Прямой синтез ЭМ-видимых наночастиц золота в клетках для анализа локализации белка с хорошо сохранившейся ультраструктурой
Summary
Настоящий протокол описывает технологию маркировки клонируемой электронной микроскопией для обнаружения белков, меченных металлотионеином, в клетках с использованием нового метода синтеза наночастиц золота, основанного на механизме подавления аутонуклеации.
Abstract
Анализ точной локализации белковых молекул в клетках с ультраструктурным разрешением имеет большое значение для изучения различных физиологических или патологических процессов во всех живых организмах. Таким образом, разработка клонируемых меток, которые можно использовать в качестве зондов электронной микроскопии, имеет большое значение, так же как флуоресцентные белки сыграли решающую роль в области оптической визуализации. Недавно был обнаружен механизм подавления аутонуклеации (ANSM), который позволяет осуществлять специфический синтез наночастиц золота (AuNP) на богатых цистеином метках, таких как металлотионеин (МТ) и антифризный белок (АФП).
На основе ANSM была разработана технология электронной микроскопии маркировки, которая позволяет специфически обнаруживать меченые белки в прокариотических и эукариотических клетках с беспрецедентной эффективностью мечения. Это исследование иллюстрирует протокол обнаружения слитых белков MTn (модифицированный вариант MT, в котором отсутствуют альдегид-реакционноспособные остатки) в клетках млекопитающих с хорошо сохранившейся ультраструктурой. В этом протоколе замораживание под высоким давлением и фиксация замораживанием выполнялись с использованием неальдегидных фиксаторов (таких как дубильная кислота, уранилацетат) для сохранения почти нативной ультраструктуры и предотвращения повреждения активности метки, вызванного альдегидным сшиванием.
Простая одностадийная регидратация использовалась до синтеза AuNP на основе ANSM. Результаты показали, что меченые белки нацелены на различные органеллы, включая мембраны и просвет эндоплазматического ретикулума (ER), а митохондриальные матрицы были обнаружены с высокой эффективностью и специфичностью. Это исследование предоставляет биологам надежный протокол для решения огромного круга биологических вопросов на уровне одной молекулы в клеточном ультраструктурном контексте.
Introduction
В постгеномную эпоху разработка зеленого флуоресцентного белка (GFP) в качестве одномолекулярного репортера для световой микроскопии произвела революцию в области современных исследований в области наук о жизни 1,2. На протяжении десятилетий электронная микроскопия (ЭМ) была мощным инструментом для интуитивного наблюдения за клеточной ультраструктурой с наноразмерным разрешением3; Однако точная идентификация и локализация белковых молекул остаются сложной задачей.
Наиболее часто используемым методом ЭМ-мечения является метод маркировки иммуноэлектронной микроскопии (IEM), который основан на реакции антиген-антитело. Однако, несмотря на то, что в области маркировки ИЭМ было разработано множество методов, включая предварительную и поствстраиваемую ИЭМ (на срезах смолы или гидратированных криосекциях), она по-прежнему страдает от низкой эффективности маркировки (<10%)4,5, что связано с подготовкой образцов и качеством антител. Чтобы преодолеть эти ограничения, разработка генетически закодированных меток имеет большой потенциал применения.
В последние годы были тщательно изучены два основных типа электромагнитных меток. Одним из типов является метод окрашивания DAB, в котором используются такие метки, как APEX2, для окисления 3,3′-диаминобензидина (DAB) до осмофильных полимеров для ЭМ-визуализации 6,7,8,9,10,11,12. Он позволяет маркировать белки с высоким содержанием в субклеточных областях, но не подходит для подсчета отдельных молекул. Другой тип использует металлсвязывающие белки, такие как ферритин 13 и металлотионеин (MT) 14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26, для образования электронно-плотных металлических отложений в situ для ЭМ-визуализации. Только последний обладает реальным потенциалом для визуализации и подсчета одномолекул. Молекулярный размер ферритина слишком велик (~ 450 кДа), чтобы его можно было использовать в качестве перспективной метки, в то время как маленький размер (~ 5 кДа) МТ и его способность связывать различные ионы через свои 20 цистеинов привлекли большое внимание. Несколько лабораторий пытались маркировать очищенные белки слияния МТ или клетки, экспрессирующие МТ, путем инкубации непосредственно с Au +. Эти попытки первоначально доказали, что метки МТ могут связывать ионы золота с образованием высококонтрастных сигналов, но ни одна из них не достигла эффективной идентификации отдельных белков в клетках, и они не являются широко применимыми 14,15,16,17,18,19,20,21,22,23.
Метод синтеза AuNP на основе ANSM, который включает синтез AuNP размером 2-6 нм непосредственно на метках, богатых цистеином (например, MT, варианты MT MTn и MTα, AFP) в качестве электронно-плотных меток для ЭМ-визуализации, является первым надежным и применимым подходом к маркировке белков и обнаружению отдельных молекул в клетках24,25,26. Он позволяет осуществлять специфический синтез AuNP на изолированных белках слияния меток и достиг беспрецедентной эффективности маркировки в нефиксированных или химически фиксированных прокариотических (E. coli) и эукариотических (S. pombe) клетках. Однако реализация того же протокола в более продвинутых системах, таких как клетки млекопитающих или даже ткани, сопряжена с дополнительными проблемами, такими как более сложный внутриклеточный окислительно-восстановительный гомеостаз и более хрупкая клеточная структура.
В этом исследовании представлена клонируемая технология ЭМ-мечения, которая сочетает в себе новый метод синтеза AuNP на основе ANSM для маркировки генетически кодируемых цистеин-богатых меток (MT) с методом пробоподготовки HPF/FSF-регидратации-HPF/FSF, что позволяет однозначно идентифицировать меченые белки по одной молекуле в мембране ER, просвете ER и митохондриальном матриксе в клетках HeLa. Современный метод сочетает в себе такие характеристики, как высокая эффективность мечения, высокое отношение сигнал/шум, одномолекулярная маркировка и сильная универсальность, и этот метод имеет широкие перспективы применения в исследованиях в области наук о жизни.
Protocol
Representative Results
Discussion
В исследовании представлена надежная клонируемая технология электромагнитной маркировки для визуализации одномолекулярных белковых молекул в клеточной среде с ультраструктурным разрешением. AuNP, непосредственно синтезированные на генетически кодируемых метках, богатых цистеином, …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Описанный здесь протокол был взят из статьи, опубликованной Jiang et al. (2020). Эта работа была поддержана грантами MOST (973 программы No 2011CB812502 и 2014CB849902) и финансовой поддержкой муниципального правительства Пекина.
Materials
| 0.025 mm/0.275 mm Aluminum carrier | Beijing Wulundes Biotech Ltd., or Engineering Office of M. Wohlwend | ||
| 0.2 M HEPES buffer | Dissolve HEPES (0.2 M) in 980 mL of ddH2O, then add 10 mL of 100 mM MgCl2 and 10 mL of 100 mM CaCl2 (final concentration 1 mM), respectively, adjust pH to 5.5 | ||
| 1.5 mL MaxyClear snaplock microtube | Axygen Scientific | MCT150C | |
| 2 mL polypropylene screw cap microtubes | Biologix | 81-0204 | |
| 200 mesh hexagonal copper grid | Tedpella inc | G200HEX | |
| 2-mercaptoethanol | Amresco | 0482-250ML | |
| 35 mm cell culture dishes | Corning | 430165 | |
| 50 mL polypropylene centrifuge tubes | Corning | 430928 | |
| Acetone | Beiijng Tong Guang Fine Chemicals Company | 31025 | |
| Automated freeze substitution machine | Leica | AFS2 | |
| Customized 3.05 mm x 0.66 mm specimen holders for HPF | Beijing Wulundes Biotech Ltd. | ||
| D-penicillamine | TCI | P0147 | |
| Dulbecco’s modified Eagle medium | GBICO | C11965500BT | |
| Fetal bovine serum | GBICO | 10099-141C | |
| Flat bottom embedding capsule | Tedpella inc | ||
| Foam cryobox | |||
| Formvar 15/95 resin | Electron Microscopy Sciences | 15800 | |
| HAuCl4 | Sigma | 4022-1G | |
| HEPES | sigma | H3375-500G | |
| HPF machine | Wohlwend | HPF compact01 | |
| Methonal | Beiijng Tong Guang Fine Chemicals Company | 12397 | |
| NaBH4 | Sigma | 480886-25G | |
| OsO4 | Electron Microscopy Sciences | 19110 | |
| PBS-A buffer | Dissolve NaH2PO4 (1.125 mM), Na2HPO4 (3.867 mM), NaCl (100 mM) in 1 L of ddH2O, adjust to pH 7.4 | ||
| Qualitative filter paper (medium speed) | Beyotime Biotechnology | FFT08 | |
| Sapphire discs | Beijing Wulundes Biotech Ltd., or Engineering Office of M. Wohlwend | ||
| Solvent resistant pen | Electron Microscopy Sciences | 62053-B | |
| SPI-Pon 812 resin | SPI Inc | 02659-AB | |
| Transmission electron microscopy | FEI | Tecnai G2 spirit | |
| Trypsin-EDTA | GBICO | C25200-056 | |
| Tweezers | Dumont | ||
| Ultramictotome | Leica | FC7 | |
| Uranyl acetate | Electron Microscopy Sciences | 22400 |
References
- Tsien, R. Y. The green fluorescent protein. Annual Review of Biochemistry. 67, 509-544 (1998).
- Shaner, N. C., Patterson, G. H., Davidson, M. W. Advances in fluorescent protein technology. Journal of Cell Science. 120, 4247-4260 (2007).
- Masters, B. R. History of the electron microscope in cell biology. Encylopedia of Life Sciences. , (2009).
- Griffiths, G., Hoppeler, H. Quantitation in immunocytochemistry: Correlation of immunogold labeling to absolute number of membrane antigens. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 34 (11), 1389-1398 (1986).
- Tokuyasu, K. T. A technique for ultracryotomy of cell suspensions and tissues. Journal of Cell Biology. 57 (2), 551-565 (1973).
- Connolly, C. N., Futter, C. E., Gibson, A., Hopkins, C. R., Cutler, D. F. Transport into and out of the Golgi complex studied by transfecting cells with cDNAs encoding horseradish peroxidase. Journal of Cell Biology. 127 (3), 641-652 (1994).
- Grabenbauer, M., et al. Correlative microscopy and electron tomography of GFP through photooxidation. Nature Methods. 2 (11), 857-862 (2005).
- Gaietta, G., et al. Multicolor and electron microscopic imaging of connexin trafficking. Science. 296 (5567), 503-507 (2002).
- Shu, X., et al. A genetically encoded tag for correlated light and electron microscopy of intact cells, tissues, and organisms. PLoS Biology. 9 (4), e1001041 (2011).
- Martell, J. D., et al. Engineered ascorbate peroxidase as a genetically encoded reporter for electron microscopy. Nature Biotechnology. 30 (11), 1143-1148 (2012).
- Lam, S. S., et al. Directed evolution of APEX2 for electron microscopy and proximity labeling. Nature Methods. 12 (1), 51-54 (2015).
- Mavlyutov, T. A., et al. APEX2-enhanced electron microscopy distinguishes sigma-1 receptor localization in the nucleoplasmic reticulum. Oncotarget. 8 (31), 51317-51330 (2017).
- Wang, Q., Mercogliano, C. P., Lowe, J. A ferritin-based label for cellular electron cryotomography. Structure. 19 (2), 147-154 (2011).
- Sano, T., Glazer, A. N., Cantor, C. R. A streptavidin-metallothionein chimera that allows specific labeling of biological materials with many different heavy metal ions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 89 (5), 1534-1538 (1992).
- Mercogliano, C. P., DeRosier, D. J. Gold nanocluster formation using metallothionein: Mass spectrometry and electron microscopy. Journal of Molecular Biology. 355 (2), 211-223 (2006).
- Mercogliano, C. P., DeRosier, D. J. Concatenated metallothionein as a clonable gold label for electron microscopy. Journal of Structural Biology. 160 (1), 70-82 (2007).
- Morphew, M. K., et al. Metallothionein as a clonable tag for protein localization by electron microscopy of cells. Journal of Microscopy. 260 (1), 20-29 (2015).
- Nishino, Y., Yasunaga, T., Miyazawa, A. A genetically encoded metallothionein tag enabling efficient protein detection by electron microscopy. Journal of Electron Microscopy. 56 (3), 93-101 (2007).
- Bouchet-Marquis, C., Pagratis, M., Kirmse, R., Hoenger, A. Metallothionein as a clonable high-density marker for cryo-electron microscopy. Journal of Structural Biology. 177 (1), 119-127 (2012).
- Fukunaga, Y., et al. Electron microscopic analysis of a fusion protein of postsynaptic density-95 and metallothionein in cultured hippocampal neurons. Journal of Electron Microscopy. 56 (4), 119-129 (2007).
- Diestra, E., Fontana, J., Guichard, P., Marco, S., Risco, C. Visualization of proteins in intact cells with a clonable tag for electron microscopy. Journal of Structural Biology. 165 (3), 157-168 (2009).
- Risco, C., et al. sensitive, high-resolution detection of protein molecules in eukaryotic cells using metal-tagging transmission electron microscopy. Structure. 20 (5), 759-766 (2012).
- Ding, S. -. W., et al. Noncanonical role for the host Vps4 AAA+ ATPase ESCRT protein in the formation of tomato bushy stunt virus replicase. PLoS Pathogens. 10 (4), e1004087 (2014).
- Jiang, Z., et al. Direct synthesis of gold nanoparticles on cysteine-rich tags in yeast cells. Protocol Exchange. , (2020).
- Jiang, Z., et al. Direct synthesis of gold nanoparticles on cysteine-rich tags in mammalian cells. Protocol Exchange. , (2020).
- Jiang, Z., et al. Genetically encoded tags for direct synthesis of EM-visible gold nanoparticles in cells. Nature Methods. 17 (9), 937-946 (2020).
- Brust, M., Walker, M., Bethell, D., Schiffrin, D. J., Whyman, R. Synthesis of thiol-derivatised gold nanoparticles in a two-phase liquid-liquid system. Journal of the Chemical Society, Chemical Communications. 7, 801-802 (1994).
