In questo articolo viene illustrato come utilizzare correttamente il BioRad Helios Gene Gun per introdurre DNA plasmidico in cellule epidermiche di cipolla e come test per interazioni proteina-proteina in cellule di cipolla in base al principio della complementazione bimolecolare fluorescenza (BiFC)
Abstract
Indagine della funzione del gene in diversi organismi si basa sulla conoscenza di come i prodotti gene interagiscono tra loro nel loro ambiente normale cellulare. La fluorescenza complementazione bimolecolare (BiFC) Assay<sup> 1</sup> Permette ai ricercatori di visualizzare le interazioni proteina-proteina nelle cellule viventi ed è diventato uno strumento di ricerca fondamentale. Questo test si basa sulla associazione agevolata di due frammenti di una proteina fluorescente (GFP) che sono ogni fuso con un potenziale partner di proteine interagenti. L'interazione dei due partner proteina faciliterebbe l'associazione dei N-terminale e C-terminale frammento di GFP, portando a fluorescenza. Per i ricercatori cellule vegetali, cipolla epidermiche sono un sistema ideale di sperimentazione per condurre l'analisi BiFC a causa della facilità nel raccogliere ed elaborare i tessuti cipolla e la visualizzazione diretta della fluorescenza con fluorescenza di fondo minima. L'Helios Gun Gene (BioRad) è comunemente usato per bombardare DNA plasmidico in cellule di cipolla. Dimostriamo l'uso di Helios Gun Gene introdurre costruisce plasmide per due interagenti<em> Arabidopsis thaliana</em> Fattori di trascrizione, Seuss (SEU) e omologo Leunig (LUH)<sup> 2</sup> E la visualizzazione delle loro interazioni mediate da BiFC nelle cellule epidermiche di cipolla.
Protocol
I. Preparazione plasmidi Il DNA plasmide usato per bombardamenti devono essere di purezza elevata e ad una concentrazione di 500ng/μl o superiore. Per BiFC che coinvolgono due costrutti plasmide, 25 mcg di ogni plasmide è necessario. In altre parole, 1:1 rapporto molare dei due plasmidi deve essere miscelato per dare origine a 50 mg di DNA totale plasmide per la preparazione di cartucce. Siate consapevoli che l'aggiunta di più del DNA di 50 mg può causare agglomerazione delle particell…
Discussion
Per gli utenti prima volta, si consiglia di praticare l'intera procedura, dalla preparazione delle cartucce di osservazione, con un singolo giornalista plasmide costitutivo come 35S:: GFP o 35S:: GUS. Abbiamo usato un 35S:: GFP plasmide ottenuto da Drs. Steve Monte e Xiaoning Zhang 6 (Figura 1A, D). Le cartucce colpo di controllo gene venduti a RioRad (Cat 165-2244) non sono adatti per le piante.
Per BiFC, un secondo controllo positivo è necessario, che dovrebbe consistere in due partner noto che interagiscono…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo Drs. Steve Monte e Xiaoning Zhang per il 35S:: GFP pGlowbug costruire e la Fellowship Hokensen dottorato di ricerca in laboratorio CH Z. L's è supportato dal US National Science Foundation (IOB0616096 e MCB0744752). ZL è parzialmente supportata dalla University of Maryland Stazione esperimento agricola.
Materials
Material Name
Type
Company
Catalogue Number
Comment
Yellow onion
Any supermarket
Helios Gene Gun
BioRad
Fluorescent microscope with appropriate filters for GFP or YFP
Hollender, C. A., Liu, Z. Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) Assay for Protein-Protein Interaction in Onion Cells Using the Helios Gene Gun. J. Vis. Exp. (40), e1963, doi:10.3791/1963 (2010).