SNAP-теги и CLIP-теги системах белка маркировки позволяют конкретные, ковалентного присоединения молекул, в том числе флуоресцентные краски, белок в живых клетках. После клонирован и выражен, помеченный белок может использоваться с различными субстратами для многочисленных приложений вниз по течению, не имея для клонирования снова.
SNAP-теги и CLIP-теги системах белка маркировки позволяют конкретные, ковалентного присоединения молекул, в том числе флуоресцентные краски, белок в живых клетках. Эти системы предлагают широкий выбор флуоресцентных субстратов оптимизированы для диапазона изображения приборов. После клонирован и выражен, помеченный белок может использоваться с различными субстратами для многочисленных приложений вниз по течению, не имея для клонирования снова. Существуют два шага, чтобы с помощью этой системы: клонирование и экспрессия белка интерес как SNAP-теги фьюжн, и маркировка слияния с SNAP-теги субстрат выбора. SNAP-тег небольшой белок, основанные на человеческих O<sup> 6</sup>-Alkylguanine-ДНК-alkyltransferase (hAGT), белок репарации ДНК. SNAP-теги метки красителей конъюгированных с гуанин или хлорпиримидин уходящих групп через бензил компоновщика. В маркировке реакции, замещенный бензил группа субстрат ковалентно связаны с SNAP-тегов. CLIP-тег модифицированную версию SNAP-тег, спроектирован, чтобы вступать в реакцию с benzylcytosine, а не benzylguanine производных. При использовании в сочетании с SNAP-теги, CLIP-тегов позволяет ортогональные и дополнительные маркировки двух белков одновременно в том же клеток.
Есть несколько факторов, влияющих на результаты наблюдений, таких как фокус, интенсивность лазерного излучения, оборудование возможностей, используемого объектива и т.д. фотостабильность флуорофора определяет, насколько быстро флуоресценции должно быть захвачен был утрачен.
Такой способ маркировки белка является универсальным и подходит для многих приложений. SNAP-теги и CLIP-теги технологий для конкретной маркировки белков слияния с синтетическими зондов позволяют различным аспектам функции белка, в том числе различные динамические процессы в живых клетках и в клеточных лизатов. SNAP-, CLIP-, MCP-и ACP-теги технологии обеспечивают простоту и чрезвычайных универсальность визуализации белков в живых и фиксированных клеток и изучение белков в лабораторных условиях. Создание единого построить ген дает меткой гибридный белок способен образовывать ковалентную связь с различными функциональными группами, в том числе флуорофоров, биотин, или бусы. Белок должен быть клонированы и выразил только один раз и затем синтез можно использовать с различными флуоресцентными субстраты для многочисленных вниз по течению приложений, таких как одновременная маркировка белка внутри живых клеток, локализация белка и транслокации, широтно-погони эксперименты, исследования рецепторов интернализации , селективный маркировки поверхности клеток, белка выпадающем анализы, белок обнаружения в SDS-PAGE, проточной цитометрии, высокой пропускной обязательные анализы в микротитровальных пластин, биосенсор экспериментов взаимодействия, и FRET основе обязательных анализов.
The authors have nothing to disclose.
Кай Джонсон
Иван Корреа
Андреас Брехта
Катрин Müentener
Крис Noren
Ло ВС
Сюй Мин
Теодор Дэвис
Сальваторе Russello
Aihua Чжан
Инков Гош
Элисса Maunus
Николай Лабарт
Джеймс Макфарленд
Джон Басуэлл
Бренда Десмонд
Джеймс Эллард
Дон Comb
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
CHO-K1 Cells | ATCC | CCL-61 | ||
Serum free F-12K | ||||
Lab-Tek II Chambered Coverglass with #1.5 borosilicate coverglass chambers | Nalgene Nunc Int. | 155409 | Lot: 100808-8-0 | |
DMEM | ||||
Hoechst 33342, trihydrochloride, trihydrate (10 mg/ml solution in water, 16.2 mM solution) | Invitrogen Molecular Probes | H3570 | 470519 | |
Zeiss Apotome Axiovert 200M fluorescent microscope | Zeiss | |||
Transpass V | New England Biolabs | M2561S | 0030709 | |
Transpass D2 | New England Biolabs | M2554S | 0060802 | |
SNAP-Cell TMR Star | New England Biolabs | S9105S | 0010811 | |
pSNAP-ADBR2 Control Plasmid | New England Biolabs | N9178S | 0010811 | |
pSNAP-H2B Control Plasmid | New England Biolabs | N9179S | 0010811 |