O presente protocolo descreve uma tecnologia de marcação por microscopia eletrônica clonável para detecção de proteínas marcadas com metalotioneína em células usando uma nova técnica de síntese de nanopartículas de ouro baseada em mecanismo de supressão de autonucleação.
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Artigo de método
Síntese Direta de Nanopartículas de Ouro EM-Visíveis em Células para Análise de Localização de Proteínas com Ultraestrutura Bem Preservada
Neste artigo
Resumo
Resumo
Analisar a localização precisa de moléculas de proteínas em células com resolução ultraestrutural é de grande importância para o estudo de vários processos fisiológicos ou patológicos em todos os organismos vivos. Portanto, o desenvolvimento de tags clonáveis que podem ser usados como sondas de microscopia eletrônica é de grande valor, assim como proteínas fluorescentes têm desempenhado um papel crucial no campo da imagem óptica. O mecanismo de supressão da autonucleação (ANSM) foi recentemente descoberto, o que permite a síntese específica de nanopartículas de ouro (AuNPs) em etiquetas ricas em cisteína, como metalotioneína (MT) e proteína anticongelante (AFP).
Com base no ANSM, foi desenvolvida uma tecnologia de marcação por microscopia eletrônica que permite a detecção específica de proteínas marcadas em células procarióticas e eucarióticas com uma eficiência de marcação sem precedentes. Este estudo ilustra um protocolo para a detecção de proteínas de fusão de MTn (uma variante modificada de MT sem resíduos reativos a aldeídos) em células de mamíferos com ultraestrutura bem preservada. Neste protocolo, o congelamento a alta pressão e a fixação por substituição do congelamento foram realizados com fixadores não aldeídos (como ácido tânico, acetato de uranila) para preservar a ultraestrutura quase nativa e evitar danos à atividade do tag causados pela reticulação de aldeídos.
Uma reidratação simples em um passo foi usada antes da síntese de AuNP baseada em ANSM. Os resultados mostraram que as proteínas marcadas tiveram como alvo várias organelas, incluindo as membranas e o lúmen do retículo endoplasmático (RE), e matrizes mitocondriais foram detectadas com alta eficiência e especificidade. Esta pesquisa fornece aos biólogos um protocolo robusto para abordar uma enorme gama de questões biológicas no nível de molécula única em contextos ultraestruturais celulares.
Introdução
Na era pós-genômica, o desenvolvimento da proteína fluorescente verde (GFP) como repórter de molécula única para microscopia de luz revolucionou o campo da pesquisa moderna em ciências da vida 1,2. Por décadas, a microscopia eletrônica (ME) tem sido uma poderosa ferramenta para observar intuitivamente a ultraestrutura celular com resolução nanométrica3; no entanto, a identificação precisa e a localização de moléculas proteicas permanecem desafiadoras.
A técnica de marcação EM mais comumente usada é a imunomicroscopia eletrônica (EIM), que é baseada na reação ....
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Protocolo
Todos os insumos utilizados neste experimento estão listados na Tabela de Materiais. O fluxo de trabalho passo a passo do protocolo atual é mostrado na Figura 1.
1. Cultura celular em discos de safira
- Transfira discos de safira de 3 mm x 0,16 mm para um tubo de centrífuga de 2 mL contendo 1 mL de etanol e sonicate em um limpador ultrassônico por 10 min.
- Queime cada disco de safira em uma chama de lâmpada de álcool até que não haja depósitos visíveis na superfície.
NOTA: Através do método acima, os discos de safira podem ser reciclados muitas vezes.
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Resultados
A técnica de síntese de AuNP baseada em ANSM é uma ferramenta extremamente útil para marcar e detectar proteínas marcadas com MT com TEM26. Para validar sua robustez em células de mamíferos, três linhagens celulares estáveis expressando EGFP-MTn-KDEL, Ost4-EGFP-MTn ou Mito-acGFP-MTn em células Hela foram geradas. KDEL é uma sequência canônica de retenção/recuperação do retículo endoplasmático C-terminal (RE), que mantém a proteína de fusão EGFP-MTn-KDEL dentro do lúmen do RE ou do espaço perinucle.......
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Discussão
O estudo apresenta aqui uma robusta tecnologia de marcação EM clonável para a visualização de moléculas de proteína em molécula única dentro do ambiente celular com resolução ultraestrutural. As AuNPs sintetizadas diretamente em etiquetas ricas em cisteína codificadas geneticamente fornecem localização inequívoca e precisa das proteínas-alvo. A técnica de congelamento a alta pressão e substituição por congelamento preserva de forma excelente a ultraestrutura das amostras biológicas. Em conjunto, a tecnologia de marcação .......
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Divulgações
O autor declara não haver conflitos de interesse.
Agradecimentos
O protocolo aqui descrito foi derivado do artigo publicado por Jiang et al (2020). Este trabalho foi apoiado por subsídios do MOST (973 Programas nos. 2011CB812502 e 2014CB849902) e pelo apoio financeiro do Governo Municipal de Pequim.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| 0,025 mm/0,275 mm Transportador de alumínio | Beijing Wulundes Biotech Ltd., ou Escritório de Engenharia de M. Wohlwend | ||
| 0,2 M Buffer | Dissolva HEPES (0,2 M) em 980 mL de ddH2O, em seguida, adicione 10 mL de 100 mM MgCl2 e 10 mL de 100 mM CaCl2 (concentração final 1 mM), respectivamente, ajuste o pH para 5,5 | ||
| 1,5 mL MaxyClear microtubo snaplock | Axygen Scientific | MCT150C | |
| 2 mL polipropileno tampa de rosca microtubos | Biologix | 81-0204 | |
| 200 mesh hexagonal grade de cobre | Tedpella inc | G200HEX | |
| 2-mercaptoetanol | Amresco | 0482-250ML | |
| 35 mm placas de cultura de células | Corning | ||
| tubos de centrífuga de polipropileno de 50 mL Corning | 430928 | ||
| acetona | Beiijng Tong Guang Fine Chemicals Company | 31025 | |
| Máquina automatizada de substituição de congelamento | Leica | AFS2 | |
| Suportes de amostra personalizados de 3,05 mm x 0,66 mm para HPF | Beijing Wulundes Biotech Ltd. | ||
| D-penicilamina | TCI | P0147 | |
| Dulbecco' s modificado Eagle medium | GBICO | C11965500BT | |
| bovino | GBICO | 10099-141C | |
| Cápsula de incorporação de fundo plano | Tedpella inc | ||
| Espuma cryobox | |||
| Formvar 15/95 resina | Microscopia eletrônica Ciências | 15800 | |
| HAuCl4 | Sigma | 4022-1G | |
| HEPES | sigma | H3375-500G | |
| HPF máquina | Wohlwend | HPF compact01 | |
| Methonal | Beiijng Tong Guang Fine Chemicals Company | 12397 | |
| NaBH4 | Sigma | 480886-25G | |
| OsO4 | Microscopia Eletrônica Ciências | 19110 | |
| PBS-A tampão | Dissolver NaH2PO4 (1,125 mM), Na2HPO4 (3,867 mM), NaCl (100 mM) em 1 L de ddH2O, ajustar para pH 7.4 | ||
| Papel de filtro qualitativo (velocidade média) | Beyotime Biotechnology | FFT08 | |
| Discos de safira | Beijing Wulundes Biotech Ltd., ou Escritório de Engenharia de M. Wohlwend | ||
| Caneta resistente a solventes | Microscopia Eletrônica Ciências | 62053-B | |
| SPI-Pon 812 resina | SPI Inc | 02659-AB | |
| Transmissão de elétrons microscopia | FEI | Tecnai G2 espírito | |
| Tripsina-EDTA | GBICO | C25200-056 | |
| Pinças | Dumont | ||
| Ultramictotome | Leica | FC7 | |
| Acetato de uranilo | Microscopia Ciências | 22400 |
Referências
- Tsien, R. Y. The green fluorescent protein. Annual Review of Biochemistry. 67, 509-544 (1998).
- Shaner, N. C., Patterson, G. H., Davidson, M. W. Advances in fluorescent protein technology. Journal of Cell Science. 120, 4247-4260 (2007).
- Masters, B. R.
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Reimpressões e permissões
