SNAP-etiket ve CLIP-tag protein etiketleme sistemleri, canlı hücreler ilgi bir protein, floresan boyalar da dahil olmak üzere moleküller, kendine özgü, kovalent eklenti sağlar. Klonlanmış ve ifade sonra tekrar clone kalmadan, etiketli protein çok sayıda downstream uygulamalar için çeşitli substratlar kullanılmalıdır.
SNAP-etiket ve CLIP-tag protein etiketleme sistemleri, canlı hücreler ilgi bir protein, floresan boyalar da dahil olmak üzere moleküller, kendine özgü, kovalent eklenti sağlar. Bu sistemler, görüntüleme enstrümantasyon bir dizi için optimize edilmiş floresan substratların geniş bir seçki sunuyor. Klonlanmış ve ifade sonra tekrar clone kalmadan, etiketli protein çok sayıda downstream uygulamalar için çeşitli substratlar kullanılmalıdır. Bu sistemi kullanarak iki adım vardır: SNAP-tag füzyon, füzyon seçim SNAP-tag substrat etiketlenmesi ve protein gibi ilgi klonlama ve ifade. SNAP-etiket insan O dayalı küçük bir protein<sup> 6</sup(HAGT)> alkylguanine-DNA alkyltransferase bir DNA tamir proteini. SNAP-tag etiketleri benzil ilintileyici üzerinden guanin konjuge boyalar veya chloropyrimidine bırakarak grupları. Etiketleme tepki olarak, yüzey yerine benzil grubu kovalent SNAP-etiketi eklenir. CLIP-etiket benzylcytosine ziyade benzylguanine türevleri ile reaksiyona için tasarlanmış SNAP-tag değiştirilmiş bir versiyonu. SNAP-tag ile birlikte kullanıldığında, CLIP-etiketi aynı hücrelerde aynı anda iki proteinin dik ve tamamlayıcı etiketleme sağlar.
Fluorofor fotostabilite solma önce ele olmalıdır ne kadar hızlı floresan belirler odak, lazer yoğunluğu, ekipman özellikleri, lens kullanılır, vs gibi gözlenen sonuçlar etkileyen birçok değişken vardır.
Protein etiketleme Bu yöntem, çok yönlü ve birçok uygulama için uygundur. Sentetik problar ile füzyon proteinleri belirli bir etiketleme için SNAP-etiket ve CLIP-etiket teknolojileri bir çok canlı hücreler ve hücre lizatları dinamik süreçleri de dahil olmak üzere protein fonksiyonu çeşitli yönleriyle sağlar. SNAP, CLIP, MCP-ve ACP-etiket teknolojileri, canlı ve sabit hücrelerin proteinlerin görüntüleme ve proteinlerin in vitro çalışmada, sadelik ve olağanüstü çok yönlülük sağlar. Tek bir gen yapının oluşturulması fluorophores, biotin veya boncuk gibi çeşitli fonksiyonel gruplar, bir kovalent bağ kurma yeteneğine sahip etiketli füzyon proteini verir. Ilgi protein klonlanmış ve ifade sadece bir kez ve daha sonra füzyon floresan substratlar canlı hücrelerin içinde aynı anda protein etiketleme, protein yerelleştirme ve translokasyon, darbe-kovalamaca deneyler, reseptör içselleştirilmesi çalışmaları gibi çok sayıda alt uygulamalar için çeşitli kullanılabilir olmalıdır , seçici hücre yüzeyinde etiketleme, protein testleri, SDS-PAGE, akış sitometri, microtiter plakalar, biyosensör etkileşim deneyleri yüksek verim bağlayıcı deneyleri protein algılama ve FRET-temelli bağlayıcı deneyleri aşağı çekme.
The authors have nothing to disclose.
Kai Johnsson
Ivan Correa
Andreas Brecht
Katrin Müentener
Chris Noren
Luo Sun
Ming Xu
Theodore Davis
Salvatore Russello
Aihua Zhang
Inca Ghosh
Elissa Maunus
Nicholas Labarthe
James MacFarland
John Buswell
Brenda Desmond
James Ellard
Don Tarak
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
CHO-K1 Cells | ATCC | CCL-61 | ||
Serum free F-12K | ||||
Lab-Tek II Chambered Coverglass with #1.5 borosilicate coverglass chambers | Nalgene Nunc Int. | 155409 | Lot: 100808-8-0 | |
DMEM | ||||
Hoechst 33342, trihydrochloride, trihydrate (10 mg/ml solution in water, 16.2 mM solution) | Invitrogen Molecular Probes | H3570 | 470519 | |
Zeiss Apotome Axiovert 200M fluorescent microscope | Zeiss | |||
Transpass V | New England Biolabs | M2561S | 0030709 | |
Transpass D2 | New England Biolabs | M2554S | 0060802 | |
SNAP-Cell TMR Star | New England Biolabs | S9105S | 0010811 | |
pSNAP-ADBR2 Control Plasmid | New England Biolabs | N9178S | 0010811 | |
pSNAP-H2B Control Plasmid | New England Biolabs | N9179S | 0010811 |