Summary
Настоящий протокол описывает технологию маркировки клонируемой электронной микроскопией для обнаружения белков, меченных металлотионеином, в клетках с использованием нового метода синтеза наночастиц золота, основанного на механизме подавления аутонуклеации.
Abstract
Анализ точной локализации белковых молекул в клетках с ультраструктурным разрешением имеет большое значение для изучения различных физиологических или патологических процессов во всех живых организмах. Таким образом, разработка клонируемых меток, которые можно использовать в качестве зондов электронной микроскопии, имеет большое значение, так же как флуоресцентные белки сыграли решающую роль в области оптической визуализации. Недавно был обнаружен механизм подавления аутонуклеации (ANSM), который позволяет осуществлять специфический синтез наночастиц золота (AuNP) на богатых цистеином метках, таких как металлотионеин (МТ) и антифризный белок (АФП).
На основе ANSM была разработана технология электронной микроскопии маркировки, которая позволяет специфически обнаруживать меченые белки в прокариотических и эукариотических клетках с беспрецедентной эффективностью мечения. Это исследование иллюстрирует протокол обнаружения слитых белков MTn (модифицированный вариант MT, в котором отсутствуют альдегид-реакционноспособные остатки) в клетках млекопитающих с хорошо сохранившейся ультраструктурой. В этом протоколе замораживание под высоким давлением и фиксация замораживанием выполнялись с использованием неальдегидных фиксаторов (таких как дубильная кислота, уранилацетат) для сохранения почти нативной ультраструктуры и предотвращения повреждения активности метки, вызванного альдегидным сшиванием.
Простая одностадийная регидратация использовалась до синтеза AuNP на основе ANSM. Результаты показали, что меченые белки нацелены на различные органеллы, включая мембраны и просвет эндоплазматического ретикулума (ER), а митохондриальные матрицы были обнаружены с высокой эффективностью и специфичностью. Это исследование предоставляет биологам надежный протокол для решения огромного круга биологических вопросов на уровне одной молекулы в клеточном ультраструктурном контексте.
Introduction
В постгеномную эпоху разработка зеленого флуоресцентного белка (GFP) в качестве одномолекулярного репортера для световой микроскопии произвела революцию в области современных исследований в области наук о жизни 1,2. На протяжении десятилетий электронная микроскопия (ЭМ) была мощным инструментом для интуитивного наблюдения за клеточной ультраструктурой с наноразмерным разрешением3; Однако точная идентификация и локализация белковых молекул остаются сложной задачей.
Наиболее часто используемым методом ЭМ-мечения является метод маркировки иммуноэлектронной микроскопии (IEM), который основан на реакции антиген-антитело. Однако, несмотря на то, что в области маркировки ИЭМ было разработано множество методов, включая предварительную и поствстраиваемую ИЭМ (на срезах смолы или гидратированных криосекциях), она по-прежнему страдает от низкой эффективности маркировки (<10%)4,5, что связано с подготовкой образцов и качеством антител. Чтобы преодолеть эти ограничения, разработка генетически закодированных меток имеет большой потенциал применения.
В последние годы были тщательно изучены два основных типа электромагнитных меток. Одним из типов является метод окрашивания DAB, в котором используются такие метки, как APEX2, для окисления 3,3'-диаминобензидина (DAB) до осмофильных полимеров для ЭМ-визуализации 6,7,8,9,10,11,12. Он позволяет маркировать белки с высоким содержанием в субклеточных областях, но не подходит для подсчета отдельных молекул. Другой тип использует металлсвязывающие белки, такие как ферритин 13 и металлотионеин (MT) 14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26, для образования электронно-плотных металлических отложений в situ для ЭМ-визуализации. Только последний обладает реальным потенциалом для визуализации и подсчета одномолекул. Молекулярный размер ферритина слишком велик (~ 450 кДа), чтобы его можно было использовать в качестве перспективной метки, в то время как маленький размер (~ 5 кДа) МТ и его способность связывать различные ионы через свои 20 цистеинов привлекли большое внимание. Несколько лабораторий пытались маркировать очищенные белки слияния МТ или клетки, экспрессирующие МТ, путем инкубации непосредственно с Au +. Эти попытки первоначально доказали, что метки МТ могут связывать ионы золота с образованием высококонтрастных сигналов, но ни одна из них не достигла эффективной идентификации отдельных белков в клетках, и они не являются широко применимыми 14,15,16,17,18,19,20,21,22,23.
Метод синтеза AuNP на основе ANSM, который включает синтез AuNP размером 2-6 нм непосредственно на метках, богатых цистеином (например, MT, варианты MT MTn и MTα, AFP) в качестве электронно-плотных меток для ЭМ-визуализации, является первым надежным и применимым подходом к маркировке белков и обнаружению отдельных молекул в клетках24,25,26. Он позволяет осуществлять специфический синтез AuNP на изолированных белках слияния меток и достиг беспрецедентной эффективности маркировки в нефиксированных или химически фиксированных прокариотических (E. coli) и эукариотических (S. pombe) клетках. Однако реализация того же протокола в более продвинутых системах, таких как клетки млекопитающих или даже ткани, сопряжена с дополнительными проблемами, такими как более сложный внутриклеточный окислительно-восстановительный гомеостаз и более хрупкая клеточная структура.
В этом исследовании представлена клонируемая технология ЭМ-мечения, которая сочетает в себе новый метод синтеза AuNP на основе ANSM для маркировки генетически кодируемых цистеин-богатых меток (MT) с методом пробоподготовки HPF/FSF-регидратации-HPF/FSF, что позволяет однозначно идентифицировать меченые белки по одной молекуле в мембране ER, просвете ER и митохондриальном матриксе в клетках HeLa. Современный метод сочетает в себе такие характеристики, как высокая эффективность мечения, высокое отношение сигнал/шум, одномолекулярная маркировка и сильная универсальность, и этот метод имеет широкие перспективы применения в исследованиях в области наук о жизни.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все расходные материалы, использованные в этом эксперименте, перечислены в таблице материалов. Пошаговый рабочий процесс текущего протокола показан на рисунке 1.
1. Культура клеток на сапфировых дисках
- Перенесите сапфировые диски размером 3 мм x 0,16 мм в центрифужную пробирку объемом 2 мл, содержащую 1 мл этанола, и обработайте ультразвуком в ультразвуковом очистителе в течение 10 минут.
- Обжигайте каждый сапфировый диск в пламени спиртовой лампы до тех пор, пока на поверхности не исчезнут видимые отложения.
ПРИМЕЧАНИЕ: С помощью описанного выше метода сапфировые диски можно перерабатывать много раз. - Пометьте одну сторону каждого сапфирового диска номером с помощью стойкий к растворителям ручки (рис. 1A).
ПРИМЕЧАНИЕ: Используемая маркерная ручка должна быть заранее протестирована, чтобы определить, устойчива ли она к растворителям ацетона и метанола, чтобы предотвратить потерю следов. - Поместите сапфировые диски с маркировкой на дно чашки диаметром 35 мм этикетированной стороной вверх.
- Стерилизуйте чашку для культивирования клеток сапфировыми дисками под ультрафиолетовым светом в течение 30 минут.
- Переверните сапфировые диски пинцетом (маркированной стороной вниз) и стерилизуйте под ультрафиолетовым светом еще 30 минут. Теперь культуральная чашка, содержащая сапфировые диски, готова к культивированию клеток.
ПРИМЕЧАНИЕ: Сапфировые диски также можно стерилизовать автоклавированием. - Засейте клетки на сапфировых дисках, подготовленных выше, и вырастите до 80-90% слияния в клеточном инкубаторе при 37 ° C, влажности 95% и 5% CO2 (рис. 1B).
ПРИМЕЧАНИЕ: Стабильные клеточные линии HeLa, экспрессирующие метки MTn, были сгенерированы, как описано в Jiang et al.26.
2. Замораживание под высоким давлением (HPF)
ВНИМАНИЕ: В этом эксперименте используется жидкий азот. При работе с жидким азотом используйте надлежащие техники безопасности и средства индивидуальной защиты для предотвращения обморожения и удушья.
- Подготовьте морозильную машину под высоким давлением не менее чем за 2 часа до эксперимента в соответствии с инструкциями производителя.
- Перенесите алюминиевые носители HPF типа A (углубление: 0,025 / 0,275 мм) в центрифужную пробирку объемом 2 мл, содержащую 1 мл этанола, и обработайте ультразвуком в ультразвуковом очистителе в течение 10 минут.
- Высушите носители в чашке Петри, покрытой качественной фильтровальной бумагой (средней скорости).
- Предварительно очищенные носители замочите в 1-гексадецене.
ПРИМЕЧАНИЕ: BSA не рекомендуется в качестве криопротектора в текущем эксперименте, так как он будет мешать последующему синтезу наночастиц золота. - Тонким пинцетом возьмите сапфировый диск с клетками из чашки для культивирования; Прикоснитесь к маркированной поверхности качественной фильтровальной бумагой (средней скорости), чтобы удалить излишки среды.
ПРИМЕЧАНИЕ: Теплопроводность воды очень низкая, и слишком много остаточной воды повлияет на эффект замораживания. Сохраняйте минимальное количество воды, чтобы предотвратить высыхание клеток. - Установите сапфировый диск в держатель образца HPF и быстро закройте диск алюминиевым носителем глубиной 0,025 мм, содержащим 1-гексадецен (рис. 1C).
- Аспирируйте излишки раствора качественной фильтровальной бумагой (средней скорости).
- Загрузите держатель образца для замораживания под высоким давлением (рис. 1D).
ПРИМЕЧАНИЕ: Процесс загрузки образца должен быть как можно более быстрым (в течение 1 минуты), чтобы свести к минимуму физиологические изменения из-за изменений температуры, влажности, pH и содержания кислорода. - Выгрузите сапфировый диск-носитель под жидким азотом в пенопластовый криобокс и храните узел в криовиале в жидком азоте перед использованием.
ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь протокол может быть приостановлен. Образцы в криовиалах могут храниться в жидком азоте в течение многих лет.
3. Фиксация замораживания (FSF) и регидратация (рис. 1E)
- Заполните автоматическую машину замораживания (AFS) жидким азотом и охладите камеру до −90 °C.
ВНИМАНИЕ: В этом эксперименте используется жидкий азот. При работе с жидким азотом используйте надлежащие техники безопасности и средства индивидуальной защиты для предотвращения обморожения и удушья. - Приготовьте 2 мл 0,01% дубильной кислоты (мас./об.) в ацетоне (раствор FSF 1) в круглом полипропиленовом контейнере диаметром 20 мм (рис. 1E) в вытяжном шкафу и заморозьте его в жидком азоте.
- Загрузите образцы (сапфировые диски-держатели в сборе) в контейнер с замороженным раствором FSF 1 под LN2 с помощью пинцета с предварительным охлаждением.
- Перенесите контейнер в предварительно охлажденную камеру AFS для обработки FSF при температуре -90 °C.
- Хранить образцы при температуре -90 °C в течение 1 часа; Затем отделите сапфировые диски от носителей с помощью предварительно охлажденного пинцета и убедитесь, что отмеченные стороны сапфировых дисков обращены вниз.
ПРИМЕЧАНИЕ: Пинцет должен быть достаточно предварительно охлажден, чтобы предотвратить изменения температуры. Сапфировые диски должны легко отделяться. - Хранить при температуре −90 °C еще 8-10 ч; затем нагреть до -60 °C в течение 3 часов.
- Замените раствор ФСФ 1 в емкости с предварительно охлажденным ацетоном и выдержите в течение 1 ч. Повторите эту стирку ацетоном 2 раза.
- Прогреть до −30 °C в течение 3 ч. В течение этого периода готовят и предварительно охлаждают 2 мл 0,01% уранилацетата в ацетоне (раствор FSF 2, разбавленный от 10% уранилацетата в метаноле) в центрифужной пробирке объемом 2 мл.
ВНИМАНИЕ: Уранилацетат, используемый в текущем эксперименте, радиоактивен и высокотоксичен; С ним следует обращаться в соответствии с надлежащими процедурами безопасности и утилизировать как опасные химические отходы. - Замените ацетон раствором FSF 2 и инкубируйте при -30 ° C в течение 3 ч.
- Замените раствор FSF 2 в контейнере предварительно охлажденным ацетоном и инкубируйте в течение 30 мин при -30 °C. Повторите эту стирку ацетоном 2 раза.
- Нагревается от −30 °C до 4 °C в течение 2 ч.
- Замените ацетон 2 мл 0,2 М буфера HEPES, содержащего 1 мМ CaCl2и 1 мМ MgCl2при рН 5,5.
- Смените буфер один раз и инкубируйте при комнатной температуре в течение 1 ч или при 4 °C в течение ночи.
ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол может быть приостановлен здесь на одну ночь или продолжаться не менее 6 часов до тех пор, пока образцы снова не будут заморожены на шаге 5.
4. Синтез AuNP на основе ANSM для клеток млекопитающих (рис. 1F)
- Промывайте буфером PBS-A 3 раза в течение 5 минут каждый раз.
- Перенесите сапфировые диски в культуральную чашку диаметром 35 мм, содержащую 1 мл буфера PBS-A при комнатной температуре.
ПРИМЕЧАНИЕ: Всегда держите отмеченные стороны сапфировых дисков лицевой стороной вниз и избегайте перекрытия сапфировых дисков и стирания ячеек. - Приготовьте восстановительный раствор, добавив 4,28 мкл 2-меркаптоэтанола в центрифужную пробирку объемом 2 мл, содержащую 1 мл буфера PBS-A, и хорошо перемешав в вытяжном шкафу.
ВНИМАНИЕ: 2-меркаптоэтанол токсичен и имеет резкий запах; С ним следует обращаться в соответствии с надлежащими процедурами безопасности. - Замените буфер PBS-A в чашке для культивирования 1 мл восстановительного раствора и инкубируйте в течение 1 ч при комнатной температуре.
- Подготовьте прекурсор золота перед использованием.
- Добавьте 80 мкл 10 мМ HAuCl4 in ddH 2 O в центрифужную пробирку объемом2мл, содержащую 1 мл восстановительного раствора, и немедленно встряхните.
ПРИМЕЧАНИЕ: Раствор может помутнеть. - Добавьте 80 мкл 500 мМ D-пеницилламина в ddH2O в вышеуказанный раствор и немедленно встряхните.
ПРИМЕЧАНИЕ: Решение может снова стать ясным.
- Добавьте 80 мкл 10 мМ HAuCl4 in ddH 2 O в центрифужную пробирку объемом2мл, содержащую 1 мл восстановительного раствора, и немедленно встряхните.
- Замените раствор в чашке для культивирования 1 мл раствора предшественника золота, приготовленного на этапе 4,5, и инкубируйте в течение 2 ч при 4 °C.
ПРИМЕЧАНИЕ: Одного миллилитра предшественника золота достаточно для реакции примерно с 1 × 106 клеток (сливающихся на 35-миллиметровой тарелке). Большие объемы прекурсора необходимы, когда AuNP становятся значительно меньше. - Взвесьте 0,0038 г NaBH 4 в центрифужную пробирку объемом 1,5 мл, добавьте 1 мл ледяного ddH2O и перемешайте, чтобы получить свежие 100 мМ NaBH4 непосредственно перед использованием.
- Добавьте 20-100 мкл 100 мМ NaBH 4 в раствор с шага4.6 , немедленно встряхните, чтобы хорошо перемешать, и инкубируйте в течение 5 мин при комнатной температуре.
ПРИМЕЧАНИЕ: Приготовьте 100 мМ NaBH4 для немедленного использования. После добавления NaBH4 цвет раствора постепенно станет красным, а затем станет более глубоким. Если никаких изменений цвета не наблюдается, это в значительной степени указывает на то, что эксперимент провалился. - Замените раствор 2 мл буфера PBS-A, чтобы остановить реакцию.
ПРИМЕЧАНИЕ: Остановка реакции в течение 30 минут имеет решающее значение, так как длительная реакция постепенно разрушает AuNP.
5. Замораживание под высоким давлением и фиксация с заменой замораживания (рис. 1C-F)
ПРИМЕЧАНИЕ: Образцы снова представляют собой HPF и FSF, и процедура почти такая же, как и ранее описанная в разделах 2 и 3, с некоторыми изменениями.
- Готовят 1% тетраоксид осмия и 0,1% уранилацетат в ацетоне (раствор ФСФ 3, разбавленный 4% тетраоксидом осмия в ацетоне и 10% уранилацетата в метаноле).
ВНИМАНИЕ: Тетраоксид осмия и уранилацетат являются высокотоксичными химическими веществами; С ними следует обращаться в соответствии с надлежащими процедурами безопасности и утилизировать как опасные химические отходы. - Загрузите образцы (сапфировые дискодержатели в сборе) в контейнер с замороженным раствором FSF 3 под LN2 с помощью пинцета с предварительным охлаждением.
- Перенесите контейнер в предварительно охлажденную камеру AFS для обработки FSF при -90 °C и запустите программу FSF следующим образом: выдерживайте при -90 °C в течение 8-10 часов; затем нагревают до -60 °C в течение 3 часов; хранить при температуре −60 °C в течение 3 ч; затем нагревают до -30 °C в течение 3 часов; хранить при температуре −30 °C в течение 3 ч; затем нагреть до 4 °C в течение 2 часов.
- Когда температура достигнет 4 °C, перенесите образцы в вытяжной шкаф и поддерживайте при комнатной температуре в течение 15 минут.
- Промывайте ацетоном 3 раза в течение 15 минут каждый раз.
- Выдержать в ацетоне при комнатной температуре не менее 2 ч.
6. Инфильтрация, встраивание и полимеризация смолы
- Перед использованием приготовьте смесь эпоксидной смолы в соответствии с инструкциями производителя.
ВНИМАНИЕ: Эпоксидная смола, используемая в текущем эксперименте, токсична перед полимеризацией; С ним следует обращаться в соответствии с надлежащими процедурами безопасности. Неполимеризованную смолу следует утилизировать как опасные химические отходы или полимеризовать перед утилизацией. - Перенесите сапфировые диски в капсулы для встраивания с плоским дном и пропитайте смолой не менее 30 минут при комнатной температуре.
ПРИМЕЧАНИЕ: Держите маркированные стороны сапфировых дисков лицевой стороной вниз. - Полимеризуйте образец при 60 °C в печи в течение не менее 18 часов.
ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол может быть приостановлен здесь после полимеризации. Полимеризованные блоки образцов могут храниться в сухом контейнере годами.
7. Ультратонкое секционирование
- Аккуратно обрежьте полимеризованные блоки образцов бритвой, чтобы обнажить сапфировые диски.
- Окуните наконечники блоков с сапфировыми дисками в жидкий азот на несколько секунд и разморозьте при комнатной температуре. Повторите действие замораживания-оттаивания несколько раз, чтобы отсоединить диски от блоков.
ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте длительного замораживания, так как это может привести к растрескиванию блоков образца. Аккуратно отсоедините сапфировые диски лезвием, избегая чрезмерного усилия, которое может повредить образцы. - Обрежьте поверхность блока до трапециевидной формы для ультратонкого сечения (рис. 1G).
- Получение ультратонких срезов 70-100 нм с ультрамикротомом (рис. 1H).
- Подбирайте секции на шестиугольных медных сетках размером 200 меш.
ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол может быть приостановлен здесь после секционирования. Срезы на поясах могут храниться в сухой таре годами. При желании срезы на сетках можно окрасить 2% уранилацетоном для получения лучшего мембранного контраста. Следует избегать окрашивания свинцом, так как оно маскирует сигналы частиц нанозолота.
8. ПЭМ-визуализация (рис. 1I)
- Исследуйте ультратонкие срезы на медных сетках с помощью просвечивающего электронного микроскопа. Как правило, диапазон увеличения от 11 кХ до 30 кХ подходит для визуализации AuNP в ячейках, и соответствующее значение расфокусировки необходимо для обеспечения видимости AuNP 2-3 нм.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Метод синтеза AuNP на основе ANSM является чрезвычайно полезным инструментом для маркировки и обнаружения белков, меченных МТ, с помощью TEM26. Чтобы подтвердить его устойчивость в клетках млекопитающих, были сгенерированы три стабильные клеточные линии, экспрессирующие EGFP-MTn-KDEL, Ost4-EGFP-MTn или Mito-acGFP-MTn в клетках Hela. KDEL представляет собой каноническую последовательность удержания/извлечения С-концевого эндоплазматического ретикулума (ER), которая поддерживает слитый белок EGFP-MTn-KDEL в просвете ER или перинуклеарном пространстве ядерной оболочки (NE). Ost4 является субъединицей олигосахарилтрансферазного комплекса, который представляет собой мембранный белковый комплекс, локализованный в ER и NE, который катализирует N-гликозилирование зарождающихся полипептидов. С-конец слитого белка Ost4 Ost4-EGFP-MTn обращен к цитозолю. Mito представляет собой митохондриальную целевую последовательность, которая нацелена на слитый белок Mito-acGFP-MTn в митохондриальном матриксе.
Пробоподготовка HPF/FSF в сочетании с использованием дубильной кислоты и уранилацетата вместо альдегидных фиксаторов сохранила превосходную ультраструктуру с хорошим мембранным контрастом (рис. 2, рис. 3 и рис. 4). Общая структура образца была плотной, без явной цитоплазмы и экстракции липидов. Структура мембраны была гладкой, без явной деформации, и была отчетливо выявлена структура фосфолипидного бислоя.
В дополнение к хорошо сохранившейся ультраструктуре, во всех трех случаях наблюдалась эффективная маркировка, представляющая различную специфичность органелл. Белок EGFP-MTn-KDEL появился в виде наночастиц золота размером 2-5 нм, распределенных исключительно в периферическом просвете ER и в перинуклеарном пространстве NE (рис. 2A-C). Хорошо сохранившаяся ультраструктура не только позволила идентифицировать меченые белки по одной молекуле, но и облегчила анализ взаимодействий органелл, таких как взаимодействия ER-митохондрий (рис. 2D, E). Наночастицы белка Ost4-EGFP-MTn очерчивали мембрану ER (рис. 3A-D) и внешнюю мембрану NE (рис. 3E). Наночастицы также были распределены на внутренней мембране НЭ, но количество наночастиц там было ниже, чем на внешней мембране, что указывает на то, что белковый состав внутренней и внешней мембран был разным (рис. 3Е). Аналогичным образом, клетки, экспрессирующие Mito-acGFP-MTn, проявляли специфическую маркировку в митохондриальном матриксе (рис. 4A-E). Никаких частиц не наблюдалось в везикулах или ER (рис. 4A-D), и несколько частиц были показаны в MVB (рис. 4D).
Рисунок 1: Схема рабочего процесса технологии маркировки клонируемой электронной микроскопии . (A) Сапфировые диски маркируют и стерилизуют для культивирования клеток. (B) Клетки выращивают на сапфировых дисках в чашке для культивирования диаметром 35 мм. (C) Сапфировые диски с ячейками закрыты алюминиевыми носителями глубиной 0,025 мм для замораживания под высоким давлением, а дополнительное пространство заполнено 1-гексадеценом. (D) Клетки криофиксируются с помощью HPF. е) фиксация с заменой замораживания. (F) Схематические этапы синтеза AuNP на основе ANSM. (G) Сапфировые диски с ячейками встроены в плоскодонные встраиваемые капсулы. Полимерные блоки обрезаются для ультратонкого секционирования. (H) Обрезанные смоляные блоки разделены ультрамикротомом. (I) Ультратонкие срезы визуализируются с помощью ПЭМ. Сокращения: ANSM = механизм подавления аутонуклеации; AuNP = наночастица золота; HPF = замораживание под высоким давлением; FSF = фиксация замораживанием-заменой; ПЭМ = просвечивающая электронная микроскопия. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Синтез AuNP на основе ANSM на EGFP-MTn-KDEL, экспрессируемый в клетках HeLa. (A,D) ЭМ-изображения среза клеток HeLa толщиной 90 нм, экспрессирующих EGFP-MTn-KDEL, показывают, что AuNP специфически накапливаются в просвете эндоплазматического ретикулума и в перинуклеарном пространстве ядерной оболочки. В митохондриях, лизосомах, ядре или цитозоле наблюдается мало частиц. (В,В) Увеличенные изображения красной и желтой областей прямоугольника соответственно в (A). (E) Увеличенное изображение зеленой области прямоугольника в (D). Эта цифра была изменена по сравнению с Jiang et al.26. Масштабные линейки = (B,C,E) 200 нм; (A,D) 500 нм. Сокращения: ANSM = механизм подавления аутонуклеации; AuNP = наночастица золота; EGFP = улучшенный зеленый флуоресцентный белок; ER = эндоплазматический ретикулум; NE = ядерная оболочка; M = митохондрии; Лизо = лизосома; N = ядро. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Синтез AuNP на основе ANSM на Ost4-EGFP-MTn, экспрессируемом в клетках HeLa. (A-D) ЭМ-изображения среза клеток HeLa толщиной 90 нм, экспрессирующих Ost4-EGFP-MTn, показывают, что AuNP специфически накапливаются на мембране эндоплазматического ретикулума. (E) ЭМ-изображение среза клеток HeLa толщиной 90 нм, экспрессирующих Ost4-EGFP-MTn, показывает AuNP, специфически накопленные на мембране NE (ядерной оболочки). В митохондриях, лизосомах, ядре или цитозоле наблюдается мало частиц. (C) Увеличенное изображение области красного прямоугольника в (A). Эта цифра была изменена по сравнению с Jiang et al.26. Масштабные линейки = (B-E) 200 нм; (А) 500 нм. Сокращения: ANSM = механизм подавления аутонуклеации; AuNP = наночастица золота; EGFP = улучшенный зеленый флуоресцентный белок; ER = эндоплазматический ретикулум; NE = ядерная оболочка; M = митохондрии; Лизо = лизосома; N = ядро; ЭМ = электронная микроскопия. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Синтез AuNP на основе ANSM на Mito-acGFP-MTn, экспрессируемый в клетках HeLa. (A, D, E) ЭМ-изображения среза клеток HeLa толщиной 90 нм, экспрессирующих Mito-acGFP-MTn, показывают, что AuNP специфически накапливаются в матриксе митохондрий (М). В эндоплазматическом ретикулуме, ядре, везикуле, мультивезикулярном теле или цитозоле наблюдается мало частиц. (В,В) Увеличенное изображение красной и желтой областей прямоугольника соответственно в (A). Эта цифра была изменена по сравнению с Jiang et al.26. Масштабные линейки = (D,E) 200 нм; (B,C) 500 нм; (А) 1 мкм. Сокращения: ANSM = механизм подавления аутонуклеации; AuNP = наночастица золота; EGFP = улучшенный зеленый флуоресцентный белок; ER = эндоплазматический ретикулум; NE = ядерная оболочка; M = митохондрии; Лизо = лизосома; N = ядро; V = везикула; MVB = мультивезикулярное тело. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В исследовании представлена надежная клонируемая технология электромагнитной маркировки для визуализации одномолекулярных белковых молекул в клеточной среде с ультраструктурным разрешением. AuNP, непосредственно синтезированные на генетически кодируемых метках, богатых цистеином, обеспечивают однозначную и точную локализацию белков-мишеней. Метод замораживания под высоким давлением и замораживания-замещения превосходно сохраняет ультраструктуру биологических образцов. Взятые вместе, технология маркировки клонируемой электронной микроскопии, представленная здесь, обеспечивает мощный инструмент для эффективной локализации и распознавания одной молекулы в клеточных ультраструктурных контекстах in situ с ЭМ.
Механизм ANSM подавляет процесс аутонуклеации тиолат-Au(I) полимеров26, что является типичной реакцией в классическом методе Бруста-Шиффрина (BSM)27 , который широко используется для синтеза тиолат-колпачковых нанокластеров золота. Таким образом, метод синтеза AuNP на основе ANSM может специфически синтезировать AuNP размером 2-6 нм непосредственно на метках, богатых цистеином, в качестве электронно-плотных меток для ЭМ-визуализации с высоким отношением сигнал/шум и высокой эффективностью. В отличие от методов маркировки APEX2 или HPR, основанных на осаждении полимера DAB, которое неисчислимо и не подходит для растворимых белков в цитозоле, метод синтеза AuNP на основе ANSM является единственным методом, который позволяет обнаруживать одну молекулу до сих пор.
Недостатком технологии маркировки клонируемой электронной микроскопии является то, что метод синтеза AuNP на основе ANSM основан на активности тиоловой группы цистеина, которая чувствительна к альдегидным фиксаторам. Окислительная защита тиолов 3,3'-дитиодипропионовой кислотой (DTDPA) была введена до фиксации альдегида в E. coli и делящихся дрожжах S. pombe, что привело к хорошей морфологии и отличной эффективности мечения24,25,26. В этой работе метод окисления/фиксации работал должным образом для тех меток, которые экспрессируются в относительно окислительном компартменте, таких как просвет ER и матрикс митохондрий (в клетках EGFP-MTn-KDEL и Mito-acGFP-MTn). Однако он был неоптимальным для цитозольных меток (Ost4-GFP-MTn) в клетках млекопитающих. Причина может заключаться в том, что метки в восстановительных компартментах плохо сложены, и восстанавливающие вещества, такие как GSH, которые в изобилии присутствуют в цитоплазме, могут противостоять окислению.
Метод HPF-FSF является золотым стандартом в ультраструктурной консервации биологических образцов для электронной микроскопии. В этой работе метод HPF/FSF-регидратации-HPF/FSF, который полностью исключает традиционную химическую фиксацию и пермеабилизацию, позволил добиться эффективного мечения Ost4-GFP-MTn и дал превосходную структуру клеток. Однако этот метод все же имеет определенные ограничения. Во-первых, второй HPF может привести к значительному повреждению кристаллов льда. Во-вторых, различные партии уранилацетата имеют проблемы с непостоянным качеством и растворимостью. Игольчатые осадки иногда появлялись в регидратированных образцах при визуализации с помощью электронной микроскопии. Промывка буфером HEPES при pH 5,5 может облегчить эту проблему. В-третьих, пробоподготовка образцов тканей нуждается в дальнейшей оптимизации.
В заключение, технология клонируемой ЭМ-маркировки, сочетающая метод синтеза AuNP на основе ANSM с методом пробоподготовки HPF/FSF-регидратации-HPF/FSF, позволяет однозначно идентифицировать одномолекулярные генетически меченные белки в клетках с помощью электронной микроскопии. Нынешний протокол должен позволить решить огромный круг биологических вопросов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Автор заявляет об отсутствии конфликта интересов.
Acknowledgments
Описанный здесь протокол был взят из статьи, опубликованной Jiang et al. (2020). Эта работа была поддержана грантами MOST (973 программы No 2011CB812502 и 2014CB849902) и финансовой поддержкой муниципального правительства Пекина.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.025 mm/0.275 mm Aluminum carrier | Beijing Wulundes Biotech Ltd., or Engineering Office of M. Wohlwend | ||
| 0.2 M HEPES buffer | Dissolve HEPES (0.2 M) in 980 mL of ddH2O, then add 10 mL of 100 mM MgCl2 and 10 mL of 100 mM CaCl2 (final concentration 1 mM), respectively, adjust pH to 5.5 | ||
| 1.5 mL MaxyClear snaplock microtube | Axygen Scientific | MCT150C | |
| 2 mL polypropylene screw cap microtubes | Biologix | 81-0204 | |
| 200 mesh hexagonal copper grid | Tedpella inc | G200HEX | |
| 2-mercaptoethanol | Amresco | 0482-250ML | |
| 35 mm cell culture dishes | Corning | 430165 | |
| 50 mL polypropylene centrifuge tubes | Corning | 430928 | |
| Acetone | Beiijng Tong Guang Fine Chemicals Company | 31025 | |
| Automated freeze substitution machine | Leica | AFS2 | |
| Customized 3.05 mm x 0.66 mm specimen holders for HPF | Beijing Wulundes Biotech Ltd. | ||
| D-penicillamine | TCI | P0147 | |
| Dulbecco’s modified Eagle medium | GBICO | C11965500BT | |
| Fetal bovine serum | GBICO | 10099-141C | |
| Flat bottom embedding capsule | Tedpella inc | ||
| Foam cryobox | |||
| Formvar 15/95 resin | Electron Microscopy Sciences | 15800 | |
| HAuCl4 | Sigma | 4022-1G | |
| HEPES | sigma | H3375-500G | |
| HPF machine | Wohlwend | HPF compact01 | |
| Methonal | Beiijng Tong Guang Fine Chemicals Company | 12397 | |
| NaBH4 | Sigma | 480886-25G | |
| OsO4 | Electron Microscopy Sciences | 19110 | |
| PBS-A buffer | Dissolve NaH2PO4 (1.125 mM), Na2HPO4 (3.867 mM), NaCl (100 mM) in 1 L of ddH2O, adjust to pH 7.4 | ||
| Qualitative filter paper (medium speed) | Beyotime Biotechnology | FFT08 | |
| Sapphire discs | Beijing Wulundes Biotech Ltd., or Engineering Office of M. Wohlwend | ||
| Solvent resistant pen | Electron Microscopy Sciences | 62053-B | |
| SPI-Pon 812 resin | SPI Inc | 02659-AB | |
| Transmission electron microscopy | FEI | Tecnai G2 spirit | |
| Trypsin-EDTA | GBICO | C25200-056 | |
| Tweezers | Dumont | ||
| Ultramictotome | Leica | FC7 | |
| Uranyl acetate | Electron Microscopy Sciences | 22400 |
References
- Tsien, R. Y.
- Shaner, N. C., Patterson, G. H., Davidson, M. W.
- Masters, B. R. History of the electron microscope in cell biology. Encylopedia of Life Sciences. , (2009).
- Griffiths, G., Hoppeler, H. Quantitation in immunocytochemistry: Correlation of immunogold labeling to absolute number of membrane antigens. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 34 (11), 1389-1398 (1986).
- Tokuyasu, K. T. A technique for ultracryotomy of cell suspensions and tissues. Journal of Cell Biology. 57 (2), 551-565 (1973).
- Connolly, C. N., Futter, C. E., Gibson, A., Hopkins, C. R., Cutler, D. F. Transport into and out of the Golgi complex studied by transfecting cells with cDNAs encoding horseradish peroxidase. Journal of Cell Biology. 127 (3), 641-652 (1994).
- Grabenbauer, M., et al. Correlative microscopy and electron tomography of GFP through photooxidation. Nature Methods. 2 (11), 857-862 (2005).
- Gaietta, G., et al. Multicolor and electron microscopic imaging of connexin trafficking. Science. 296 (5567), 503-507 (2002).
- Shu, X., et al. A genetically encoded tag for correlated light and electron microscopy of intact cells, tissues, and organisms. PLoS Biology. 9 (4), e1001041 (2011).
- Martell, J. D., et al. Engineered ascorbate peroxidase as a genetically encoded reporter for electron microscopy. Nature Biotechnology. 30 (11), 1143-1148 (2012).
- Lam, S. S., et al. Directed evolution of APEX2 for electron microscopy and proximity labeling. Nature Methods. 12 (1), 51-54 (2015).
- Mavlyutov, T. A., et al. APEX2-enhanced electron microscopy distinguishes sigma-1 receptor localization in the nucleoplasmic reticulum. Oncotarget. 8 (31), 51317-51330 (2017).
- Wang, Q., Mercogliano, C. P., Lowe, J. A ferritin-based label for cellular electron cryotomography. Structure. 19 (2), 147-154 (2011).
- Sano, T., Glazer, A. N., Cantor, C. R. A streptavidin-metallothionein chimera that allows specific labeling of biological materials with many different heavy metal ions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 89 (5), 1534-1538 (1992).
- Mercogliano, C. P., DeRosier, D. J. Gold nanocluster formation using metallothionein: Mass spectrometry and electron microscopy. Journal of Molecular Biology. 355 (2), 211-223 (2006).
- Mercogliano, C. P., DeRosier, D. J. Concatenated metallothionein as a clonable gold label for electron microscopy. Journal of Structural Biology. 160 (1), 70-82 (2007).
- Morphew, M. K., et al. Metallothionein as a clonable tag for protein localization by electron microscopy of cells. Journal of Microscopy. 260 (1), 20-29 (2015).
- Nishino, Y., Yasunaga, T., Miyazawa, A. A genetically encoded metallothionein tag enabling efficient protein detection by electron microscopy. Journal of Electron Microscopy. 56 (3), 93-101 (2007).
- Bouchet-Marquis, C., Pagratis, M., Kirmse, R., Hoenger, A. Metallothionein as a clonable high-density marker for cryo-electron microscopy. Journal of Structural Biology. 177 (1), 119-127 (2012).
- Fukunaga, Y., et al. Electron microscopic analysis of a fusion protein of postsynaptic density-95 and metallothionein in cultured hippocampal neurons. Journal of Electron Microscopy. 56 (4), 119-129 (2007).
- Diestra, E., Fontana, J., Guichard, P., Marco, S., Risco, C. Visualization of proteins in intact cells with a clonable tag for electron microscopy. Journal of Structural Biology. 165 (3), 157-168 (2009).
- Risco, C., et al. sensitive, high-resolution detection of protein molecules in eukaryotic cells using metal-tagging transmission electron microscopy. Structure. 20 (5), 759-766 (2012).
- Ding, S. -W., et al. Noncanonical role for the host Vps4 AAA+ ATPase ESCRT protein in the formation of tomato bushy stunt virus replicase. PLoS Pathogens. 10 (4), e1004087 (2014).
- Jiang, Z., et al. Direct synthesis of gold nanoparticles on cysteine-rich tags in yeast cells. Protocol Exchange. , (2020).
- Jiang, Z., et al. Direct synthesis of gold nanoparticles on cysteine-rich tags in mammalian cells. Protocol Exchange. , (2020).
- Jiang, Z., et al. Genetically encoded tags for direct synthesis of EM-visible gold nanoparticles in cells. Nature Methods. 17 (9), 937-946 (2020).
- Brust, M., Walker, M., Bethell, D., Schiffrin, D. J., Whyman, R. Synthesis of thiol-derivatised gold nanoparticles in a two-phase liquid-liquid system. Journal of the Chemical Society, Chemical Communications. 7, 801-802 (1994).
