一度クローン化と発現し、タグ付けされたタンパク質は、再度クローンを作成することなく、多くのダウンストリームアプリケーションのための基板の様々な使用することができます。

Abstract

SNAP – tagとCLIP -タグタンパク質のラベリングシステムは生細胞で目的のタンパク質に、蛍光色素を含む分子の特定の、共有結合を、有効にしてください。これらのシステムは、イメージング計測の範囲に最適化された蛍光基質の幅広い選択を提供する。一度クローン化と発現し、タグ付けされたタンパク質は、再度クローンを作成することなく、多くのダウンストリームアプリケーションのための基板の様々な使用することができます。このシステムを使用する2つの手順があります。SNAPタグ融合、及び選択肢のSNAP – tagを基板との融合のラベルとして、目的のタンパク質のクローニングおよび発現。 SNAP – tagは、人間のOに基づいて小さなタンパク質である<sup> 6</supDNA修復タンパク質、（hAGT）> – alkylguanine – DNA – alkyltransferase。 SNAPタグラベルは、ベンジルリンカーを介してグアニンに結合した染料またはピリミジン脱離基である。ラベリング反応で、基質の置換ベンジル基が共有結合SNAPタグに添付されます。 CLIP – tagはbenzylcytosineではなく、ベンジルグアニン誘導体と反応するように設計さSNAP – tagの修正版です。 SNAPタグと組み合わせて使用​​すると、CLIP – tagは、同じセル内で同時に2つのタンパク質の直交すると補完的なラベリングが可能になります。

Protocol

メッキCHO – K1細胞： F – 12Kの完全の6ミリリットルの標準プロトコールに従ってトリプシン処理されているCHO – K1細胞を50 -100μLを加える。 その後、上下に数回ピペッティングして混合細胞懸濁液、＃1.5ホウケイ酸カバーガラスチャンバー（NalgeneヌンクのIntと滅菌8室のLab – Tek社IIチェンカバーガラスの各ウェルにトリプシン処理細胞懸濁液のアリコートを300μl;商品＃155409;ロット：100808-8-0）。 37℃、5％CO 2で一晩試料をインキュベートする。 pSNAP – ADRB2とpSNAP – H2BとCHO – K1細胞のトランジェントトランスフェクション： 細胞密度と健康を探すために前日に播種された細胞培養チャンバーを確認してください。 マイクロチューブの適切な数のラベルを付けます。 層流フードでは、トランスフェクション複合体混合物は、0.3μgのpSNAP – ADBR2コントロールプラスミドDNAまたはpSNAP – H2BのコントロールプラスミドDNA、TransPassのD2を1μlとTransPass V 1μlの0.3μgのいずれかを使用して、次のサンプルチャートに基づいて設定反応あたり。 プラスミド反応の数無血清培地の液 TransPass D2の液 TransPass Vの添加プラスミドDNAの添加 TransPassのD2/reactionμlの TransPass V /反応の液 DNA /反応のNG DNAコンク。 （ng /μlに） プラスミドDNA /反応μlの SNAP – ADRb2 5 236.5 5 5 3.5 1 1 300 472.34 0.7 H2B – SNAP 5 237 5 5 3 1 1 300 515.89 0.6 モック 5 240 5 5 0 1 1 0 0 0 トランスフェクトされていない 5 250 0 0 0 0 0 0 0 0 最初に、適切なプラスミドDNAを無血清F – 12K混ぜ、その後TransPass Vトランスフェクション試薬を追加し、TransPass D2フェクション試薬を加える。各試薬の添加後、穏やかに数回ピペッティングでよく部品を混ぜる。 30分間室温で反応します。 インキュベーションの間、完全DMEM600μlので細胞を1回洗浄し、各サンプルに完全DMEM 450μlを加える。 ゆっくりと滴下方式で、各サンプルにトランスフェクション複合体混合物の50μlを追加。 ° C、5％CO 2 37℃で一晩サンプルをインキュベートする。 一過性pSNAP – ADRB2とpSNAP – H2BでトランスフェクトしたCHO – K1細胞のSNAP -セルのTMRのスターラベル： 慎重に真空吸引することにより、各サンプルからトランスフェクション複合メディアを削除します。 F – 12Kの完全な600μlで細胞を2回洗浄し、F – 12Kの完全な600μlで各ウェルの培地を交換してください。 完全なF – 12Kと51μlの0.6 mMのSNAP -セルTMR -スター基板の995μlを添加して色素のラベリングのメディアを混在させる。 SNAP -セルのTMR – Starの最終濃度は、3mmにする必要があります。基質添加後混合して数回上下にピペッティング。 慎重にサンプルから増殖培地を除去し、各ウェルに色素ラベリングメディアの200μlを加える。 37サンプルをインキュベート° C、30分間、5％CO 2を 。 完全なF – 12Kの10mlに、サンプルはインキュベートされているが、ヘキスト33342、三塩酸塩、三水和​​物（Invitrogen社Molecular Probes社水に10 mg / mlの溶液を、16.2 mM溶液）1μlを混合して試料の核染色用にHoechst 33342を溶液を調製。 すべてのサンプルからメディアを取り出して、各サンプルの希釈ヘキスト溶液を600μlずつ加える。 37サンプルをインキュベート° C、5分間、5％CO 2を 。 F – 12Kの完全な600μlのサンプルを3回洗浄する。 37サンプルをインキュベート° C、5％非法人の蛍光物質が細胞外に拡散するようにさらに30分間CO 2。 30分後、最後にもう一度は、SNAP -細胞サンプルにメディアを変更し、画像処理に進みます。 ツァイス線分Axiovert 200M蛍光顕微鏡を用いて画像の細胞。 代表的な結果 図1ここです。SNAPタグ融合を表現しているライブCOS – 7細胞の標準的な蛍光顕微鏡を用いた蛍光イメージングのいくつか代表的な結果。この最初のイメージはSNAP -セルTMR -スターで標識pSNAP – H2Bを（ヒストン核）を発現するライブCOS – 7細胞を示しています。 pSNAP – H2BコンストラクトはpSNAP -タグ（m）のベクトルを用いて生成されました。細胞を30分間SNAP -セルのTMR -スターで標識し、核についてはヘキスト33342（青）で対比染色した。ピンクの蛍光は、ヒストンタンパク質が核を示す青色の蛍光に加えて存在する赤色蛍光のオーバーレイを示しています。 H2Bタンパク質の発現は、明確かつ容易に識別されます。 図2と図3。次の2つは画像が一時的にpSNAP -ADRβ2でトランスフェクトしたライブCOS – 7細胞を示す。 細胞は、SNAP -セルTMR -スター（赤）で標識し、ヘキスト33342（青）で対比染色した。 pSNAP -ADRβ2コンストラクトはpSNAP -タグ（m）のベクトルを用いて生成されました。細胞を30分間SNAP -セルのTMR -スターで標識し、核についてはヘキスト33342（青）で対比染色した。青色の蛍光が核を識別しながら、赤色の蛍光は、細胞表面の受容体タンパク質のADRB2の存在を示している。

Discussion

フルオロフォアの光安定が退色する前に捕捉されている必要がありますどのように迅速に蛍光を決定するような焦点、レーザー強度、機器の機能、レンズが使用される、などの観測結果に影響を与えるいくつかの変数があります。

タンパク質標識のこの方法は汎用性と、多くのアプリケーションに適しています。合成プローブとの融合タンパク質の特定のラベルのためのSNAP – tagとCLIPタグ技術が生きている細胞で、細胞溶解物の動的なプロセスのさまざまなを含むタンパク質の機能のさまざまな側面を、有効にしてください。 SNAP -、CLIP -、MCP -およびACP -タグ技術は、ライブと固定された細胞中のタンパク質のイメージング、およびin vitroでのタンパク質の研究にシンプルさと異常な汎用性を提供します。単一の遺伝子コンストラクトの作成は、蛍光色素、ビオチン、またはビーズを含む官能基、のさまざまな共有結合を形成することができるタグ付き融合タンパク質が得られます。目的のタンパク質をクローニングし、発現し一度だけして、融合はそのような生細胞内の同時タンパク質標識、タンパク質の局在や転座、パルス – チェイス実験、受容体の内在化の研究など、数多くのダウンストリームアプリケーションのための蛍光基質の様々で使用することができますする必要があります。 、選択的な細胞表面のラベリング、タンパク質はアッセイ、SDS – PAGEにおけるタンパク質の検出、フローサイトメトリー、高スループットのマイクロタイタープレートに結合アッセイ、バイオセンサーの相互作用の実験、およびFRETに基づく結合アッセイをプルダウン。

Materials

Material Name	Type	Company	Catalogue Number	Comment
CHO-K1 Cells		ATCC	CCL-61
Serum free F-12K
Lab-Tek II Chambered Coverglass with #1.5 borosilicate coverglass chambers		Nalgene Nunc Int.	155409	Lot: 100808-8-0
DMEM
Hoechst 33342, trihydrochloride, trihydrate (10 mg/ml solution in water, 16.2 mM solution)		Invitrogen Molecular Probes	H3570	470519
Zeiss Apotome Axiovert 200M fluorescent microscope		Zeiss
Transpass V		New England Biolabs	M2561S	0030709
Transpass D2		New England Biolabs	M2554S	0060802
SNAP-Cell TMR Star		New England Biolabs	S9105S	0010811
pSNAP-ADBR2 Control Plasmid		New England Biolabs	N9178S	0010811
pSNAP-H2B Control Plasmid		New England Biolabs	N9179S	0010811