Summary
يصف هذا البروتوكول تقنية لصق المجهر الإلكتروني القابل للاستنساخ للكشف عن البروتينات الموسومة بالميتالوثيونين في الخلايا باستخدام تقنية جديدة لتخليق الجسيمات النانوية الذهبية القائمة على آلية قمع النوى الذاتية.
Abstract
يعد تحليل التوطين الدقيق لجزيئات البروتين في الخلايا ذات الدقة الهيكلية الفائقة ذا أهمية كبيرة لدراسة العمليات الفسيولوجية أو المرضية المختلفة في جميع الكائنات الحية. لذلك ، فإن تطوير العلامات القابلة للاستنساخ التي يمكن استخدامها كمجسات مجهرية إلكترونية له قيمة كبيرة ، تماما كما لعبت البروتينات الفلورية دورا حاسما في مجال التصوير البصري. تم الكشف مؤخرا عن آلية قمع النوى الذاتية (ANSM) ، والتي تسمح بالتوليف المحدد لجسيمات الذهب النانوية (AuNPs) على العلامات الغنية بالسيستين ، مثل ميتالوثيونين (MT) والبروتين المضاد للتجمد (AFP).
استنادا إلى ANSM ، تم تطوير تقنية وضع العلامات المجهرية الإلكترونية ، والتي تتيح الكشف المحدد عن البروتينات الموسومة في الخلايا بدائية النواة وحقيقية النواة بكفاءة غير مسبوقة في وضع العلامات. توضح هذه الدراسة بروتوكولا للكشف عن بروتينات اندماج MTn (متغير MT مهندس يفتقر إلى بقايا الألدهيد التفاعلية) في خلايا الثدييات ذات البنية التحتية المحفوظة جيدا. في هذا البروتوكول ، تم إجراء التثبيت بالتجميد والتجميد بالضغط العالي باستخدام مثبتات غير الألدهيد (مثل حمض التانيك ، أسيتات اليورانيل) للحفاظ على البنية التحتية شبه الأصلية وتجنب تلف نشاط العلامة الناجم عن تشابك الألدهيد.
تم استخدام إماهة بسيطة من خطوة واحدة قبل تخليق AuNP القائم على ANSM. أظهرت النتائج أن البروتينات الموسومة استهدفت عضيات مختلفة ، بما في ذلك أغشية وتجويف الشبكة الإندوبلازمية (ER) ، وتم الكشف عن مصفوفات الميتوكوندريا بكفاءة وخصوصية عالية. يوفر هذا البحث لعلماء الأحياء بروتوكولا قويا لمعالجة مجموعة هائلة من الأسئلة البيولوجية على مستوى الجزيء الواحد في السياقات الخلوية الفائقة.
Introduction
في عصر ما بعد الجينوم ، أحدث تطوير البروتين الفلوري الأخضر (GFP) كمراسل أحادي الجزيء للفحص المجهري الضوئي ثورة في مجال أبحاث علوم الحياة الحديثة 1,2. لعقود من الزمان ، كان المجهر الإلكتروني (EM) أداة قوية لمراقبة البنية الخلوية بشكل حدسي بدقةنانوية 3. ومع ذلك ، لا يزال التحديد الدقيق لجزيئات البروتين وتوطينها يمثل تحديا.
تقنية وضع العلامات EM الأكثر استخداما هي تقنية وضع العلامات المجهرية الإلكترونية المناعية (IEM) ، والتي تعتمد على تفاعل المستضد والجسم المضاد. ومع ذلك ، على الرغم من تطوير العديد من التقنيات في مجال وضع العلامات على IEM ، بما في ذلك التضمين المسبق IEM وما بعد التضمين IEM (على أقسام الراتنج أو عمليات التبريد المائية) ، إلا أنها لا تزال تعاني من انخفاض كفاءة وضع العلامات (<10٪) 4,5 ، والتي تتعلق بإعداد العينة وجودة الأجسام المضادة. للتغلب على هذه القيود ، فإن تطوير العلامات المشفرة وراثيا له إمكانات تطبيقية كبيرة.
تم استكشاف نوعين رئيسيين من علامات EM بدقة في السنوات الأخيرة. أحد الأنواع هو طريقة تلطيخ DAB ، والتي تستخدم علامات مثل APEX2 لأكسدة 3،3'-ديامينوبنزيدين (DAB) إلى بوليمرات osmiophilic لتصور EM6،7،8،9،10،11،12. إنه يتيح وضع العلامات على البروتينات عالية الوفرة في المناطق تحت الخلوية ولكنه غير مناسب لحساب جزيء واحد. يستخدم النوع الآخر بروتينات ربط المعادن ، مثل الفيريتين13 والميتالوثيونين (MT) 14،15،16،17،18،19،20،21،22،23،24،25،26 ، لتوليد رواسب معدنية كثيفة الإلكترون في في الموقع لتصور EM. فقط هذا الأخير لديه إمكانات حقيقية للتصور والعد أحادي الجزيئ. الحجم الجزيئي للفيريتين كبير جدا (~ 450 كيلو دال) بحيث لا يمكن استخدامه كعلامة واعدة ، في حين أن الحجم الصغير (~ 5 كيلو دال) من MT وقدرته على ربط الأيونات المختلفة من خلال 20 cysteines قد جذبت اهتماما كبيرا. حاولت العديد من المختبرات تسمية بروتينات اندماج MT المنقاة أو الخلايا المعبرة عن MT عن طريق الحضانة مباشرة باستخدام Au +. أثبتت هذه المحاولات في البداية أن علامات MT يمكن أن تربط أيونات الذهب لتشكيل إشارات عالية التباين ، ولكن لم يحقق أي منها بالفعل التحديد الفعال للبروتينات الفردية في الخلايا ، وهي غير قابلة للتطبيق على نطاق واسع14،15،16،17،18،19،20،21،22،23.
تقنية توليف AuNP القائمة على ANSM ، والتي تتضمن توليف AuNPs بحجم 2-6 نانومتر مباشرة على العلامات الغنية بالسيستين (على سبيل المثال ، MT ، متغيرات MT MTn و MTα ، AFP) كملصقات كثيفة الإلكترون لتصور EM ، هي أول نهج موثوق وقابل للتطبيق لوضع العلامات على البروتين واكتشاف جزيء واحد في الخلايا24،25،26. يسمح بالتوليف المحدد ل AuNPs على بروتينات اندماج العلامة المعزولة وقد حقق كفاءة غير مسبوقة في وضع العلامات في الخلايا بدائية النواة غير الثابتة أو الثابتة كيميائيا (E. coli) وحقيقية النواة (S. pombe). ومع ذلك ، فإن تنفيذ نفس البروتوكول في أنظمة أكثر تقدما مثل خلايا الثدييات أو حتى الأنسجة ينطوي على تحديات إضافية ، مثل توازن الأكسدة والاختزال داخل الخلايا الأكثر تعقيدا والبنية الخلوية الأكثر هشاشة.
تقدم هذه الدراسة تقنية وضع العلامات EM القابلة للاستنساخ ، والتي تجمع بين تقنية توليف AuNP الجديدة القائمة على ANSM لوضع العلامات الغنية بالسيستين المشفرة وراثيا (MT) مع طريقة تحضير عينة HPF / FSF-rehydration-HPF / FSF ، مما يتيح تحديد جزيء واحد لا لبس فيه للبروتينات الموسومة في غشاء ER ، وتجويف ER ، ومصفوفة الميتوكوندريا في خلايا HeLa. تجمع الطريقة الحالية بين خصائص كفاءة وضع العلامات العالية ، ونسبة الإشارة إلى الضوضاء العالية ، ووضع العلامات أحادية الجزيء ، والعالمية القوية ، وهذه الطريقة لها آفاق تطبيق واسعة في أبحاث علوم الحياة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
جميع المستلزمات المستخدمة في هذه التجربة مدرجة في جدول المواد. يظهر سير العمل خطوة بخطوة للبروتوكول الحالي في الشكل 1.
1. زراعة الخلايا على أقراص الياقوت
- انقل أقراص الياقوت 3 مم × 0.16 مم إلى أنبوب طرد مركزي سعة 2 مل يحتوي على 1 مل من الإيثانول ، وقم بصوتنيكات في منظف بالموجات فوق الصوتية لمدة 10 دقائق.
- احرق كل قرص ياقوتي في لهب مصباح كحولي حتى لا توجد رواسب مرئية على السطح.
ملاحظة: من خلال الطريقة المذكورة أعلاه ، يمكن إعادة تدوير أقراص الياقوت عدة مرات. - قم بتسمية جانب واحد من كل قرص ياقوتي برقم باستخدام قلم مقاوم للمذيبات (الشكل 1 أ).
ملاحظة: يجب اختبار قلم التحديد المستخدم لتحديد ما إذا كان مقاوما لمذيبات الأسيتون والميثانول مسبقا لمنع فقدان العلامات. - ضع أقراص الياقوت المسمى في الجزء السفلي من طبق استزراع 35 مم بحيث يكون الجانب المسمى متجها لأعلى.
- تعقيم طبق زراعة الخلايا مع أقراص الياقوت تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية لمدة 30 دقيقة.
- اقلب أقراص الياقوت بملاقط (الجانب المسمى متجها لأسفل) ، وقم بتعقيمها تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية لمدة 30 دقيقة إضافية. الآن ، طبق الاستزراع الذي يحتوي على أقراص الياقوت جاهز لزراعة الخلايا.
ملاحظة: يمكن أيضا تعقيم أقراص الياقوت عن طريق التعقيم. - قم بزرع الخلايا على أقراص الياقوت المحضرة أعلاه ، وتنمو إلى التقاء 80٪ -90٪ في حاضنة الخلايا عند 37 درجة مئوية ، ورطوبة 95٪ ، و 5٪ CO2 (الشكل 1 ب).
ملاحظة: تم إنشاء خطوط خلايا HeLa المستقرة التي تعبر عن علامات MTn كما هو موضح في Jiang et al.26.
2. تجميد الضغط العالي (HPF)
تنبيه: يستخدم النيتروجين السائل في هذه التجربة. عند العمل مع النيتروجين السائل ، استخدم إجراءات السلامة المناسبة ومعدات الحماية الشخصية لمنع قضمة الصقيع والاختناق.
- قم بإعداد آلة التجميد عالية الضغط قبل 2 ساعة على الأقل من التجربة وفقا لتعليمات الشركة الصانعة.
- نقل ناقلات الألومنيوم من النوع A HPF (التجويف: 0.025 / 0.275 مم) إلى أنبوب طرد مركزي سعة 2 مل يحتوي على 1 مل من الإيثانول ، وصوتنة في منظف بالموجات فوق الصوتية لمدة 10 دقائق.
- جفف الناقلات في طبق بتري مغطى بورق ترشيح نوعي (سرعة متوسطة).
- نقع ناقلات تنظيفها مسبقا في 1-هيكساديسين.
ملاحظة: لا ينصح باستخدام BSA كواقي للتبريد في التجربة الحالية لأنه سيتداخل مع تخليق جسيمات الذهب النانوية اللاحقة. - استخدم ملاقط دقيقة لالتقاط قرص الياقوت مع خلايا من طبق الاستزراع ؛ المس السطح المسمى بورق ترشيح نوعي (سرعة متوسطة) لإزالة الوسط الزائد.
ملاحظة: الموصلية الحرارية للمياه منخفضة جدا ، وسيؤثر الكثير من الماء المتبقي على تأثير التجميد. احتفظ بالحد الأدنى من الماء لمنع الخلايا من الجفاف. - قم بتركيب قرص الياقوت في حامل عينة HPF ، وقم بتغطية القرص بسرعة بحامل ألومنيوم بعمق 0.025 مم يحتوي على 1-hexadecene (الشكل 1C).
- نضح المحلول الزائد باستخدام ورق الترشيح النوعي (سرعة متوسطة).
- قم بتحميل حامل العينة للتجميد عالي الضغط (الشكل 1 د).
ملاحظة: يجب أن تكون عملية تحميل العينات في أسرع وقت ممكن (في غضون 1 دقيقة) لتقليل التغيرات الفسيولوجية بسبب التغيرات في درجة الحرارة والرطوبة ودرجة الحموضة ومحتوى الأكسجين. - قم بتفريغ مجموعة حامل قرص الياقوت تحت النيتروجين السائل في صندوق تبريد رغوي ، وقم بتخزين التجميع في كريوفيال في النيتروجين السائل قبل الاستخدام.
ملاحظة: قد يتم إيقاف البروتوكول مؤقتا هنا. يمكن تخزين العينات الموجودة في cryovials في ديوار النيتروجين السائل لسنوات.
3. تثبيت التجميد والاستبدال (FSF) والإماهة (الشكل 1E)
- املأ آلة استبدال التجميد الآلية (AFS) بالنيتروجين السائل ، وقم بتبريد الغرفة إلى -90 درجة مئوية.
تنبيه: يستخدم النيتروجين السائل في هذه التجربة. عند العمل مع النيتروجين السائل ، استخدم إجراءات السلامة المناسبة ومعدات الحماية الشخصية لمنع قضمة الصقيع والاختناق. - تحضير 2 مل من 0.01٪ حمض التانيك (وزن / حجم) في الأسيتون (محلول FSF 1) في حاوية بولي بروبيلين مستديرة 20 مم (الشكل 1E) في غطاء دخان وقم بتجميده في النيتروجين السائل.
- قم بتحميل العينات (مجموعات حامل قرص الياقوت) في الحاوية بمحلول FSF المجمد 1 تحت LN2 باستخدام زوج من الملقط المبرد مسبقا.
- انقل الحاوية إلى غرفة AFS المبردة مسبقا لمعالجة FSF عند -90 درجة مئوية.
- الحفاظ على العينات في -90 درجة مئوية لمدة 1 ساعة ؛ بعد ذلك ، افصل أقراص الياقوت عن الحاملات باستخدام ملاقط مبردة مسبقا ، وتأكد من أن الجوانب المحددة لأقراص الياقوت متجهة لأسفل.
ملاحظة: يجب تبريد الملقط مسبقا بدرجة كافية لمنع التغيرات في درجات الحرارة. يجب فصل أقراص الياقوت بسهولة. - يحفظ عند -90 درجة مئوية لمدة 8-10 ساعات أخرى ؛ ثم ، دافئة إلى -60 درجة مئوية في غضون 3 ساعات.
- استبدل محلول FSF 1 في الحاوية بالأسيتون المبرد مسبقا ، واحتضانه لمدة 1 ساعة. كرر غسل الأسيتون هذا 2x.
- دافئ إلى -30 درجة مئوية في غضون 3 ساعات. خلال هذه الفترة ، قم بإعداد وتبريد 2 مل من أسيتات اليورانيل 0.01٪ في الأسيتون (محلول FSF 2 ، مخفف من 10٪ أسيتات يورانيل في الميثانول) في أنبوب طرد مركزي سعة 2 مل.
تنبيه: أسيتات اليورانيل ، المستخدمة في التجربة الحالية ، مشعة وشديدة السمية. يجب التعامل معها وفقا لإجراءات السلامة المناسبة والتخلص منها كنفايات كيميائية خطرة. - استبدل الأسيتون بمحلول FSF 2 ، واحتضانه عند -30 درجة مئوية لمدة 3 ساعات.
- استبدل محلول FSF 2 في الحاوية بالأسيتون المبرد مسبقا ، واحتضانه لمدة 30 دقيقة عند -30 درجة مئوية. كرر غسل الأسيتون هذا 2x.
- دافئ من -30 درجة مئوية إلى 4 درجات مئوية في غضون 2 ساعة.
- استبدل الأسيتون ب 2 مل من 0.2 M HEPES buffer يحتوي على 1 mM CaCl 2 و 1 mM MgCl2 عند الرقم الهيدروجيني 5.5.
- قم بتغيير المخزن المؤقت مرة واحدة ، واحتضانه في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة أو عند 4 درجات مئوية طوال الليل.
ملاحظة: قد يتم إيقاف البروتوكول مؤقتا هنا لمدة ليلة واحدة أو الاستمرار لمدة 6 ساعات على الأقل حتى يتم تجميد العينات مرة أخرى في الخطوة 5.
4. تخليق AuNP القائم على ANSM لخلايا الثدييات (الشكل 1F)
- يغسل مع العازلة PBS-A 3x لمدة 5 دقائق في كل مرة.
- انقل أقراص الياقوت إلى طبق استزراع 35 مم يحتوي على 1 مل من المخزن المؤقت PBS-A في درجة حرارة الغرفة.
ملاحظة: احتفظ دائما بالجوانب المحددة لأقراص الياقوت متجهة لأسفل ، وتجنب تداخل أقراص الياقوت وفرك الخلايا. - قم بإعداد محلول الاختزال عن طريق إضافة 4.28 ميكرولتر من 2-ميركابتوإيثانول في أنبوب طرد مركزي سعة 2 مل يحتوي على 1 مل من المخزن المؤقت PBS-A ويخلط جيدا في غطاء الدخان.
تنبيه: 2-Mercaptoethanol سام وله رائحة نفاذة. يجب التعامل معها وفقا لإجراءات السلامة المناسبة. - استبدل المخزن المؤقت PBS-A في طبق الاستزراع ب 1 مل من محلول الاختزال ، واحتضانه لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
- تحضير السلائف الذهبية قبل الاستخدام.
- أضف 80 ميكرولتر من 10 مللي متر HAuCl4 في ddH 2 O في أنبوب طرد مركزي سعة2مل يحتوي على 1 مل من محلول الاختزال ، ودوامة على الفور.
ملاحظة: قد يصبح المحلول غائما. - أضف 80 ميكرولتر من 500 mM D-penicillamine في ddH2O إلى المحلول أعلاه ، ودوامة على الفور.
ملاحظة: قد يصبح الحل واضحا مرة أخرى.
- أضف 80 ميكرولتر من 10 مللي متر HAuCl4 في ddH 2 O في أنبوب طرد مركزي سعة2مل يحتوي على 1 مل من محلول الاختزال ، ودوامة على الفور.
- استبدل المحلول في طبق الاستزراع ب 1 مل من محلول سلائف الذهب المحضر في الخطوة 4.5 ، واحتضانه لمدة 2 ساعة عند 4 درجات مئوية.
ملاحظة: ملليلتر واحد من سلائف الذهب يكفي للتفاعل مع ما يقرب من 1 × 106 خلايا (متداخلة على طبق 35 مم). هناك حاجة إلى كميات أكبر من السلائف عندما تصبح AuNPs أصغر بكثير. - قم بوزن 0.0038 جم من NaBH 4 في أنبوب طرد مركزي سعة 1.5 مل ، وأضف 1 مل من ddH2O المثلج البارد ، ودوامة لصنع 100 mM NaBH4 طازجا قبل الاستخدام مباشرة.
- أضف 20-100 ميكرولتر من 100 مللي مول NaBH 4 إلى المحلول من الخطوة4.6 ، رجه على الفور لخلط جيد ، واحتضانه لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
ملاحظة: قم بإعداد 100 مللي متر هيدروكسيد الصوديوم4 طازجة للاستخدام الفوري. بعد إضافة NaBH4 ، سيتحول لون المحلول تدريجيا إلى اللون الأحمر ثم يتعمق. إذا لم يلاحظ أي تغيير في اللون ، فهذا يشير إلى حد كبير إلى فشل التجربة. - استبدل المحلول ب 2 مل من المخزن المؤقت PBS-A لإيقاف التفاعل.
ملاحظة: يعد إيقاف التفاعل في غضون 30 دقيقة أمرا بالغ الأهمية ، لأن التفاعل المطول سيؤدي إلى تحطيم AuNPs تدريجيا.
5. تثبيت التجميد والتجميد بالضغط العالي (الشكل 1C-F)
ملاحظة: العينات هي HPF و FSF مرة أخرى ، والإجراء هو نفسه تقريبا كما هو موضح سابقا في القسم 2 والقسم 3 مع بعض التعديلات.
- تحضير 1 ٪ رابع أكسيد الأوزميوم و 0.1 ٪ خلات اليورانيل في الأسيتون (محلول FSF 3 ، مخفف من 4 ٪ رابع أكسيد الأوزميوم في الأسيتون و 10 ٪ خلات اليورانيل في الميثانول).
تنبيه: رابع أكسيد الأوزميوم وخلات اليورانيل هي مواد كيميائية شديدة السمية. يجب التعامل معها وفقا لإجراءات السلامة المناسبة والتخلص منها كنفايات كيميائية خطرة. - قم بتحميل العينات (مجموعات حامل قرص الياقوت) في الحاوية بمحلول FSF المجمد 3 تحت LN2 باستخدام زوج من الملقط المبرد مسبقا.
- انقل الحاوية إلى غرفة AFS المبردة مسبقا لمعالجة FSF عند -90 درجة مئوية ، وقم بتشغيل برنامج FSF على النحو التالي: احتفظ بها عند -90 درجة مئوية لمدة 8-10 ساعات ؛ ثم ، دافئة إلى -60 درجة مئوية في غضون 3 ساعات ؛ يحفظ عند -60 درجة مئوية لمدة 3 ساعات ؛ ثم ، دافئة إلى -30 درجة مئوية في غضون 3 ساعات ؛ يحفظ عند -30 درجة مئوية لمدة 3 ساعات ؛ ثم ، دافئة إلى 4 درجات مئوية في غضون 2 ساعة.
- عندما تصل درجة الحرارة إلى 4 درجات مئوية ، انقل العينات إلى غطاء الدخان ، واحتفظ بها في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة.
- يغسل بالأسيتون 3 مرات لمدة 15 دقيقة في كل مرة.
- الحفاظ على الأسيتون في درجة حرارة الغرفة لمدة 2 ساعة على الأقل.
6. تسلل الراتنج والتضمين والبلمرة
- تحضير خليط راتنجات الايبوكسي وفقا لتعليمات الشركة الصانعة قبل الاستخدام.
تنبيه: راتنجات الايبوكسي المستخدمة في التجربة الحالية سامة قبل البلمرة. يجب التعامل معها وفقا لإجراءات السلامة المناسبة. يجب التخلص من الراتنج غير المبلمر كنفايات كيميائية خطرة أو بلمرة قبل التخلص منه. - انقل أقراص الياقوت إلى كبسولات تضمين مسطحة القاع ، وتسربها بالراتنج لمدة 30 دقيقة على الأقل في درجة حرارة الغرفة.
ملاحظة: حافظ على الجوانب المحددة لأقراص الياقوت متجهة لأسفل. - بلمرة العينة على حرارة 60 درجة مئوية في فرن لمدة 18 ساعة على الأقل.
ملاحظة: يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتا هنا بعد البلمرة. يمكن تخزين كتل العينات المبلمرة في حاوية جافة لسنوات.
7. التقسيم فائق النحافة
- قم بقص كتل العينات المبلمرة بعناية باستخدام ماكينة حلاقة لكشف أقراص الياقوت.
- اغمس أطراف الكتلة بأقراص الياقوت في النيتروجين السائل لعدة ثوان ، وقم بإذابة الثلج في درجة حرارة الغرفة. كرر إجراء التجميد والذوبان عدة مرات لفصل الأقراص عن الكتل.
ملاحظة: تجنب التجميد لفترات طويلة ، لأن هذا قد يؤدي إلى تكسير كتل العينة. افصل أقراص الياقوت برفق بشفرة ، وتجنب القوة المفرطة ، والتي قد تتلف العينات. - قم بقص وجه الكتلة إلى شكل شبه منحرف للتقطيع فائق النحافة (الشكل 1G).
- احصل على مقاطع فائقة النحافة 70-100 نانومتر مع ميكروتوم فائق (الشكل 1H).
- اختر الأقسام الموجودة على شبكات نحاسية سداسية ذات 200 شبكة.
ملاحظة: يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتا هنا بعد التقسيم. يمكن تخزين الأقسام الموجودة على الأحزمة في حاوية جافة لسنوات. إذا رغبت في ذلك ، يمكن تلطيخ الأقسام الموجودة على الشبكات بأسيتون يورانيل 2٪ للحصول على تباين أفضل للغشاء. يجب تجنب تلطيخ الرصاص لأنه سيخفي إشارات الجسيمات النانوية.
8. التصوير TEM (الشكل 1I)
- افحص المقاطع فائقة الرقة على الشبكات النحاسية باستخدام المجهر الإلكتروني النافذ. عادة ما يكون نطاق التكبير من 11 kX إلى 30 kX مناسبا لتصور AuNPs في الخلايا ، وهناك حاجة إلى قيمة مناسبة لإلغاء التركيز لضمان رؤية 2-3 نانومتر AuNPs.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
تعد تقنية تخليق AuNP القائمة على ANSM أداة مفيدة للغاية لوضع العلامات والكشف عن البروتينات الموسومة ب MT باستخدام TEM26. للتحقق من متانتها في خلايا الثدييات ، تم إنشاء ثلاثة خطوط خلايا مستقرة تعبر عن EGFP-MTn-KDEL أو Ost4-EGFP-MTn أو Mito-acGFP-MTn في خلايا Hela. KDEL هو تسلسل احتفاظ / استرجاع للشبكة الإندوبلازمية C-terminal (ER) المتعارف عليه ، والذي يحافظ على بروتين الاندماج EGFP-MTn-KDEL داخل تجويف ER أو الفضاء حول النووي للغلاف النووي (NE). Ost4 هو وحدة فرعية من مجمع oligosaccharyltransferase ، وهو مركب بروتين غشائي موضعي في ER و NE يحفز N-glycosylation من عديد الببتيدات الوليدة. تواجه المحطة C لبروتين الاندماج Ost4 Ost4-EGFP-MTn العصارة الخلوية. ميتو هو تسلسل استهداف الميتوكوندريا الذي يستهدف بروتين الاندماج Mito-acGFP-MTn في مصفوفة الميتوكوندريا.
حافظ تحضير عينة HPF / FSF ، جنبا إلى جنب مع استخدام حمض التانيك وخلات اليورانيل بدلا من مثبتات الألدهيد ، على بنية تحتية ممتازة مع تباين غشاء جيد (الشكل 2 ، الشكل 3 ، والشكل 4). كان الهيكل العام للعينة كثيفا ، دون استخراج السيتوبلازم والدهون بشكل واضح. كان هيكل الغشاء سلسا ، دون تشوه واضح ، وتم الكشف بوضوح عن بنية طبقة الفوسفوليبيد المزدوجة.
بالإضافة إلى البنية التحتية المحفوظة جيدا ، لوحظ وضع العلامات الفعالة في جميع الحالات الثلاث التي تمثل خصائص عضية متميزة. ظهر بروتين EGFP-MTn-KDEL كجسيمات نانوية ذهبية بحجم 2-5 نانومتر موزعة حصريا في تجويف ER المحيطي وفي الفضاء حول النواة في NE (الشكل 2A-C). لم تمكن البنية التحتية المحفوظة جيدا من تحديد جزيء واحد للبروتينات الموسومة فحسب ، بل سهلت أيضا تحليل تفاعلات العضيات ، مثل تفاعلات ER-mitochondria (الشكل 2D ، E). حددت الجسيمات النانوية لبروتين Ost4-EGFP-MTn غشاء ER (الشكل 3A-D) والغشاء الخارجي ل NE (الشكل 3E). تم توزيع الجسيمات النانوية أيضا على الغشاء الداخلي للشمال الشرقي ، لكن عدد الجسيمات النانوية كان أقل من الغشاء الخارجي ، مما يشير إلى أن تكوين البروتين للأغشية الداخلية والخارجية كان مختلفا (الشكل 3E). وبالمثل ، أظهرت الخلايا المعبرة عن Mito-acGFP-MTn علامات محددة في مصفوفة الميتوكوندريا (الشكل 4A-E). لم يلاحظ أي جسيمات في الحويصلات أو ER (الشكل 4A-D) ، وتم عرض عدد قليل من الجسيمات في MVBs (الشكل 4D).
الشكل 1: مخطط سير عمل تقنية وضع العلامات المجهرية الإلكترونية القابلة للاستنساخ . (أ) توضع على أقراص الياقوت علامات وتعقيم لزراعة الخلايا. (ب) تزرع الخلايا على أقراص ياقوت في طبق استزراع 35 مم. (ج) أقراص الياقوت ذات الخلايا مغطاة بحاملات ألومنيوم بعمق 0.025 مم للتجميد عالي الضغط ، وتملأ المساحة الإضافية ب 1-سداديسين. (د) الخلايا مثبتة بالتبريد بواسطة عامل حماية الخلايا البشري. (ه) التثبيت بالتجميد والاستبدال. (F) الخطوات التخطيطية لتوليف AuNP القائم على ANSM. (ز) أقراص الياقوت مع الخلايا مدمجة في كبسولات تضمين مسطحة القاع. يتم قطع كتل الراتنج للتقسيم فائق النحافة. (H) يتم تقسيم كتل الراتنج المشذبة باستخدام ميكروتوم فائق. (I) يتم تصوير المقاطع فائقة الرقة باستخدام TEM. الاختصارات: ANSM = آلية قمع النوى الذاتية ؛ AuNP = جسيمات الذهب النانوية ؛ HPF = تجميد الضغط العالي ؛ FSF = تثبيت التجميد والاستبدال ؛ TEM = المجهر الإلكتروني النافذ. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: تخليق AuNP القائم على ANSM على EGFP-MTn-KDEL معبرا عنه في خلايا HeLa. (أ ، د) تظهر صور EM لمقطع بسمك 90 نانومتر من خلايا HeLa التي تعبر عن EGFP-MTn-KDEL AuNPs متراكمة على وجه التحديد في تجويف الشبكة الإندوبلازمية وفي الفضاء حول النواة للغلاف النووي. لوحظ وجود عدد قليل من الجسيمات في الميتوكوندريا أو الليزوزوم أو النواة أو العصارة الخلوية. (ب، ج) صور مكبرة لمناطق المستطيل الأحمر والأصفر، على التوالي، في (A). (ه) صورة مكبرة لمنطقة المستطيل الأخضر في (D). تم تعديل هذا الرقم من Jiang et al.26. أشرطة المقياس = (B ، C ، E) 200 نانومتر ؛ (أ ، د) 500 نانومتر. الاختصارات: ANSM = آلية قمع النوى الذاتية ؛ AuNP = جسيمات الذهب النانوية ؛ EGFP = بروتين الفلورسنت الأخضر المحسن ؛ ER = الشبكة الإندوبلازمية. NE = غلاف نووي ؛ م = الميتوكوندريا. ليسو = ليزوزوم. N = نواة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: تخليق AuNP القائم على ANSM على Ost4-EGFP-MTn معبرا عنه في خلايا HeLa. (أ-د) تظهر صور EM لمقطع بسمك 90 نانومتر من خلايا HeLa التي تعبر عن Ost4-EGFP-MTn AuNPs المتراكمة على وجه التحديد على غشاء الشبكة الإندوبلازمية. (ه) تظهر صورة EM لمقطع بسمك 90 نانومتر من خلايا HeLa يعبر عن Ost4-EGFP-MTn AuNPs المتراكمة خصيصا على غشاء NE (الغلاف النووي). لوحظ وجود عدد قليل من الجسيمات في الميتوكوندريا أو الليزوزوم أو النواة أو العصارة الخلوية. ( C) صورة مكبرة لمنطقة المستطيل الأحمر في (A). تم تعديل هذا الرقم من Jiang et al.26. أشرطة المقياس = (B-E) 200 نانومتر ؛ (أ) 500 نانومتر. الاختصارات: ANSM = آلية قمع النوى الذاتية ؛ AuNP = جسيمات الذهب النانوية ؛ EGFP = بروتين الفلورسنت الأخضر المحسن ؛ ER = الشبكة الإندوبلازمية. NE = غلاف نووي ؛ م = الميتوكوندريا. ليسو = ليزوزوم. N = نواة ؛ EM = المجهر الإلكتروني. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: تخليق AuNP القائم على ANSM على Mito-acGFP-MTn معبرا عنه في خلايا هيلا. (أ ، د ، ه) تظهر صور EM لمقطع بسمك 90 نانومتر من خلايا HeLa التي تعبر عن Mito-acGFP-MTn AuNPs المتراكمة على وجه التحديد في مصفوفة الميتوكوندريا (M). لوحظ وجود عدد قليل من الجسيمات في الشبكة الإندوبلازمية أو النواة أو الحويصلة أو الجسم متعدد الحويصلات أو العصارة الخلوية. (ب، ج) صورة مكبرة لمساحات المستطيل الأحمر والأصفر، على التوالي، في (A). تم تعديل هذا الرقم من Jiang et al.26. أشرطة المقياس = (D ، E) 200 نانومتر ؛ (ب ، ج) 500 نانومتر ؛ (أ) 1 ميكرومتر. الاختصارات: ANSM = آلية قمع النوى الذاتية ؛ AuNP = جسيمات الذهب النانوية ؛ EGFP = بروتين الفلورسنت الأخضر المحسن ؛ ER = الشبكة الإندوبلازمية. NE = غلاف نووي ؛ م = الميتوكوندريا. ليسو = ليزوزوم. N = نواة ؛ V = حويصلة ؛ MVB = جسم متعدد الحويصلات. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
تقدم الدراسة هنا تقنية قوية لوضع العلامات EM قابلة للاستنساخ لتصور جزيء واحد لجزيئات البروتين داخل البيئة الخلوية بدقة فائقة الهيكلية. توفر AuNPs التي تم تصنيعها مباشرة على علامات غنية بالسيستين المشفرة وراثيا توطينا واضحا ودقيقا للبروتينات المستهدفة. تحافظ تقنية التجميد والتجميد بالضغط العالي بشكل ممتاز على البنية التحتية للعينات البيولوجية. مجتمعة ، توفر تقنية وضع العلامات المجهرية الإلكترونية القابلة للاستنساخ المقدمة هنا أداة قوية للتوطين الفعال والتعرف على جزيء واحد في سياقات البنية الخلوية في الموقع مع EM.
تعمل آلية ANSM على قمع عملية النوى الذاتية لبوليمرات thiolate-Au (I)26 ، وهو تفاعل نموذجي في طريقة Brust-Schiffrin الكلاسيكية (BSM) 27 التي تستخدم على نطاق واسع لتجميع مجموعات الذهب النانوية المغطاة بالثيولات. لذلك ، يمكن لتقنية توليف AuNP القائمة على ANSM على وجه التحديد تجميع AuNPs بحجم 2-6 نانومتر مباشرة على علامات غنية بالسيستين كعلامات كثيفة الإلكترون لتصور EM مع نسبة إشارة إلى ضوضاء عالية وكفاءة عالية. على عكس تقنيات وضع العلامات APEX2 أو HPR التي تعتمد على ترسيب بوليمر DAB ، وهو غير قابل للعد وغير مناسب للبروتينات القابلة للذوبان في العصارة الخلوية ، فإن تقنية تخليق AuNP القائمة على ANSM هي التقنية الوحيدة التي تمكن من اكتشاف جزيء واحد حتى الآن.
عيب تقنية وضع العلامات المجهرية الإلكترونية القابلة للاستنساخ هو أن تقنية تخليق AuNP القائمة على ANSM تعتمد على نشاط مجموعة الثيول من السيستين ، وهي حساسة لمثبتات الألدهيد. تم إدخال الحماية المؤكسدة للثيول بواسطة حمض 3،3'-dithiodipropionic (DTDPA) قبل تثبيت الألدهيد في الإشريكية القولونية وخميرة الانشطار S. pombe ، مما أدى إلى مورفولوجيا جيدة وكفاءة ممتازة في وضع العلامات24،25،26. في هذا العمل ، عملت طريقة الأكسدة / التثبيت بشكل صحيح لتلك العلامات المعبر عنها في حجرة مؤكسدة نسبيا ، مثل تجويف ER ومصفوفة الميتوكوندريا (في خلايا EGFP-MTn-KDEL و Mito-acGFP-MTn). ومع ذلك ، كان دون المستوى الأمثل للعلامات الخلوية (Ost4-GFP-MTn) في خلايا الثدييات. قد يكون السبب هو أن العلامات الموجودة في مقصورات الاختزال ليست مطوية جيدا ، وأن المواد المختزلة مثل GSH الموجودة بكثرة في السيتوبلازم يمكن أن تقاوم الأكسدة.
تقنية HPF-FSF هي المعيار الذهبي في الحفاظ على البنية التحتية للعينات البيولوجية للمجهر الإلكتروني. في هذا العمل ، حققت طريقة HPF / FSF-rehydration-HPF / FSF ، التي تتجنب تماما التثبيت الكيميائي التقليدي والنفاذية ، وضع علامات فعالة باستخدام Ost4-GFP-MTn وأسفرت عن بنية خلية ممتازة. ومع ذلك ، لا تزال هذه الطريقة لها قيود معينة. أولا ، قد يؤدي HPF الثاني إلى تلف كبير في بلورات الجليد. ثانيا ، تعاني الدفعات المختلفة من أسيتات اليورانيل من مشاكل في الجودة غير المتسقة والذوبان. ظهرت الرواسب الحلقية أحيانا في العينات المعاد ترطيبها عند تصورها بواسطة المجهر الإلكتروني. قد يؤدي الغسل باستخدام المخزن المؤقت HEPES عند درجة الحموضة 5.5 إلى تخفيف هذه المشكلة. ثالثا ، يحتاج تحضير العينة لعينات الأنسجة إلى مزيد من التحسين.
في الختام ، تتيح تقنية وضع العلامات EM القابلة للاستنساخ ، والتي تجمع بين تقنية تخليق AuNP القائمة على ANSM وطريقة تحضير العينة ل HPF / FSF-rehydration-HPF / FSF ، تحديد جزيء واحد لا لبس فيه للبروتينات الموسومة وراثيا في الخلايا بواسطة المجهر الإلكتروني. وينبغي أن يسمح البروتوكول الحالي بمعالجة مجموعة هائلة من المسائل البيولوجية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ولا يعلن صاحب البلاغ عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
تم اشتقاق البروتوكول الموصوف هنا من المقالة التي نشرها Jiang et al. (2020). تم دعم هذا العمل بمنح من MOST (973 برنامجا رقم 2011CB812502 و 2014CB849902) وبدعم تمويلي من حكومة بلدية بكين.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.025 mm/0.275 mm Aluminum carrier | Beijing Wulundes Biotech Ltd., or Engineering Office of M. Wohlwend | ||
| 0.2 M HEPES buffer | Dissolve HEPES (0.2 M) in 980 mL of ddH2O, then add 10 mL of 100 mM MgCl2 and 10 mL of 100 mM CaCl2 (final concentration 1 mM), respectively, adjust pH to 5.5 | ||
| 1.5 mL MaxyClear snaplock microtube | Axygen Scientific | MCT150C | |
| 2 mL polypropylene screw cap microtubes | Biologix | 81-0204 | |
| 200 mesh hexagonal copper grid | Tedpella inc | G200HEX | |
| 2-mercaptoethanol | Amresco | 0482-250ML | |
| 35 mm cell culture dishes | Corning | 430165 | |
| 50 mL polypropylene centrifuge tubes | Corning | 430928 | |
| Acetone | Beiijng Tong Guang Fine Chemicals Company | 31025 | |
| Automated freeze substitution machine | Leica | AFS2 | |
| Customized 3.05 mm x 0.66 mm specimen holders for HPF | Beijing Wulundes Biotech Ltd. | ||
| D-penicillamine | TCI | P0147 | |
| Dulbecco’s modified Eagle medium | GBICO | C11965500BT | |
| Fetal bovine serum | GBICO | 10099-141C | |
| Flat bottom embedding capsule | Tedpella inc | ||
| Foam cryobox | |||
| Formvar 15/95 resin | Electron Microscopy Sciences | 15800 | |
| HAuCl4 | Sigma | 4022-1G | |
| HEPES | sigma | H3375-500G | |
| HPF machine | Wohlwend | HPF compact01 | |
| Methonal | Beiijng Tong Guang Fine Chemicals Company | 12397 | |
| NaBH4 | Sigma | 480886-25G | |
| OsO4 | Electron Microscopy Sciences | 19110 | |
| PBS-A buffer | Dissolve NaH2PO4 (1.125 mM), Na2HPO4 (3.867 mM), NaCl (100 mM) in 1 L of ddH2O, adjust to pH 7.4 | ||
| Qualitative filter paper (medium speed) | Beyotime Biotechnology | FFT08 | |
| Sapphire discs | Beijing Wulundes Biotech Ltd., or Engineering Office of M. Wohlwend | ||
| Solvent resistant pen | Electron Microscopy Sciences | 62053-B | |
| SPI-Pon 812 resin | SPI Inc | 02659-AB | |
| Transmission electron microscopy | FEI | Tecnai G2 spirit | |
| Trypsin-EDTA | GBICO | C25200-056 | |
| Tweezers | Dumont | ||
| Ultramictotome | Leica | FC7 | |
| Uranyl acetate | Electron Microscopy Sciences | 22400 |
References
- Tsien, R. Y.
- Shaner, N. C., Patterson, G. H., Davidson, M. W.
- Masters, B. R. History of the electron microscope in cell biology. Encylopedia of Life Sciences. , (2009).
- Griffiths, G., Hoppeler, H. Quantitation in immunocytochemistry: Correlation of immunogold labeling to absolute number of membrane antigens. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 34 (11), 1389-1398 (1986).
- Tokuyasu, K. T. A technique for ultracryotomy of cell suspensions and tissues. Journal of Cell Biology. 57 (2), 551-565 (1973).
- Connolly, C. N., Futter, C. E., Gibson, A., Hopkins, C. R., Cutler, D. F. Transport into and out of the Golgi complex studied by transfecting cells with cDNAs encoding horseradish peroxidase. Journal of Cell Biology. 127 (3), 641-652 (1994).
- Grabenbauer, M., et al. Correlative microscopy and electron tomography of GFP through photooxidation. Nature Methods. 2 (11), 857-862 (2005).
- Gaietta, G., et al. Multicolor and electron microscopic imaging of connexin trafficking. Science. 296 (5567), 503-507 (2002).
- Shu, X., et al. A genetically encoded tag for correlated light and electron microscopy of intact cells, tissues, and organisms. PLoS Biology. 9 (4), e1001041 (2011).
- Martell, J. D., et al. Engineered ascorbate peroxidase as a genetically encoded reporter for electron microscopy. Nature Biotechnology. 30 (11), 1143-1148 (2012).
- Lam, S. S., et al. Directed evolution of APEX2 for electron microscopy and proximity labeling. Nature Methods. 12 (1), 51-54 (2015).
- Mavlyutov, T. A., et al. APEX2-enhanced electron microscopy distinguishes sigma-1 receptor localization in the nucleoplasmic reticulum. Oncotarget. 8 (31), 51317-51330 (2017).
- Wang, Q., Mercogliano, C. P., Lowe, J. A ferritin-based label for cellular electron cryotomography. Structure. 19 (2), 147-154 (2011).
- Sano, T., Glazer, A. N., Cantor, C. R. A streptavidin-metallothionein chimera that allows specific labeling of biological materials with many different heavy metal ions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 89 (5), 1534-1538 (1992).
- Mercogliano, C. P., DeRosier, D. J. Gold nanocluster formation using metallothionein: Mass spectrometry and electron microscopy. Journal of Molecular Biology. 355 (2), 211-223 (2006).
- Mercogliano, C. P., DeRosier, D. J. Concatenated metallothionein as a clonable gold label for electron microscopy. Journal of Structural Biology. 160 (1), 70-82 (2007).
- Morphew, M. K., et al. Metallothionein as a clonable tag for protein localization by electron microscopy of cells. Journal of Microscopy. 260 (1), 20-29 (2015).
- Nishino, Y., Yasunaga, T., Miyazawa, A. A genetically encoded metallothionein tag enabling efficient protein detection by electron microscopy. Journal of Electron Microscopy. 56 (3), 93-101 (2007).
- Bouchet-Marquis, C., Pagratis, M., Kirmse, R., Hoenger, A. Metallothionein as a clonable high-density marker for cryo-electron microscopy. Journal of Structural Biology. 177 (1), 119-127 (2012).
- Fukunaga, Y., et al. Electron microscopic analysis of a fusion protein of postsynaptic density-95 and metallothionein in cultured hippocampal neurons. Journal of Electron Microscopy. 56 (4), 119-129 (2007).
- Diestra, E., Fontana, J., Guichard, P., Marco, S., Risco, C. Visualization of proteins in intact cells with a clonable tag for electron microscopy. Journal of Structural Biology. 165 (3), 157-168 (2009).
- Risco, C., et al. sensitive, high-resolution detection of protein molecules in eukaryotic cells using metal-tagging transmission electron microscopy. Structure. 20 (5), 759-766 (2012).
- Ding, S. -W., et al. Noncanonical role for the host Vps4 AAA+ ATPase ESCRT protein in the formation of tomato bushy stunt virus replicase. PLoS Pathogens. 10 (4), e1004087 (2014).
- Jiang, Z., et al. Direct synthesis of gold nanoparticles on cysteine-rich tags in yeast cells. Protocol Exchange. , (2020).
- Jiang, Z., et al. Direct synthesis of gold nanoparticles on cysteine-rich tags in mammalian cells. Protocol Exchange. , (2020).
- Jiang, Z., et al. Genetically encoded tags for direct synthesis of EM-visible gold nanoparticles in cells. Nature Methods. 17 (9), 937-946 (2020).
- Brust, M., Walker, M., Bethell, D., Schiffrin, D. J., Whyman, R. Synthesis of thiol-derivatised gold nanoparticles in a two-phase liquid-liquid system. Journal of the Chemical Society, Chemical Communications. 7, 801-802 (1994).
