هذه المقالة يوضح كيفية استخدام صحيح BioRad هيليوس غون جين لإدخال الحمض النووي في الخلايا البلازميد البصل البشرة وكيفية اختبار للبروتين تفاعلات البروتين في الخلايا البصل على أساس مبدأ التكملة الإسفار ثنائي الجزيء (BiFC)
Abstract
التحقيق في وظائف الجينات في الكائنات المتنوعة تعتمد على معرفة كيف يمكن للمنتجات الجينات تتفاعل مع بعضها البعض في بيئتها الطبيعية الخلوية. والتكملة الإسفار ثنائي الجزيء (BiFC) الفحص<sup> 1</sup> يسمح للباحثين لتصور التفاعلات البروتين البروتين في الخلايا الحية ، وأصبح أداة بحث أساسية. ويستند هذا الاختبار على اثنين من الجمعيات سهلت شظايا من بروتين فلوري (GFP) التي تنصهر فيها كل شريك إلى التفاعل البروتين المحتملة. فإن التفاعل بين الشركاء البروتين two تسهيل رابطة N – C – محطة ومحطة جزء من GFP ، مما أدى إلى مضان. مصنع للباحثين ، وخلايا البشرة البصل نظام مثالي التجريبية لإجراء فحص BiFC بسبب سهولة في الحصول على أنسجة وإعداد البصل ورؤية مباشرة من التألق مع مضان الخلفية ضئيلة. ويشيع استخدام المسدس جين هيليوس (BioRad) لقصف DNA البلازميد الى خلايا البصل. نحن لشرح استخدام هيليوس غون جين لإدخال البلازميد يبني لمدة التفاعل<em> thaliana Arabidopsis</emعوامل النسخ> ، سوس (SEU) وHOMOLOG LEUNIG (LUH)<sup> 2</sup> التصور وتفاعلاتها بوساطة BiFC في خلايا البشرة البصل.
Protocol
أولا إعداد البلازميد يجب أن الحمض النووي بلازميد تستخدم لقصف تكون ذات درجة نقاوة عالية وبتركيز 500ng/μl أو أكبر. BiFC لتشمل اثنين يبني البلازميد ، هناك حاجة 25 ميكروغرام لكل البلازميد. وبعبارة أخرى ، ينبغي أن تكون مختلطة نسبة 1:1 المولي م?…
Discussion
لأول مرة للمستخدمين ، نوصي ممارسة الإجراء بأكمله ، من إعداد خرطوشة للمراقبة ، مع مراسل واحد التأسيسية البلازميد مثل 35S : GFP أو 35S : : المكتب المركزي للاحصاءات. استخدمنا 35S : GFP البلازميد تم الحصول عليها من الدكاترة. ستيف وجبل تشانغ شياو نينغ 6 (الشكل 1A ، D)…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر الدكاترة. ستيف وتشانغ شياو نينغ جبل ل35S : معتمد GFP pGlowbug بناء والزمالة لأبحاث الدكتوراه Hokensen CH في مختبر Z. L' ق من قبل مؤسسة العلوم الوطنية الأميركية (وIOB0616096 MCB0744752). معتمد جزئيا ZL من جامعة ميريلاند محطة التجربة الزراعية.
Materials
Material Name
Type
Company
Catalogue Number
Comment
Yellow onion
Any supermarket
Helios Gene Gun
BioRad
Fluorescent microscope with appropriate filters for GFP or YFP
Hollender, C. A., Liu, Z. Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) Assay for Protein-Protein Interaction in Onion Cells Using the Helios Gene Gun. J. Vis. Exp. (40), e1963, doi:10.3791/1963 (2010).