Summary
Denne protokol beskriver en klonbar elektronmikroskopimærkningsteknologi til påvisning af metallothionein-mærkede proteiner i celler ved hjælp af en ny autonukleationsundertrykkelsesmekanismebaseret guldnanopartikelsynteseteknik.
Abstract
Analyse af den præcise lokalisering af proteinmolekyler i celler med ultrastrukturel opløsning er af stor betydning for undersøgelsen af forskellige fysiologiske eller patologiske processer i alle levende organismer. Derfor er udviklingen af klonerbare tags, der kan bruges som elektronmikroskopiprober, af stor værdi, ligesom fluorescerende proteiner har spillet en afgørende rolle inden for optisk billeddannelse. Autonucleation suppression mechanism (ANSM) blev for nylig afdækket, hvilket muliggør den specifikke syntese af guldnanopartikler (AuNP'er) på cysteinrige tags, såsom metallothionein (MT) og frostvæskeprotein (AFP).
Baseret på ANSM blev der udviklet en elektronmikroskopimærkningsteknologi, som muliggør specifik påvisning af mærkede proteiner i prokaryote og eukaryote celler med en hidtil uset mærkningseffektivitet. Denne undersøgelse illustrerer en protokol til påvisning af MTn (en konstrueret MT-variant, der mangler aldehydreaktive rester) fusionsproteiner i pattedyrceller med velbevaret ultrastruktur. I denne protokol blev højtryksfrysning og frysesubstitutionsfiksering udført ved anvendelse af ikke-aldehydfikseringsmidler (såsom garvesyre, uranylacetat) for at bevare næsten oprindelig ultrastruktur og undgå beskadigelse af tagaktiviteten forårsaget af aldehydtværbinding.
En simpel et-trins rehydrering blev brugt før den ANSM-baserede AuNP-syntese. Resultaterne viste, at de mærkede proteiner målrettede forskellige organeller, herunder membranerne og lumen i det endoplasmatiske retikulum (ER), og mitokondriematricer blev detekteret med høj effektivitet og specificitet. Denne forskning giver biologer en robust protokol til at løse et enormt udvalg af biologiske spørgsmål på enkeltmolekyleniveau i cellulære ultrastrukturelle sammenhænge.
Introduction
I den postgenomiske æra har udviklingen af grønt fluorescerende protein (GFP) som enkeltmolekylereporter til lysmikroskopi revolutioneret området for moderne life science-forskning 1,2. I årtier har elektronmikroskopi (EM) været et kraftfuldt værktøj til intuitivt at observere den cellulære ultrastruktur med nanoskalaopløsning3; Den præcise identifikation og lokalisering af proteinmolekyler forbliver dog udfordrende.
Den mest almindeligt anvendte EM-mærkningsteknik er immunoelektronmikroskopi (IEM) mærkningsteknik, som er baseret på antigen-antistofreaktionen. Selvom der er udviklet mange teknikker inden for IEM-mærkning, herunder præ-indlejring af IEM og efterindlejring af IEM (på harpikssektioner eller hydrerede kryosektioner), lider den stadig af lav mærkningseffektivitet (<10%)4,5, som er relateret til prøveforberedelsen og antistofkvaliteten. For at overvinde disse begrænsninger har udvikling af genetisk kodede tags et stort anvendelsespotentiale.
To hovedtyper af EM-tags er blevet grundigt undersøgt i de senere år. En type er DAB-farvningsmetoden, der bruger tags som APEX2 til at oxidere 3,3'-diaminobenzidin (DAB) til osmiofile polymerer til EM-visualisering 6,7,8,9,10,11,12. Det muliggør mærkning af proteiner med høj overflod i subcellulære regioner, men er ikke egnet til enkeltmolekyletælling. Den anden type anvender metalbindende proteiner, såsom ferritin 13 og metallothionein (MT) 14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26, til at generere elektrontætte metalaflejringer i situ til EM-visualisering. Kun sidstnævnte har et reelt potentiale for visualisering og tælling af enkeltmolekyler. Den molekylære størrelse af ferritin er for stor (~ 450 kD) til, at den kan bruges som et lovende mærke, mens den lille størrelse (~ 5 kD) af MT og dens evne til at binde forskellige ioner gennem sine 20 cysteiner har tiltrukket stor opmærksomhed. Flere laboratorier har forsøgt at mærke oprensede MT-fusionsproteiner eller MT-ekspressive celler ved at inkubere direkte med Au+. Disse forsøg har oprindeligt bevist, at MT-tags kan binde guldioner til dannelse af signaler med høj kontrast, men ingen har virkelig opnået effektiv identifikation af individuelle proteiner i celler, og de er ikke bredt anvendelige 14,15,16,17,18,19,20,21,22,23.
Den ANSM-baserede AuNP-synteseteknik, der involverer syntetisering af 2-6 nm-størrelse AuNP'er direkte på cysteinrige tags (f.eks. MT, MT-varianterne MTn og MTα, AFP) som elektrontætte etiketter til EM-visualisering, er den første pålidelige og anvendelige tilgang til proteinmærkning og enkeltmolekyledetektion i celler24,25,26. Det giver mulighed for specifik syntese af AuNP'er på isolerede tagfusionsproteiner og har opnået en hidtil uset mærkningseffektivitet i ikke-fikserede eller kemisk faste prokaryote (E. coli) og eukaryote (S. pombe) celler. Imidlertid indebærer implementering af den samme protokol i mere avancerede systemer såsom pattedyrceller eller endda væv yderligere udfordringer, såsom den mere komplekse intracellulære redoxhomeostase og mere skrøbelige cellulære struktur.
Denne undersøgelse præsenterer en klonbar EM-mærkningsteknologi, der kombinerer den nye ANSM-baserede AuNP-synteseteknik til mærkning af genetisk kodede cysteinrige tags (MT) med HPF / FSF-rehydrering-HPF / FSF-prøveforberedelsesmetoden, muliggør den entydige enkeltmolekyleidentifikation af mærkede proteiner i ER-membranen, ER-lumen og mitokondriematrix i HeLa-celler. Den nuværende metode kombinerer egenskaberne ved høj mærkningseffektivitet, et højt signal-støj-forhold, enkeltmolekylemærkning og stærk universalitet, og denne metode har brede anvendelsesmuligheder inden for biovidenskabelig forskning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle de forsyninger, der anvendes i dette eksperiment, er anført i materialetabellen. Den trinvise arbejdsgang for den aktuelle protokol er vist i figur 1.
1. Cellekultur på safirskiver
- Overfør 3 mm x 0,16 mm safirskiver til et 2 ml centrifugerør indeholdende 1 ml ethanol og sonikere i en ultralydsrenser i 10 minutter.
- Brænd hver safirskive i en alkohollampeflamme, indtil der ikke er synlige aflejringer på overfladen.
BEMÆRK: Gennem ovenstående metode kan safirskiver genbruges mange gange. - Mærk den ene side af hver safirskive med et nummer ved hjælp af en opløsningsmiddelresistent pen (figur 1A).
BEMÆRK: Den anvendte markørpen skal testes for at afgøre, om den er resistent over for acetone og methanolopløsningsmidler på forhånd for at forhindre tab af mærker. - Placer de mærkede safirskiver i bunden af en 35 mm kulturskål med den mærkede side opad.
- Steriliser cellekulturskålen med safirskiver under UV-lys i 30 min.
- Vend safirskiverne med en pincet (den mærkede side nedad), og steriliser under UV-lys i yderligere 30 minutter. Nu er kulturskålen med safirskiverne klar til cellekultur.
BEMÆRK: Safirskiverne kan også steriliseres ved autoklavering. - Frø cellerne på safirskiverne, der er fremstillet ovenfor, og voks til 80% -90% sammenløb i en celleinkubator ved 37 ° C, 95% fugtighed og 5% CO2 (figur 1B).
BEMÆRK: Stabile HeLa-cellelinjer, der udtrykker MTn-tags, blev genereret som beskrevet i Jiang et al.26.
2. Højtryksfrysning (HPF)
FORSIGTIG: Flydende nitrogen anvendes i dette eksperiment. Når du arbejder med flydende nitrogen, skal du bruge korrekte sikkerhedsprocedurer og personlige værnemidler for at forhindre frostskader og kvælning.
- Forbered højtryksfrysemaskinen mindst 2 timer før eksperimentet i henhold til producentens anvisninger.
- Overfør type A HPF aluminiumsbærere (fordybning: 0,025/0,275 mm) til et 2 ml centrifugerør indeholdende 1 ml ethanol og sonikere i en ultralydsrenser i 10 minutter.
- Tør bærerne i en petriskål dækket med kvalitativt filterpapir (medium hastighed).
- Sug de forrensede bærere i blød i 1-hexadecen.
BEMÆRK: BSA anbefales ikke som kryoprotektivt middel i det nuværende eksperiment, da det vil forstyrre den efterfølgende guldnanopartikelsyntese. - Brug fin pincet til at hente en safirskive med celler fra kulturskålen; Berør den mærkede overflade med kvalitativt filterpapir (medium hastighed) for at fjerne det overskydende medium.
BEMÆRK: Vandets varmeledningsevne er meget lav, og for meget resterende vand vil påvirke fryseeffekten. Behold minimalt vand for at forhindre cellerne i at tørre ud. - Monter safirskiven i HPF-prøveholderen, og dæk hurtigt disken med en 0,025 mm dyb aluminiumsholder, der indeholder 1-hexadecen (figur 1C).
- Opsug overskydende opløsning med kvalitativt filterpapir (medium hastighed).
- Ilæg prøveholderen til højtryksfrysning (figur 1D).
BEMÆRK: Indlæsningsprocessen af prøver skal være så hurtig som muligt (inden for 1 min) for at minimere fysiologiske ændringer på grund af ændringer i temperatur, fugtighed, pH og iltindhold. - Safirskivebærerenheden aflæsses under flydende nitrogen i en kryoæskeskum, og enheden opbevares i en kryovial i flydende nitrogen før brug.
BEMÆRK: Protokollen kan sættes på pause her. Prøverne i cryovials kan opbevares i en flydende nitrogen dewar i årevis.
3. Frysesubstitutionsfiksering (FSF) og rehydrering (figur 1E)
- Fyld den automatiske frysesubstitutionsmaskine (AFS) med flydende nitrogen, og afkøl kammeret til -90 °C.
FORSIGTIG: Flydende nitrogen anvendes i dette eksperiment. Når du arbejder med flydende nitrogen, skal du bruge korrekte sikkerhedsprocedurer og personlige værnemidler for at forhindre frostskader og kvælning. - Forbered 2 ml 0,01% garvesyre (w/v) i acetone (FSF-opløsning 1) i en 20 mm rund polypropylenbeholder (figur 1E) i en stinkhætte og frys den i flydende nitrogen.
- Læg prøverne (safirskivebærerenhederne) i beholderen med frossen FSF-opløsning 1 under LN2 ved hjælp af en forkølet pincet.
- Overfør beholderen til det forkølede AFS-kammer til FSF-behandling ved -90 °C.
- Opbevar prøverne ved -90 °C i 1 time; Adskil derefter safirskiverne fra bærerne med forkølet pincet, og sørg for, at de markerede sider af safirskiverne vender nedad.
BEMÆRK: Pincetten skal være tilstrækkeligt forkølet til at forhindre temperaturændringer. Safirskiverne skal let adskilles. - Opbevares ved -90 °C i yderligere 8-10 timer; derefter opvarmes til -60 °C inden for 3 timer.
- Udskift FSF-opløsningen 1 i beholderen med forkølet acetone, og inkuber i 1 time. Gentag denne acetonevask 2x.
- Varm op til -30 °C inden for 3 timer. I løbet af denne periode fremstilles og forafkøles 2 ml 0,01% uranylacetat i acetone (FSF-opløsning 2, fortyndet fra 10% uranylacetat i methanol) i et 2 ml centrifugeglas.
FORSIGTIG: Uranylacetat, der anvendes i det nuværende eksperiment, er radioaktivt og meget giftigt; Det skal håndteres i henhold til korrekte sikkerhedsprocedurer og bortskaffes som farligt kemisk affald. - Acetonen erstattes med FSF-opløsning 2, og den inkuberes ved -30 °C i 3 timer.
- Udskift FSF-opløsning 2 i beholderen med forkølet acetone, og inkuber i 30 minutter ved -30 °C. Gentag denne acetonevask 2x.
- Varm fra -30 °C til 4 °C inden for 2 timer.
- Acetonen erstattes med 2 ml 0,2 M HEPES-buffer indeholdende 1 mM CaCl2 og 1 mMMgCl2 ved pH 5,5.
- Bufferen skiftes én gang, og den inkuberes ved stuetemperatur i 1 time eller ved 4 °C natten over.
BEMÆRK: Protokollen kan sættes på pause her i en nat eller fortsættes i mindst 6 timer, indtil prøverne fryses igen i trin 5.
4. ANSM-baseret AuNP-syntese til pattedyrceller (figur 1F)
- Vask med PBS-A buffer 3x i 5 min hver gang.
- Safirskiverne overføres til en 35 mm kulturskål indeholdende 1 ml PBS-A-buffer ved stuetemperatur.
BEMÆRK: Hold altid de markerede sider af safirskiverne nedad, og undgå at overlappe safirskiverne og gnide cellerne af. - Dryp reduktionsopløsningen ved at tilsætte 4,28 μL 2-mercaptoethanol i et 2 ml centrifugeglas indeholdende 1 ml PBS-A-buffer og blande godt i en damphætte.
FORSIGTIG: 2-Mercaptoethanol er giftigt og har en skarp lugt; Det skal håndteres i henhold til korrekte sikkerhedsprocedurer. - PBS-A-bufferen i dyrkningsskålen erstattes med 1 ml reducerende opløsning, og der inkuberes i 1 time ved stuetemperatur.
- Forbered guldforløberen før brug.
- Der tilsættes 80 μL 10 mM HAuCl4 i ddH 2 O i et2ml centrifugeglas indeholdende 1 ml reduktionsopløsning og straks hvirvelstrøm.
BEMÆRK: Opløsningen kan blive uklar. - Der tilsættes 80 μL 500 mM D-penicillamin i ddH2O i ovennævnte opløsning og straks hvirvelstrøm.
BEMÆRK: Løsningen kan blive klar igen.
- Der tilsættes 80 μL 10 mM HAuCl4 i ddH 2 O i et2ml centrifugeglas indeholdende 1 ml reduktionsopløsning og straks hvirvelstrøm.
- Opløsningen i dyrkningsskålen erstattes med 1 ml guldprækursoropløsning, der er fremstillet i trin 4.5, og inkuberes i 2 timer ved 4 °C.
BEMÆRK: En milliliter guldforløber er tilstrækkelig til at reagere med ca. 1 × 106 celler (sammenflydende på en 35 mm skål). Større mængder af forløberen er nødvendige, når AuNP'erne bliver betydeligt mindre. - 0,0038 g NaBH 4 afvejes i et 1,5 ml centrifugerør, tilsættes 1 ml iskold ddH2O og hvirvel for at lave frisk 100 mM NaBH4 lige før brug.
- Der tilsættes 20-100 μL 100 mM NaBH 4 til opløsningen fra trin4.6 , omrystes straks for at blande godt og inkuberes i 5 minutter ved stuetemperatur.
BEMÆRK: Forbered 100 mM NaBH4 frisk til øjeblikkelig brug. Efter tilsætning af NaBH4 bliver opløsningens farve gradvist rød og uddybes derefter. Hvis der ikke observeres nogen farveændring, indikerer det stort set, at eksperimentet er mislykket. - Opløsningen erstattes med 2 ml PBS-A-buffer for at stoppe reaktionen.
BEMÆRK: Det er afgørende at stoppe reaktionen inden for 30 minutter, da en langvarig reaktion gradvist vil nedbryde AuNP'erne.
5. Højtryksfrysning og frysesubstitutionsfiksering (figur 1C-F)
BEMÆRK: Prøverne er HPF og FSF igen, og proceduren er næsten den samme som tidligere beskrevet i afsnit 2 og afsnit 3 med nogle få ændringer.
- Forbered 1% osmiumtetroxid og 0,1% uranylacetat i acetone (FSF-opløsning 3, fortyndet fra 4% osmiumtetroxid i acetone og 10% uranylacetat i methanol).
FORSIGTIG: Osmiumtetroxid og uranylacetat er meget giftige kemikalier; De skal håndteres i overensstemmelse med korrekte sikkerhedsprocedurer og bortskaffes som farligt kemisk affald. - Læg prøverne (safirskivebærerenhederne) i beholderen med frossen FSF-opløsning 3 under LN2 ved hjælp af en forkølet pincet.
- Overfør beholderen til det forkølede AFS-kammer til FSF-behandling ved -90 °C, og kør FSF-programmet som følger: opbevares ved -90 °C i 8-10 timer; derefter opvarmes til -60 °C inden for 3 timer; opbevares ved -60 °C i 3 timer; derefter opvarmes til -30 ° C inden for 3 timer; opbevares ved -30 °C i 3 timer; derefter opvarmes til 4 °C inden for 2 timer.
- Når temperaturen når 4 °C, overføres prøverne til stinkhætten, og de opbevares ved stuetemperatur i 15 minutter.
- Vask med acetone 3x i 15 min hver gang.
- Opbevar i acetone ved stuetemperatur i mindst 2 timer.
6. Harpiksinfiltration, indlejring og polymerisation
- Forbered epoxyharpiksblandingen i henhold til producentens anvisninger inden brug.
FORSIGTIG: Epoxyharpiksen, der anvendes i det aktuelle eksperiment, er giftig før polymerisation; Det skal håndteres i henhold til korrekte sikkerhedsprocedurer. Upolymeriseret harpiks skal bortskaffes som farligt kemisk affald eller polymeriseres inden bortskaffelse. - Overfør safirskiverne til fladbundede indlejringskapsler, og infiltrer med harpiks i mindst 30 minutter ved stuetemperatur.
BEMÆRK: Hold de markerede sider af safirskiverne nedad. - Prøven polymeriseres ved 60 °C i en ovn i mindst 18 timer.
BEMÆRK: Protokollen kan sættes på pause her efter polymerisation. Polymeriserede prøveblokke kan opbevares i en tør beholder i årevis.
7. Ultratynd sektionering
- Trim de polymeriserede prøveblokke omhyggeligt ved hjælp af en barbermaskine for at udsætte safirskiverne.
- Dyp blokspidserne med safirskiver i flydende nitrogen i flere sekunder, og tø op ved stuetemperatur. Gentag fryse-optøningshandlingen flere gange for at løsne diskene fra blokkene.
BEMÆRK: Undgå langvarig frysning, da dette kan knække prøveblokkene. Afmonter forsigtigt safirskiverne med et blad, undgå overdreven kraft, som kan beskadige prøverne. - Trim blokfladen til en trapezformet form for ultratynd sektionering (figur 1G).
- Få 70-100 nm ultratynde sektioner med et ultramikrotomt (figur 1H).
- Vælg sektionerne på 200-mesh sekskantede kobbergitter.
BEMÆRK: Protokollen kan sættes på pause her efter sektionering. Sektionerne på bælter kan opbevares i en tør beholder i årevis. Hvis det ønskes, kan sektionerne på gitter farves med 2% uranylacetone for at opnå bedre membrankontrast. Blyfarvning bør undgås, da det maskerer nanoguldpartikelsignalerne.
8. TEM-billeddannelse (figur 1I)
- Undersøg de ultratynde sektioner på kobbernet ved hjælp af et transmissionselektronmikroskop. Typisk er et forstørrelsesområde fra 11 kX til 30 kX egnet til visualisering af AuNP'er i celler, og en passende defokuseringsværdi er nødvendig for at sikre, at 2-3 nm AuNP'er er synlige.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den ANSM-baserede AuNP-synteseteknik er et yderst nyttigt værktøj til mærkning og påvisning af MT-mærkede proteiner med TEM26. For at validere dets robusthed i pattedyrceller blev der genereret tre stabile cellelinjer, der udtrykte EGFP-MTn-KDEL, Ost4-EGFP-MTn eller Mito-acGFP-MTn i Hela-celler. KDEL er en kanonisk C-terminal endoplasmatisk retikulum (ER) retention/hentningssekvens, som opretholder fusionsproteinet EGFP-MTn-KDEL inden for ER-lumen eller det perinukleære rum i den nukleare kappe (NE). Ost4 er en underenhed af oligosaccharyltransferasekomplekset, som er et membranproteinkompleks lokaliseret i ER og NØ, der katalyserer N-glycosylering af spirende polypeptider. C-terminalen af Ost4-fusionsproteinet Ost4-EGFP-MTn vender mod cytosolen. Mito er en mitokondriel målretningssekvens, der er målrettet fusionsproteinet Mito-acGFP-MTn i mitokondriematrixen.
HPF / FSF-prøvepræparatet kombineret med brugen af garvesyre og uranylacetat i stedet for aldehydfikseringsmidler bevarede fremragende ultrastruktur med god membrankontrast (figur 2, figur 3 og figur 4). Den overordnede struktur af prøven var tæt uden åbenbar cytoplasma og lipidekstraktion. Membranstrukturen var glat uden åbenbar deformation, og phospholipid-dobbeltlagsstrukturen blev tydeligt afsløret.
Ud over den velbevarede ultrastruktur blev effektiv mærkning observeret i alle tre tilfælde, der repræsenterer forskellige organelle specificiteter. EGFP-MTn-KDEL-proteinet optrådte som 2-5 nm størrelse guldnanopartikler udelukkende fordelt i det perifere ER-lumen og i det perinukleære rum i NE (figur 2A-C). Den velbevarede ultrastruktur muliggjorde ikke kun enkeltmolekyleidentifikation af mærkede proteiner, men lettede også analysen af organelinteraktioner, såsom ER-mitokondrieinteraktioner (figur 2D, E). Nanopartikler af Ost4-EGFP-MTn-proteinet afgrænsede ER-membranen (figur 3A-D) og den ydre membran af NE (figur 3E). Nanopartikler blev også fordelt på den indre membran i NE, men antallet af nanopartikler der var lavere end på den ydre membran, hvilket indikerer, at proteinsammensætningen af de indre og ydre membraner var forskellig (figur 3E). Ligeledes udviste de mito-acGFP-MTn-ekspressive celler specifik mærkning i mitokondriematrixen (figur 4A-E). Der blev ikke observeret partikler i vesiklerne eller ER (figur 4A-D), og få partikler blev vist i MVB'erne (figur 4D).
Figur 1: Skema for arbejdsgangen for den klonbare elektronmikroskopimærkningsteknologi . (A) Safirskiver mærkes og steriliseres til cellekultur. (B) Celler dyrkes på safirskiver i en 35 mm kulturskål. (C) Safirskiverne med celler er dækket med 0,025 mm dybe aluminiumsbærere til højtryksfrysning, og det ekstra rum er fyldt med 1-hexadecen. (D) Cellerne kryofikseres af HPF. E) Fastfrysningssubstitution. (F) De skematiske trin i den ANSM-baserede AuNP-syntese. (G) Safirskiverne med celler er indlejret i fladbundede indlejringskapsler. Harpiksblokkene er trimmet til ultratynd sektionering. (H) De trimmede harpiksblokke er snittet med et ultramikrotom. (I) De ultratynde sektioner er afbildet med TEM. Forkortelser: ANSM = autonucleation suppression mechanism; AuNP = guld nanopartikel; HPF = højtryksfrysning; FSF = frysesubstitutionsfiksering; TEM = transmissionselektronmikroskopi. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: ANSM-baseret AuNP-syntese på EGFP-MTn-KDEL udtrykt i HeLa-celler. (A,D) EM-billeder af et 90 nm tykt udsnit af HeLa-celler, der udtrykker EGFP-MTn-KDEL, viser AuNP'er, der specifikt er akkumuleret i lumen i det endoplasmatiske retikulum og i det perinukleære rum i den nukleare kuvert. Få partikler observeres i mitokondrier, lysosom, kerne eller cytosol. (B,C) Zoomede billeder af henholdsvis de røde og gule rektangelområder i (A). (E) Zoomet billede af det grønne rektangelområde i (D). Dette tal er blevet ændret fra Jiang et al.26. Skalastænger = (B, C, E) 200 nm; (A,D) 500 nm. Forkortelser: ANSM = autonucleation suppression mechanism; AuNP = guld nanopartikel; EGFP = forbedret grønt fluorescerende protein; ER = endoplasmatisk retikulum; NE = nuklear ramme; M = mitokondrier; Lyso = lysosom; N = kerne. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: ANSM-baseret AuNP-syntese på Ost4-EGFP-MTn udtrykt i HeLa-celler. (A-D) EM-billeder af en 90 nm tyk sektion af HeLa-celler, der udtrykker Ost4-EGFP-MTn, viser AuNP'er, der specifikt akkumuleres på membranen i det endoplasmatiske retikulum. (E) Et EM-billede af en 90 nm tyk sektion af HeLa-celler, der udtrykker Ost4-EGFP-MTn, viser AuNP'er, der specifikt er akkumuleret på membranen i NE (nuklear kappe). Få partikler observeres i mitokondrier, lysosom, kerne eller cytosol. (C) Zoomet billede af det røde rektangelområde i (A). Dette tal er blevet ændret fra Jiang et al.26. Skalastænger = (B-E) 200 nm; A) 500 nm. Forkortelser: ANSM = autonucleation suppression mechanism; AuNP = guld nanopartikel; EGFP = forbedret grønt fluorescerende protein; ER = endoplasmatisk retikulum; NE = nuklear kuvert; M = mitokondrier; Lyso = lysosom; N = kerne; EM = elektronmikroskopi. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: ANSM-baseret AuNP-syntese på Mito-acGFP-MTn udtrykt i HeLa-celler. (A,D,E) EM-billeder af en 90 nm tyk sektion af HeLa-celler, der udtrykker Mito-acGFP-MTn, viser AuNP'er, der specifikt er akkumuleret i mitokondriernes matrix (M). Få partikler observeres i det endoplasmatiske retikulum, kerne, vesikel, multivesikulær krop eller cytosol. (B,C) Zoomet billede af henholdsvis de røde og gule rektangelområder i (A). Dette tal er blevet ændret fra Jiang et al.26. Skalastænger = (D,E) 200 nm; B,C) 500 nm (A) 1 μm. Forkortelser: ANSM = autonucleation suppression mechanism; AuNP = guld nanopartikel; EGFP = forbedret grønt fluorescerende protein; ER = endoplasmatisk retikulum; NE = nuklear ramme; M = mitokondrier; Lyso = lysosom; N = kerne; V= vesikel; MVB = multi-vesikulær krop. Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Undersøgelsen præsenterer her en robust klonbar EM-mærkningsteknologi til enkeltmolekylevisualisering af proteinmolekyler i det cellulære miljø med ultrastrukturel opløsning. AuNP'erne syntetiseret direkte på genetisk kodede cysteinrige tags giver entydig og præcis lokalisering af målproteinerne. Højtryksfrysning og frysesubstitutionsteknik bevarer fremragende ultrastrukturen af biologiske prøver. Samlet set giver den klonbare elektronmikroskopimærkningsteknologi, der præsenteres her, et kraftfuldt værktøj til effektiv lokalisering og genkendelse af et enkelt molekyle i cellulære ultrastrukturelle sammenhænge in situ med EM.
ANSM-mekanismen undertrykker autonukleationsprocessen af thiolat-Au(I)-polymerer26, som er en typisk reaktion i den klassiske Brust-Schiffrin-metode (BSM)27 , der i vid udstrækning anvendes til syntetisering af thiolat-capped guldnanoklynger. Derfor kan den ANSM-baserede AuNP-synteseteknik specifikt syntetisere 2-6 nm-størrelse AuNP'er direkte på cysteinrige tags som elektrontætte etiketter til EM-visualisering med et højt signal-støj-forhold og høj effektivitet. I modsætning til APEX2- eller HPR-mærkningsteknikker, der er afhængige af DAB-polymeraflejring, som er utallige og ikke egnede til opløselige proteiner i cytosolen, er den ANSM-baserede AuNP-synteseteknik den eneste teknik, der muliggør enkeltmolekyledetektion hidtil.
Ulempen ved den klonbare elektronmikroskopimærkningsteknologi er, at den ANSM-baserede AuNP-synteseteknik er afhængig af aktiviteten af thiolgruppen af cystein, som er følsom over for aldehydfikseringsmidler. Den oxidative beskyttelse af thioler med 3,3'-dithiodipropionsyre (DTDPA) er blevet indført før aldehydfiksering i E. coli og fissionsgæren S. pombe, hvilket resulterer i god morfologi og fremragende mærkningseffektivitet24,25,26. I dette arbejde fungerede oxidations-/fikseringsmetoden korrekt for de mærker, der udtrykkes i et relativt oxidativt rum, såsom ER-lumen- og mitokondriematrixen (i EGFP-MTn-KDEL- og Mito-acGFP-MTn-celler). Det var imidlertid suboptimalt for cytosoliske tags (Ost4-GFP-MTn) i pattedyrceller. Årsagen kan være, at mærkerne i reduktionsrummene ikke er godt foldet, og de reducerende stoffer som GSH, der er til stede i overflod i cytoplasmaet, kan modstå oxidation.
HPF-FSF-teknik er guldstandarden i den ultrastrukturelle bevarelse af biologiske prøver til elektronmikroskopi. I dette arbejde opnåede metoden HPF / FSF-rehydrering-HPF / FSF, som helt undgår den konventionelle kemiske fiksering og permeabilisering, effektiv mærkning med Ost4-GFP-MTn og gav fremragende cellestruktur. Denne metode har dog stadig visse begrænsninger. For det første kan en anden HPF føre til betydelig iskrystalskade. For det andet har forskellige partier uranylacetat problemer med inkonsekvent kvalitet og opløselighed. Acikulære bundfald optrådte lejlighedsvis i de rehydrerede prøver, når de visualiseres ved elektronmikroskopi. Vask med HEPES-buffer ved pH 5,5 kan afhjælpe dette problem. For det tredje skal prøveforberedelsen til vævsprøver optimeres yderligere.
Afslutningsvis muliggør den klonbare EM-mærkningsteknologi, der kombinerer den ANSM-baserede AuNP-synteseteknik med prøveforberedelsesmetoden for HPF / FSF-rehydrering-HPF / FSF, den entydige enkeltmolekyleidentifikation af genetisk mærkede proteiner i celler ved elektronmikroskopi. Den nuværende protokol bør gøre det muligt at behandle en lang række biologiske spørgsmål.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatteren erklærer ingen interessekonflikter.
Acknowledgments
Protokollen beskrevet her stammer fra artiklen offentliggjort af Jiang et al. (2020). Dette arbejde blev støttet af tilskud fra MOST (973 programmer nr. 2011CB812502 og 2014CB849902) og af finansieringsstøtte fra Beijing kommunale regering.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.025 mm/0.275 mm Aluminum carrier | Beijing Wulundes Biotech Ltd., or Engineering Office of M. Wohlwend | ||
| 0.2 M HEPES buffer | Dissolve HEPES (0.2 M) in 980 mL of ddH2O, then add 10 mL of 100 mM MgCl2 and 10 mL of 100 mM CaCl2 (final concentration 1 mM), respectively, adjust pH to 5.5 | ||
| 1.5 mL MaxyClear snaplock microtube | Axygen Scientific | MCT150C | |
| 2 mL polypropylene screw cap microtubes | Biologix | 81-0204 | |
| 200 mesh hexagonal copper grid | Tedpella inc | G200HEX | |
| 2-mercaptoethanol | Amresco | 0482-250ML | |
| 35 mm cell culture dishes | Corning | 430165 | |
| 50 mL polypropylene centrifuge tubes | Corning | 430928 | |
| Acetone | Beiijng Tong Guang Fine Chemicals Company | 31025 | |
| Automated freeze substitution machine | Leica | AFS2 | |
| Customized 3.05 mm x 0.66 mm specimen holders for HPF | Beijing Wulundes Biotech Ltd. | ||
| D-penicillamine | TCI | P0147 | |
| Dulbecco’s modified Eagle medium | GBICO | C11965500BT | |
| Fetal bovine serum | GBICO | 10099-141C | |
| Flat bottom embedding capsule | Tedpella inc | ||
| Foam cryobox | |||
| Formvar 15/95 resin | Electron Microscopy Sciences | 15800 | |
| HAuCl4 | Sigma | 4022-1G | |
| HEPES | sigma | H3375-500G | |
| HPF machine | Wohlwend | HPF compact01 | |
| Methonal | Beiijng Tong Guang Fine Chemicals Company | 12397 | |
| NaBH4 | Sigma | 480886-25G | |
| OsO4 | Electron Microscopy Sciences | 19110 | |
| PBS-A buffer | Dissolve NaH2PO4 (1.125 mM), Na2HPO4 (3.867 mM), NaCl (100 mM) in 1 L of ddH2O, adjust to pH 7.4 | ||
| Qualitative filter paper (medium speed) | Beyotime Biotechnology | FFT08 | |
| Sapphire discs | Beijing Wulundes Biotech Ltd., or Engineering Office of M. Wohlwend | ||
| Solvent resistant pen | Electron Microscopy Sciences | 62053-B | |
| SPI-Pon 812 resin | SPI Inc | 02659-AB | |
| Transmission electron microscopy | FEI | Tecnai G2 spirit | |
| Trypsin-EDTA | GBICO | C25200-056 | |
| Tweezers | Dumont | ||
| Ultramictotome | Leica | FC7 | |
| Uranyl acetate | Electron Microscopy Sciences | 22400 |
References
- Tsien, R. Y.
- Shaner, N. C., Patterson, G. H., Davidson, M. W.
- Masters, B. R. History of the electron microscope in cell biology. Encylopedia of Life Sciences. , (2009).
- Griffiths, G., Hoppeler, H. Quantitation in immunocytochemistry: Correlation of immunogold labeling to absolute number of membrane antigens. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 34 (11), 1389-1398 (1986).
- Tokuyasu, K. T. A technique for ultracryotomy of cell suspensions and tissues. Journal of Cell Biology. 57 (2), 551-565 (1973).
- Connolly, C. N., Futter, C. E., Gibson, A., Hopkins, C. R., Cutler, D. F. Transport into and out of the Golgi complex studied by transfecting cells with cDNAs encoding horseradish peroxidase. Journal of Cell Biology. 127 (3), 641-652 (1994).
- Grabenbauer, M., et al. Correlative microscopy and electron tomography of GFP through photooxidation. Nature Methods. 2 (11), 857-862 (2005).
- Gaietta, G., et al. Multicolor and electron microscopic imaging of connexin trafficking. Science. 296 (5567), 503-507 (2002).
- Shu, X., et al. A genetically encoded tag for correlated light and electron microscopy of intact cells, tissues, and organisms. PLoS Biology. 9 (4), e1001041 (2011).
- Martell, J. D., et al. Engineered ascorbate peroxidase as a genetically encoded reporter for electron microscopy. Nature Biotechnology. 30 (11), 1143-1148 (2012).
- Lam, S. S., et al. Directed evolution of APEX2 for electron microscopy and proximity labeling. Nature Methods. 12 (1), 51-54 (2015).
- Mavlyutov, T. A., et al. APEX2-enhanced electron microscopy distinguishes sigma-1 receptor localization in the nucleoplasmic reticulum. Oncotarget. 8 (31), 51317-51330 (2017).
- Wang, Q., Mercogliano, C. P., Lowe, J. A ferritin-based label for cellular electron cryotomography. Structure. 19 (2), 147-154 (2011).
- Sano, T., Glazer, A. N., Cantor, C. R. A streptavidin-metallothionein chimera that allows specific labeling of biological materials with many different heavy metal ions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 89 (5), 1534-1538 (1992).
- Mercogliano, C. P., DeRosier, D. J. Gold nanocluster formation using metallothionein: Mass spectrometry and electron microscopy. Journal of Molecular Biology. 355 (2), 211-223 (2006).
- Mercogliano, C. P., DeRosier, D. J. Concatenated metallothionein as a clonable gold label for electron microscopy. Journal of Structural Biology. 160 (1), 70-82 (2007).
- Morphew, M. K., et al. Metallothionein as a clonable tag for protein localization by electron microscopy of cells. Journal of Microscopy. 260 (1), 20-29 (2015).
- Nishino, Y., Yasunaga, T., Miyazawa, A. A genetically encoded metallothionein tag enabling efficient protein detection by electron microscopy. Journal of Electron Microscopy. 56 (3), 93-101 (2007).
- Bouchet-Marquis, C., Pagratis, M., Kirmse, R., Hoenger, A. Metallothionein as a clonable high-density marker for cryo-electron microscopy. Journal of Structural Biology. 177 (1), 119-127 (2012).
- Fukunaga, Y., et al. Electron microscopic analysis of a fusion protein of postsynaptic density-95 and metallothionein in cultured hippocampal neurons. Journal of Electron Microscopy. 56 (4), 119-129 (2007).
- Diestra, E., Fontana, J., Guichard, P., Marco, S., Risco, C. Visualization of proteins in intact cells with a clonable tag for electron microscopy. Journal of Structural Biology. 165 (3), 157-168 (2009).
- Risco, C., et al. sensitive, high-resolution detection of protein molecules in eukaryotic cells using metal-tagging transmission electron microscopy. Structure. 20 (5), 759-766 (2012).
- Ding, S. -W., et al. Noncanonical role for the host Vps4 AAA+ ATPase ESCRT protein in the formation of tomato bushy stunt virus replicase. PLoS Pathogens. 10 (4), e1004087 (2014).
- Jiang, Z., et al. Direct synthesis of gold nanoparticles on cysteine-rich tags in yeast cells. Protocol Exchange. , (2020).
- Jiang, Z., et al. Direct synthesis of gold nanoparticles on cysteine-rich tags in mammalian cells. Protocol Exchange. , (2020).
- Jiang, Z., et al. Genetically encoded tags for direct synthesis of EM-visible gold nanoparticles in cells. Nature Methods. 17 (9), 937-946 (2020).
- Brust, M., Walker, M., Bethell, D., Schiffrin, D. J., Whyman, R. Synthesis of thiol-derivatised gold nanoparticles in a two-phase liquid-liquid system. Journal of the Chemical Society, Chemical Communications. 7, 801-802 (1994).
