Summary
הפרוטוקול הנוכחי מתאר טכנולוגיית תיוג מיקרוסקופיית אלקטרונים ניתנת לשיבוט לגילוי חלבונים מתויגים במתכות בתאים באמצעות טכניקת סינתזת ננו-חלקיקי זהב חדשנית המבוססת על מנגנון דיכוי אוטו-נוקלציה.
Abstract
ניתוח הלוקליזציה המדויקת של מולקולות חלבון בתאים בעלי רזולוציה אולטרה-מבנית הוא בעל משמעות רבה לחקר תהליכים פיזיולוגיים או פתולוגיים שונים בכל האורגניזמים החיים. לכן, הפיתוח של תגים ניתנים לשיבוט שיכולים לשמש כבדיקות מיקרוסקופיית אלקטרונים הוא בעל ערך רב, בדיוק כפי שחלבונים פלואורסצנטיים מילאו תפקיד מכריע בתחום הדימות האופטי. לאחרונה נחשף מנגנון דיכוי האוטונוקלציה (ANSM), המאפשר סינתזה ספציפית של ננו-חלקיקי זהב (AuNPs) על תגים עשירים בציסטאין, כגון מטלותיונין (MT) וחלבון נוגד קיפאון (AFP).
על בסיס ה-ANSM פותחה טכנולוגיית תיוג במיקרוסקופ אלקטרונים, המאפשרת זיהוי ספציפי של חלבונים מתויגים בתאים פרוקריוטים ואיקריוטים ביעילות תיוג חסרת תקדים. מחקר זה מדגים פרוטוקול לזיהוי חלבוני היתוך MTn (גרסה מהונדסת של MT החסרה שאריות אלדהיד-תגובתי) בתאי יונקים בעלי מבנה אולטרה-מבנה שמור היטב. בפרוטוקול זה, קיבוע הקפאה ותחליפי הקפאה בלחץ גבוה בוצע באמצעות קיבוע שאינו אלדהיד (כגון חומצה טאנית, אורניל אצטט) כדי לשמר מבנה אולטרה כמעט טבעי ולמנוע נזק לפעילות התג הנגרמת על ידי הצלבת אלדהיד.
התייבשות פשוטה בצעד אחד שימשה לפני סינתזת AuNP מבוססת ANSM. התוצאות הראו כי החלבונים המתויגים התמקדו באברונים שונים, כולל הממברנות והלומן של הרשתית האנדופלסמית (ER), ומטריצות מיטוכונדריאליות זוהו ביעילות וספציפיות גבוהות. מחקר זה מספק לביולוגים פרוטוקול חזק כדי לענות על מגוון עצום של שאלות ביולוגיות ברמת המולקולה הבודדת בהקשרים אולטרה-מבניים תאיים.
Introduction
בעידן הפוסט-גנומי, פיתוחו של חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) ככתב בעל מולקולה בודדת למיקרוסקופ אור חולל מהפכה בתחום המחקר המודרני במדעי החיים 1,2. במשך עשרות שנים, מיקרוסקופ אלקטרונים (EM) היה כלי רב עוצמה להתבוננות אינטואיטיבית באולטרה-מבנה התאי ברזולוציה ננומטרית3; עם זאת, הזיהוי והלוקליזציה המדויקים של מולקולות חלבון נותרו מאתגרים.
טכניקת התיוג הנפוצה ביותר של קרינה אלקטרומגנטית היא טכניקת התיוג במיקרוסקופ אימונואלקטרונים (IEM), המבוססת על תגובת האנטיגן-נוגדנים. עם זאת, למרות שפותחו טכניקות רבות בתחום התיוג IEM, כולל הטבעה מראש של IEM והטבעה לאחר הטבעה של IEM (על קטעי שרף או קריוסקציות לחות), הוא עדיין סובל מיעילות תיוג נמוכה (<10%)4,5, הקשורה להכנת הדגימה ואיכות הנוגדנים. כדי להתגבר על מגבלות אלה, לפיתוח תגים מקודדים גנטית יש פוטנציאל יישומי גדול.
שני סוגים עיקריים של תגי EM נחקרו ביסודיות בשנים האחרונות. סוג אחד הוא שיטת צביעת DAB, המשתמשת בתגים כגון APEX2 כדי לחמצן 3,3'-diaminobenzidine (DAB) לפולימרים אוסמיופיליים להדמיית EM 6,7,8,9,10,11,12. הוא מאפשר תיוג של חלבונים בשפע גבוה באזורים תת-תאיים, אך אינו מתאים לספירת מולקולות בודדות. הסוג השני משתמש בחלבונים קושרי מתכות, כגון פריטין 13 ומתלותיונין (MT)14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26, כדי ליצור מרבצי מתכת צפופים אלקטרונים ב situ עבור הדמיית EM. רק לאחרון יש פוטנציאל אמיתי להדמיה וספירה של מולקולה אחת. הגודל המולקולרי של פריטין גדול מדי (~ 450 kD) מכדי שניתן יהיה להשתמש בו כתג מבטיח, בעוד שהגודל הקטן (~ 5 kD) של MT ויכולתו לקשור יונים שונים דרך 20 הציסטאין שלו משכו תשומת לב רבה. מספר מעבדות ניסו לתייג חלבוני MT-fusion מטוהרים או תאים המבטאים MT על ידי דגירה ישירה עם Au+. ניסיונות אלה הוכיחו בתחילה כי תגי MT יכולים לקשור יוני זהב ליצירת אותות בעלי ניגודיות גבוהה, אך אף אחד מהם לא באמת השיג את הזיהוי היעיל של חלבונים בודדים בתאים, והם אינם ישימים באופן נרחב 14,15,16,17,18,19,20,21,22,23.
טכניקת הסינתזה AuNP מבוססת ANSM, הכוללת סינתזה של AuNPs בגודל 2-6 ננומטר ישירות על תגים עשירים בציסטאין (למשל, MT, גרסאות MT MTn ו- MTα, AFP) כתוויות צפופות אלקטרונים להדמיית EM, היא הגישה האמינה והישימה הראשונה לתיוג חלבונים וזיהוי מולקולות בודדות בתאים24,25,26. הוא מאפשר סינתזה ספציפית של AuNPs על חלבוני היתוך תגים מבודדים והשיג יעילות תיוג חסרת תקדים בתאים פרוקריוטים לא קבועים או קבועים כימית (E. coli) ואיקריוטים (S. pombe). עם זאת, יישום אותו פרוטוקול במערכות מתקדמות יותר כגון תאי יונקים או אפילו רקמות כרוך באתגרים נוספים, כגון הומאוסטזיס חיזור תוך-תאי מורכב יותר ומבנה תאי שברירי יותר.
מחקר זה מציג טכנולוגיית תיוג EM הניתנת לשיבוט, המשלבת את טכניקת הסינתזה החדשנית מבוססת ANSM AuNP לתיוג תגים עשירים בציסטאין מקודדים גנטית (MT) עם שיטת הכנת הדגימות HPF/FSF-rehydration-HPF/FSF, מאפשרת זיהוי חד-משמעי של מולקולות בודדות של חלבונים מתויגים בקרום ER, לומן ER ומטריצת מיטוכונדריה בתאי HeLa. השיטה הנוכחית משלבת מאפיינים של יעילות תיוג גבוהה, יחס אות לרעש גבוה, תיוג של מולקולה בודדת ואוניברסליות חזקה, ולשיטה זו יש סיכויי יישום רחבים במחקר מדעי החיים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל החומרים המשמשים בניסוי זה מפורטים בטבלת החומרים. זרימת העבודה שלב אחר שלב של הפרוטוקול הנוכחי מוצגת באיור 1.
1. תרבית תאים על דיסקיות ספיר
- מעבירים דיסקיות ספיר בגודל 3 מ"מ x 0.16 מ"מ לצינור צנטריפוגה בנפח 2 מ"ל המכיל 1 מ"ל אתנול, ומשמיעים אותן בשואב על-קולי למשך 10 דקות.
- צרוב כל דיסק ספיר בלהבת מנורת אלכוהול עד שאין משקעים נראים לעין על פני השטח.
הערה: באמצעות השיטה לעיל, ניתן למחזר דיסקיות ספיר פעמים רבות. - תייגו צד אחד של כל דיסק ספיר במספר באמצעות עט עמיד בפני ממסים (איור 1A).
הערה: עט הסימון שבו נעשה שימוש צריך להיבדק כדי לקבוע מראש אם הוא עמיד לממיסי אצטון ומתנול כדי למנוע אובדן סימנים. - הניחו את דיסקיות הספיר המסומנות בתחתית צלחת תרבית בקוטר 35 מ"מ כשהצד המסומן פונה כלפי מעלה.
- יש לעקר את צלחת תרבית התאים עם דיסקיות ספיר תחת אור UV למשך 30 דקות.
- הפכו את דיסקיות הספיר בפינצטה (הצד המסומן פונה כלפי מטה), ועיקרו תחת אור UV למשך 30 דקות נוספות. כעת, צלחת התרבית המכילה את דיסקיות הספיר מוכנה לתרבית תאים.
הערה: ניתן לעקר את דיסקיות הספיר גם על ידי אוטוקלאבינג. - זרעו את התאים על דיסקות הספיר שהוכנו למעלה, וגדלו למפגש של 80%-90% באינקובטור של תאים בטמפרטורה של 37°C, 95% לחות ו-5%CO2 (איור 1B).
הערה: קווי תאי HeLa יציבים המבטאים תגי MTn נוצרו כמתואר ב- Jiang et al.26.
2. הקפאה בלחץ גבוה (HPF)
זהירות: חנקן נוזלי משמש בניסוי זה. בעת עבודה עם חנקן נוזלי, השתמש בנוהלי בטיחות נאותים ובציוד מגן אישי כדי למנוע כוויות קור וחנק.
- הכינו את מכונת ההקפאה בלחץ גבוה לפחות שעתיים לפני הניסוי בהתאם להוראות היצרן.
- העבר נושאי אלומיניום HPF מסוג A (הפסקה: 0.025/0.275 מ"מ) לצינור צנטריפוגה של 2 מ"ל המכיל 1 מ"ל אתנול, וסוניקט בשואב קולי למשך 10 דקות.
- יבשו את המנשאים בכלי פטרי מכוסה בנייר סינון איכותי (מהירות בינונית).
- השרו את המנשאים המנוקים מראש ב-1-hexadecene.
הערה: BSA אינו מומלץ כמגן קריופרוטקטיבי בניסוי הנוכחי מכיוון שהוא יפריע לסינתזה של ננו-חלקיקי זהב לאחר מכן. - השתמש בפינצטה עדינה כדי להרים דיסק ספיר עם תאים מצלחת התרבית; גע במשטח המסומן בנייר סינון איכותי (מהירות בינונית) כדי להסיר את המדיום העודף.
הערה: המוליכות התרמית של המים נמוכה מאוד, ויותר מדי מים שיוריים ישפיעו על אפקט ההקפאה. שמרו על כמות מינימלית של מים כדי למנוע מהתאים להתייבש. - הרכיבו את דיסק הספיר במחזיק דגימות HPF, וכסו במהירות את הדיסק עם נשא אלומיניום בעומק 0.025 מ"מ המכיל 1-הקסדצן (איור 1C).
- שאפו לפתרון עודף עם נייר סינון איכותי (מהירות בינונית).
- טען את מחזיק הדגימה להקפאה בלחץ גבוה (איור 1D).
הערה: תהליך טעינת הדגימה צריך להיות מהיר ככל האפשר (תוך דקה) כדי למזער שינויים פיזיולוגיים עקב שינויים בטמפרטורה, לחות, pH ותכולת החמצן. - פרקו את מכלול נושא דיסק הספיר תחת חנקן נוזלי בקופסת הקפאה מוקצף, ואחסנו את המכלול בקריוביאל בחנקן נוזלי לפני השימוש.
הערה: ייתכן שהפרוטוקול יושהה כאן. הדגימות בקריובלים יכולות להיות מאוחסנות בחנקן נוזלי במשך שנים.
3. קיבוע תחליפי הקפאה (FSF) והתייבשות (איור 1E)
- מלאו את מכונת החלפת ההקפאה האוטומטית (AFS) בחנקן נוזלי, וקררו את התא לטמפרטורה של -90°C.
זהירות: חנקן נוזלי משמש בניסוי זה. בעת עבודה עם חנקן נוזלי, השתמש בנוהלי בטיחות נאותים ובציוד מגן אישי כדי למנוע כוויות קור וחנק. - הכינו 2 מ"ל של 0.01% חומצה טאנית (w/v) באצטון (תמיסת FSF 1) במיכל פוליפרופילן עגול בקוטר 20 מ"מ (איור 1E) במכסה אדים והקפיאו אותו בחנקן נוזלי.
- טען את הדגימות (מכלולי נושאי דיסק ספיר) לתוך המיכל עם תמיסת FSF קפואה 1 תחת LN2 באמצעות זוג פינצטה מקוררת מראש.
- העבר את המכל לתא AFS מקורר מראש לעיבוד FSF ב -90 ° C.
- שמור את הדגימות ב -90 ° C למשך 1 שעות; לאחר מכן, הפרידו את דיסקיות הספיר מהמנשאים באמצעות פינצטה מקוררת מראש, וודאו שהצדדים המסומנים של דיסקיות הספיר פונים כלפי מטה.
הערה: הפינצטה חייבת להיות מקוררת מספיק כדי למנוע שינויי טמפרטורה. דיסקיות הספיר צריכות להיות מופרדות בקלות. - שמור ב -90 ° C למשך 8-10 שעות נוספות; לאחר מכן, חם ל -60 ° C בתוך 3 שעות.
- החלף את תמיסת FSF 1 במיכל באצטון מקורר מראש, ודגר במשך שעה אחת. חזור על שטיפת אצטון זו 2x.
- חם ל -30 ° C בתוך 3 שעות. במהלך תקופה זו, להכין מראש 2 מ"ל של 0.01% אורניל אצטט באצטון (תמיסת FSF 2, מדולל מ 10% אורניל אצטט מתנול) בצינור צנטריפוגה 2 מ"ל.
זהירות: אורניל אצטט, המשמש בניסוי הנוכחי, הוא רדיואקטיבי ורעיל מאוד; יש לטפל בה על פי נהלי בטיחות נאותים ולסלק אותה כפסולת כימית מסוכנת. - החליפו את האצטון בתמיסת FSF 2, ודגרו בטמפרטורה של -30°C למשך 3 שעות.
- החלף את תמיסת FSF 2 במיכל באצטון מקורר מראש, ודגר במשך 30 דקות ב -30 ° C. חזור על שטיפת אצטון זו 2x.
- חם מ -30 ° C ל 4 ° C בתוך 2 שעות.
- החלף את האצטון ב-2 מ"ל של חיץ HEPES 0.2 M המכיל 1 mM CaCl 2 ו-1 mM MgCl2 ב-pH 5.5.
- החליפו את החיץ פעם אחת, ודגרו בטמפרטורת החדר למשך שעה אחת או ב-4 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
הערה: ניתן להשהות את הפרוטוקול כאן למשך לילה אחד או להמשיך למשך 6 שעות לפחות עד שהדגימות יוקפאו שוב בשלב 5.
4. סינתזת AuNP מבוססת ANSM עבור תאי יונקים (איור 1F)
- יש לשטוף עם חיץ PBS-A 3 פעמים למשך 5 דקות בכל פעם.
- מעבירים את דיסקיות הספיר לצלחת תרבית בקוטר 35 מ"מ המכילה 1 מ"ל של חיץ PBS-A בטמפרטורת החדר.
הערה: שמור תמיד את הצדדים המסומנים של דיסקיות הספיר פונים כלפי מטה, והימנע מחפיפה בין דיסקיות הספיר ומשפשוף התאים. - הכינו את התמיסה להפחתה על ידי הוספת 4.28 מיקרוליטר של 2-מרקפטואתנול לצינור צנטריפוגה של 2 מ"ל המכיל 1 מ"ל של חיץ PBS-A וערבוב היטב במכסה אדים.
זהירות: 2-מרקפטואתנול רעיל ובעל ריח חריף; יש לטפל בו על פי נהלי בטיחות נאותים. - החלף את חיץ PBS-A בצלחת התרבית ב- 1 מ"ל של תמיסה מפחיתה ודגר במשך שעה אחת בטמפרטורת החדר.
- הכינו את קודמן הזהב לפני השימוש.
- הוסף 80 μL של 10 mM HAuCl4 ב ddH 2 O לתוך צינור צנטריפוגה2מ"ל המכיל 1 מ"ל של תמיסה מחזרים, ומיד מערבולת.
הערה: הפתרון עשוי להיות מעונן. - הוסף 80 μL של 500 mM D-פניצילאמין ב ddH2O לתוך הפתרון לעיל, ומיד מערבולת.
הערה: הפתרון עשוי להתברר שוב.
- הוסף 80 μL של 10 mM HAuCl4 ב ddH 2 O לתוך צינור צנטריפוגה2מ"ל המכיל 1 מ"ל של תמיסה מחזרים, ומיד מערבולת.
- החלף את התמיסה בצלחת התרבית בתמיסת מבשר זהב 1 מ"ל שהוכנה בשלב 4.5, ודגר במשך שעתיים ב -4 מעלות צלזיוס.
הערה: מיליליטר אחד של קודמן הזהב מספיק כדי להגיב עם כ 1 × 106 תאים (מפגש על צלחת 35 מ"מ). נפחים גדולים יותר של המבשר נדרשים כאשר AuNPs הופכים קטנים משמעותית. - שוקלים 0.0038 גרם של NaBH 4 לתוך צינור צנטריפוגה של 1.5 מ"ל, מוסיפים 1 מ"ל של ddH2O קר כקרח, ומערבלים כדי ליצור 100 mM NaBH4 טריים ממש לפני השימוש.
- מוסיפים 20-100 μL של 100 mM NaBH 4 לתמיסה משלב4.6 , מנערים מיד כדי לערבב היטב, ודגרים במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
הערה: יש להכין 100 mM NaBH4 טרי לשימוש מיידי. לאחר הוספת NaBH4, צבע התמיסה יהפוך בהדרגה לאדום ולאחר מכן יעמיק. אם לא נצפה שינוי צבע, זה בעיקר מצביע על כך שהניסוי נכשל. - החלף את התמיסה עם 2 מ"ל של מאגר PBS-A כדי לעצור את התגובה.
הערה: עצירת התגובה תוך 30 דקות היא קריטית, מכיוון שתגובה ממושכת תפרק בהדרגה את ה- AuNPs.
5. קיבוע הקפאה והקפאה בלחץ גבוה (איור 1C-F)
הערה: הדגימות הן HPF ו- FSF שוב, וההליך כמעט זהה לזה שתואר קודם לכן בסעיף 2 ובסעיף 3 עם כמה שינויים.
- הכינו 1% אוסמיום טטרוקסיד ו-0.1% אורניל אצטט באצטון (תמיסת FSF 3, מדוללת מ-4% אוסמיום טטרוקסיד באצטון ו-10% אורניל אצטט במתנול).
זהירות: אוסמיום טטרוקסיד ואורניל אצטט הם כימיקלים רעילים ביותר; יש לטפל בהם על פי נהלי בטיחות נאותים ולהשליכם כפסולת כימית מסוכנת. - טען את הדגימות (מכלולי נושאי דיסק ספיר) לתוך המיכל עם תמיסת FSF קפואה 3 תחת LN2 באמצעות זוג פינצטה מקוררת מראש.
- העבר את המיכל לתא AFS מקורר מראש לעיבוד FSF ב- -90 °C, והפעל את תוכנית FSF באופן הבא: שמור ב -90 ° C למשך 8-10 שעות; לאחר מכן, חם ל -60 ° C בתוך 3 שעות; שמור ב -60 ° C במשך 3 שעות; לאחר מכן, חם ל -30 ° C בתוך 3 שעות; שמור ב -30 ° C במשך 3 שעות; לאחר מכן, חם ל 4 °C בתוך 2 שעות.
- כאשר הטמפרטורה מגיעה ל -4 מעלות צלזיוס, העבירו את הדגימות למכסה האדים, ושמרו בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות.
- יש לשטוף עם אצטון 3 פעמים במשך 15 דקות בכל פעם.
- יש לשמור באצטון בטמפרטורת החדר למשך שעתיים לפחות.
6. חדירת שרף, הטמעה ופילמור
- יש להכין את תערובת שרף האפוקסי בהתאם להוראות היצרן לפני השימוש.
זהירות: שרף האפוקסי המשמש בניסוי הנוכחי רעיל לפני פילמור; יש לטפל בו על פי נהלי בטיחות נאותים. יש להשליך שרף לא פולימרי כפסולת כימית מסוכנת או פולימרי לפני השלכתו. - מעבירים את דיסקיות הספיר לקפסולות הטבעה בעלות תחתית שטוחה, ומסתננות עם שרף למשך 30 דקות לפחות בטמפרטורת החדר.
הערה: שמור את הצדדים המסומנים של דיסקיות הספיר פונים כלפי מטה. - פילמרי הדגימה ב 60 ° C בתנור לפחות 18 שעות.
הערה: ניתן להשהות את הפרוטוקול כאן לאחר פילמור. גושי דגימה פולימריים יכולים להיות מאוחסנים במיכל יבש במשך שנים.
7. חתך דק במיוחד
- חתכו בזהירות את גושי הדגימה הפולימריים באמצעות סכין גילוח כדי לחשוף את דיסקיות הספיר.
- טובלים את קצות הבלוק עם דיסקיות ספיר בחנקן נוזלי למשך מספר שניות, ומפשירים בטמפרטורת החדר. חזור על פעולת ההקפאה-הפשרה מספר פעמים כדי לנתק את הדיסקים מהבלוקים.
הערה: הימנע מהקפאה ממושכת, מכיוון שהדבר עלול לסדוק את גושי הדגימה. נתקו בעדינות את דיסקיות הספיר בעזרת להב, תוך הימנעות מכוח מוגזם, שעלול לפגוע בדגימות. - חתכו את פני הבלוק לצורה טרפזית לקבלת חתך אולטרה-דק (איור 1G).
- השיגו מקטעים אולטרה-דקים של 70-100 ננומטר עם אולטרה-מיקרוטום (איור 1H).
- בחר את המקטעים ברשתות נחושת משושות של 200 רשת.
הערה: ניתן להשהות את הפרוטוקול כאן לאחר הסעיף. את החלקים על החגורות ניתן לאחסן במיכל יבש במשך שנים. אם תרצה, ניתן לצבוע את החלקים ברשתות עם 2% אורניל אצטון כדי להשיג ניגודיות טובה יותר של הממברנה. יש להימנע מכתמי עופרת מכיוון שהם יסוו את אותות חלקיקי הננו-זהב.
8. הדמיית TEM (איור 1I)
- בחנו את המקטעים הדקים במיוחד ברשתות נחושת באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים תמסורת. בדרך כלל, טווח הגדלה בין 11 kX ל- 30 kX מתאים להדמיה של AuNPs בתאים, ויש צורך בערך ביטול מיקוד מתאים כדי להבטיח ש- AuNPs של 2-3 ננומטר גלויים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
טכניקת הסינתזה AuNP מבוססת ANSM היא כלי שימושי ביותר לתיוג וזיהוי חלבונים מתויגים MT עם TEM26. כדי לאמת את חוסנו בתאי יונקים, נוצרו שלושה קווי תאים יציבים המבטאים EGFP-MTn-KDEL, Ost4-EGFP-MTn או Mito-acGFP-MTn בתאי הלה. KDEL הוא רצף שמירה/אחזור קנוני של רשתית אנדופלסמית C-terminal (ER), השומר על חלבון ההיתוך EGFP-MTn-KDEL בתוך לומן המיון או החלל הפרי-גרעיני של המעטפת הגרעינית (NE). Ost4 היא תת-יחידה של קומפלקס אוליגוסכרילטרנספראז, שהוא קומפלקס חלבוני ממברנה הממוקם במיון וב- NE המזרז את N-גליקוזילציה של פוליפפטידים מתהווים. מסוף C של חלבון ההיתוך Ost4 Ost4-EGFP-MTn פונה לציטוזול. מיטו הוא רצף מיקוד מיטוכונדריאלי המכוון לחלבון ההיתוך Mito-acGFP-MTn במטריצה המיטוכונדריאלית.
הכנת דגימת HPF/FSF, בשילוב עם שימוש בחומצה טאנית ואורניל אצטט במקום מקבעי אלדהיד, שימרו מבנה אולטרה מעולה עם ניגודיות טובה בין הממברנות (איור 2, איור 3 ואיור 4). המבנה הכללי של הדגימה היה צפוף, ללא ציטופלסמה ברורה ומיצוי שומנים. מבנה הממברנה היה חלק, ללא עיוות ברור, והמבנה הדו-שכבתי של הפוספוליפידים נחשף בבירור.
בנוסף למבנה העל שהשתמר היטב, נצפתה תיוג יעיל בכל שלושת המקרים המייצגים ייחודיות אברונים מובהקת. חלבון EGFP-MTn-KDEL הופיע כננו-חלקיקי זהב בגודל 2-5 ננומטר המופצים באופן בלעדי בלומן ההיקפי של חדר המיון ובמרחב הפרי-גרעיני של NE (איור 2A-C). מבנה העל שהשתמר היטב לא רק איפשר זיהוי של מולקולה אחת של חלבונים מתויגים, אלא גם הקל על ניתוח אינטראקציות אברונים, כגון אינטראקציות ER-מיטוכונדריה (איור 2D,E). ננו-חלקיקים של חלבון Ost4-EGFP-MTn תיארו את קרום ה-ER (איור 3A-D) ואת הקרום החיצוני של NE (איור 3E). ננו-חלקיקים התפזרו גם על הממברנה הפנימית של NE, אולם מספר הננו-חלקיקים שם היה נמוך יותר מאשר על הממברנה החיצונית, מה שמצביע על כך שהרכב החלבונים של הממברנה הפנימית והחיצונית היה שונה (איור 3E). באופן דומה, התאים המבטאים את המיטו-acGFP-MTn הציגו תיוג ספציפי במטריצה המיטוכונדריאלית (איור 4A-E). לא נצפו חלקיקים בשלפוחיות או בחדר המיון (איור 4A-D), וחלקיקים מעטים נראו ב-MVB (איור 4D).
איור 1: סכימה לזרימת העבודה של טכנולוגיית התיוג של מיקרוסקופ אלקטרונים הניתן לשיבוט . (A) דיסקיות ספיר מסומנות ומעוקרות לתרבית תאים. (B) תאים גדלים על דיסקיות ספיר בצלחת תרבית של 35 מ"מ. (C) דיסקיות הספיר עם התאים מכוסות בנושאי אלומיניום בעומק 0.025 מ"מ להקפאה בלחץ גבוה, והחלל הנוסף מלא בהקסדקן אחד. (D) התאים מוקפאים על ידי HPF. (ה) קיבוע הקפאה-החלפה. (F) השלבים הסכמטיים של סינתזת AuNP מבוססת ANSM. (G) דיסקיות הספיר עם התאים מוטמעות בקפסולות הטבעה שטוחות. גושי השרף גזורים לחתך דק במיוחד. (H) גושי השרף החתוכים מחולקים באולטרה-מיקרוטום. (I) החלקים הדקים במיוחד מצולמים באמצעות TEM. קיצורים: ANSM = מנגנון דיכוי אוטונוקלציה; AuNP = ננו-חלקיק זהב; HPF = הקפאה בלחץ גבוה; FSF = קיבוע הקפאה-החלפה; TEM = מיקרוסקופ אלקטרונים תמסורת. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: סינתזת AuNP מבוססת ANSM על EGFP-MTn-KDEL המבוטאת בתאי HeLa. (A,D) תמונות EM של קטע בעובי 90 ננומטר של תאי HeLa המבטאים EGFP-MTn-KDEL מראות AuNPs שהצטברו במיוחד בלומן של הרשתית האנדופלסמית ובחלל הפרי-גרעיני של מעטפת הגרעין. חלקיקים מעטים נצפים במיטוכונדריה, בליזוזום, בגרעין או בציטוזול. (ב,ג) תמונות מוגדלות של אזורי המלבן האדום והצהוב, בהתאמה, ב- (A). (E) תמונה מוזדלת של אזור המלבן הירוק ב-(D). נתון זה שונה מ-Jiang et al.26. פסי קנה מידה = (B,C,E) 200 ננומטר; (A,D) 500 ננומטר. קיצורים: ANSM = מנגנון דיכוי אוטונוקלציה; AuNP = ננו-חלקיק זהב; EGFP = חלבון פלואורסצנטי ירוק משופר; ER = רשתית אנדופלסמית; NE = מעטפת גרעינית; M = מיטוכונדריה; ליזו = ליזוזום; N = גרעין. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: סינתזת AuNP מבוססת ANSM על Ost4-EGFP-MTn המבוטאת בתאי HeLa. (A-D) תמונות EM של קטע בעובי 90 ננומטר של תאי HeLa המבטאים Ost4-EGFP-MTn מראות AuNPs שהצטברו במיוחד על הממברנה של הרשתית האנדופלסמית. (E) תמונת EM של קטע בעובי 90 ננומטר של תאי HeLa המבטא Ost4-EGFP-MTn מראה AuNPs שהצטברו במיוחד על הממברנה של NE (מעטפת גרעינית). חלקיקים מעטים נצפים במיטוכונדריה, בליזוזום, בגרעין או בציטוזול. (C) תמונה מוגדלת של אזור המלבן האדום ב-(A). נתון זה שונה מ-Jiang et al.26. פסי קנה מידה = (B-E) 200 ננומטר; (א) 500 ננומטר. קיצורים: ANSM = מנגנון דיכוי אוטונוקלציה; AuNP = ננו-חלקיק זהב; EGFP = חלבון פלואורסצנטי ירוק משופר; ER = רשתית אנדופלסמית; NE = מעטפת גרעינית; M = מיטוכונדריה; ליזו = ליזוזום; N = גרעין; EM = מיקרוסקופ אלקטרונים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: סינתזת AuNP מבוססת ANSM על Mito-acGFP-MTn המבוטאת בתאי HeLa. (A,D,E) תמונות EM של קטע בעובי 90 ננומטר של תאי HeLa המבטאים Mito-acGFP-MTn מראות AuNPs שהצטברו במיוחד במטריצה של המיטוכונדריה (M). חלקיקים מעטים נצפים ברשתית האנדופלסמית, בגרעין, בשלפוחית, בגוף הרב-שלפוחית או בציטוזול. (ב,ג) תמונה מוקטנת של אזורי המלבן האדום והצהוב, בהתאמה, ב- (A). נתון זה שונה מ-Jiang et al.26. פסי קנה מידה = (D,E) 200 ננומטר; (ב,ג) 500 ננומטר; (A) 1 מיקרומטר. קיצורים: ANSM = מנגנון דיכוי אוטונוקלציה; AuNP = ננו-חלקיק זהב; EGFP = חלבון פלואורסצנטי ירוק משופר; ER = רשתית אנדופלסמית; NE = מעטפת גרעינית; M = מיטוכונדריה; ליזו = ליזוזום; N = גרעין; V = שלפוחית; MVB = גוף רב-שלפוחיתי. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
המחקר מציג כאן טכנולוגיית תיוג EM חזקה הניתנת לשיבוט להדמיית מולקולות בודדות של מולקולות חלבון בסביבה התאית עם רזולוציה אולטרה-מבנית. AuNPs המסונתזים ישירות על תגים עשירים בציסטאין המקודדים גנטית מספקים לוקליזציה חד משמעית ומדויקת של חלבוני המטרה. טכניקת הקפאה והחלפת הקפאה בלחץ גבוה משמרת בצורה מצוינת את מבנה העל של דגימות ביולוגיות. יחד, טכנולוגיית התיוג של מיקרוסקופ אלקטרונים משובט המוצגת כאן מספקת כלי רב עוצמה ללוקליזציה יעילה וזיהוי של מולקולה בודדת בהקשרים אולטרה-מבניים תאיים באתרם עם EM.
מנגנון ANSM מדכא את תהליך האוטונוקלציה של פולימרים תיולאט-Au(I)26, שהיא תגובה אופיינית בשיטת Brust-Schiffrin הקלאסית (BSM)27 הנמצאת בשימוש נרחב לסינתזה של ננו-צבירי זהב בעלי תיאולט. לכן, טכניקת הסינתזה AuNP מבוססת ANSM יכולה לסנתז באופן ספציפי AuNPs בגודל 2-6 ננומטר ישירות על תגים עשירים בציסטאין כתוויות צפופות אלקטרונים להדמיית EM עם יחס אות לרעש גבוה ויעילות גבוהה. שלא כמו טכניקות תיוג APEX2 או HPR המסתמכות על שקיעת פולימר DAB, שאינה ניתנת לספור ואינה מתאימה לחלבונים מסיסים בציטוזול, טכניקת הסינתזה AuNP מבוססת ANSM היא הטכניקה היחידה המאפשרת זיהוי של מולקולה בודדת עד כה.
החיסרון של טכנולוגיית התיוג של מיקרוסקופ אלקטרונים משובט הוא שטכניקת הסינתזה AuNP מבוססת ANSM מסתמכת על הפעילות של קבוצת תיול של ציסטאין, הרגישה לקיבוע אלדהיד. ההגנה החמצונית של תיולים על ידי חומצה 3,3'-dithiodipropionic (DTDPA) הוצגה לפני קיבוע אלדהיד ב- E. coli ובשמרי הביקוע S. pombe, וכתוצאה מכך מורפולוגיה טובה ויעילות תיוג מצוינת24,25,26. בעבודה זו, שיטת החמצון/קיבוע פעלה כראוי עבור תגים המתבטאים בתא חמצוני יחסית, כגון לומן ER ומטריצת מיטוכונדריה (בתאי EGFP-MTn-KDEL ו-Mito-acGFP-MTn). עם זאת, הוא היה תת-אופטימלי עבור תגים ציטוסוליים (Ost4-GFP-MTn) בתאי יונקים. הסיבה עשויה להיות כי התגים בתאי ההפחתה אינם מקופלים היטב, והחומרים המחזרים כגון GSH הנמצאים בשפע בציטופלסמה יכולים להתנגד לחמצון.
טכניקת HPF-FSF היא תקן הזהב בשימור אולטרה-סטרוקטורלי של דגימות ביולוגיות למיקרוסקופ אלקטרונים. בעבודה זו, השיטה של HPF/FSF-rehydration-HPF/FSF, אשר נמנעת לחלוטין את הקיבוע הכימי הקונבנציונאלי וחדירה, השיגה תיוג יעיל עם Ost4-GFP-MTn והניבה מבנה תאים מעולה. עם זאת, שיטה זו עדיין יש מגבלות מסוימות. ראשית, HPF שני עלול להוביל לנזק משמעותי לגבישי קרח. שנית, לאצוות שונות של אורניל אצטט יש בעיות באיכות ומסיסות לא עקביות. משקעים אציקולריים הופיעו מדי פעם בדגימות המיובשות כאשר דמיינו זאת במיקרוסקופ אלקטרונים. שטיפה עם חיץ HEPES ב pH 5.5 עשוי להקל על בעיה זו. שלישית, הכנת הדגימה לדגימות רקמה זקוקה לאופטימיזציה נוספת.
לסיכום, טכנולוגיית הסימון האלקטרומגנטית הניתנת לשיבוט, המשלבת את טכניקת הסינתזה AuNP מבוססת ANSM עם שיטת הכנת הדגימות של HPF/FSF-rehydration-HPF/FSF, מאפשרת זיהוי חד-משמעי של מולקולות בודדות של חלבונים מתויגים גנטית בתאים במיקרוסקופ אלקטרונים. הפרוטוקול הנוכחי אמור לאפשר מענה למגוון עצום של שאלות ביולוגיות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחבר מצהיר כי אין ניגוד עניינים.
Acknowledgments
הפרוטוקול המתואר כאן נגזר מהמאמר שפורסם על ידי Jiang et al. (2020). עבודה זו נתמכה על ידי מענקים של MOST (973 תוכניות מס '2011CB812502 ו 2014CB849902) ועל ידי מימון תמיכה מהממשלה העירונית בייג'ינג.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.025 mm/0.275 mm Aluminum carrier | Beijing Wulundes Biotech Ltd., or Engineering Office of M. Wohlwend | ||
| 0.2 M HEPES buffer | Dissolve HEPES (0.2 M) in 980 mL of ddH2O, then add 10 mL of 100 mM MgCl2 and 10 mL of 100 mM CaCl2 (final concentration 1 mM), respectively, adjust pH to 5.5 | ||
| 1.5 mL MaxyClear snaplock microtube | Axygen Scientific | MCT150C | |
| 2 mL polypropylene screw cap microtubes | Biologix | 81-0204 | |
| 200 mesh hexagonal copper grid | Tedpella inc | G200HEX | |
| 2-mercaptoethanol | Amresco | 0482-250ML | |
| 35 mm cell culture dishes | Corning | 430165 | |
| 50 mL polypropylene centrifuge tubes | Corning | 430928 | |
| Acetone | Beiijng Tong Guang Fine Chemicals Company | 31025 | |
| Automated freeze substitution machine | Leica | AFS2 | |
| Customized 3.05 mm x 0.66 mm specimen holders for HPF | Beijing Wulundes Biotech Ltd. | ||
| D-penicillamine | TCI | P0147 | |
| Dulbecco’s modified Eagle medium | GBICO | C11965500BT | |
| Fetal bovine serum | GBICO | 10099-141C | |
| Flat bottom embedding capsule | Tedpella inc | ||
| Foam cryobox | |||
| Formvar 15/95 resin | Electron Microscopy Sciences | 15800 | |
| HAuCl4 | Sigma | 4022-1G | |
| HEPES | sigma | H3375-500G | |
| HPF machine | Wohlwend | HPF compact01 | |
| Methonal | Beiijng Tong Guang Fine Chemicals Company | 12397 | |
| NaBH4 | Sigma | 480886-25G | |
| OsO4 | Electron Microscopy Sciences | 19110 | |
| PBS-A buffer | Dissolve NaH2PO4 (1.125 mM), Na2HPO4 (3.867 mM), NaCl (100 mM) in 1 L of ddH2O, adjust to pH 7.4 | ||
| Qualitative filter paper (medium speed) | Beyotime Biotechnology | FFT08 | |
| Sapphire discs | Beijing Wulundes Biotech Ltd., or Engineering Office of M. Wohlwend | ||
| Solvent resistant pen | Electron Microscopy Sciences | 62053-B | |
| SPI-Pon 812 resin | SPI Inc | 02659-AB | |
| Transmission electron microscopy | FEI | Tecnai G2 spirit | |
| Trypsin-EDTA | GBICO | C25200-056 | |
| Tweezers | Dumont | ||
| Ultramictotome | Leica | FC7 | |
| Uranyl acetate | Electron Microscopy Sciences | 22400 |
References
- Tsien, R. Y.
- Shaner, N. C., Patterson, G. H., Davidson, M. W.
- Masters, B. R. History of the electron microscope in cell biology. Encylopedia of Life Sciences. , (2009).
- Griffiths, G., Hoppeler, H. Quantitation in immunocytochemistry: Correlation of immunogold labeling to absolute number of membrane antigens. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 34 (11), 1389-1398 (1986).
- Tokuyasu, K. T. A technique for ultracryotomy of cell suspensions and tissues. Journal of Cell Biology. 57 (2), 551-565 (1973).
- Connolly, C. N., Futter, C. E., Gibson, A., Hopkins, C. R., Cutler, D. F. Transport into and out of the Golgi complex studied by transfecting cells with cDNAs encoding horseradish peroxidase. Journal of Cell Biology. 127 (3), 641-652 (1994).
- Grabenbauer, M., et al. Correlative microscopy and electron tomography of GFP through photooxidation. Nature Methods. 2 (11), 857-862 (2005).
- Gaietta, G., et al. Multicolor and electron microscopic imaging of connexin trafficking. Science. 296 (5567), 503-507 (2002).
- Shu, X., et al. A genetically encoded tag for correlated light and electron microscopy of intact cells, tissues, and organisms. PLoS Biology. 9 (4), e1001041 (2011).
- Martell, J. D., et al. Engineered ascorbate peroxidase as a genetically encoded reporter for electron microscopy. Nature Biotechnology. 30 (11), 1143-1148 (2012).
- Lam, S. S., et al. Directed evolution of APEX2 for electron microscopy and proximity labeling. Nature Methods. 12 (1), 51-54 (2015).
- Mavlyutov, T. A., et al. APEX2-enhanced electron microscopy distinguishes sigma-1 receptor localization in the nucleoplasmic reticulum. Oncotarget. 8 (31), 51317-51330 (2017).
- Wang, Q., Mercogliano, C. P., Lowe, J. A ferritin-based label for cellular electron cryotomography. Structure. 19 (2), 147-154 (2011).
- Sano, T., Glazer, A. N., Cantor, C. R. A streptavidin-metallothionein chimera that allows specific labeling of biological materials with many different heavy metal ions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 89 (5), 1534-1538 (1992).
- Mercogliano, C. P., DeRosier, D. J. Gold nanocluster formation using metallothionein: Mass spectrometry and electron microscopy. Journal of Molecular Biology. 355 (2), 211-223 (2006).
- Mercogliano, C. P., DeRosier, D. J. Concatenated metallothionein as a clonable gold label for electron microscopy. Journal of Structural Biology. 160 (1), 70-82 (2007).
- Morphew, M. K., et al. Metallothionein as a clonable tag for protein localization by electron microscopy of cells. Journal of Microscopy. 260 (1), 20-29 (2015).
- Nishino, Y., Yasunaga, T., Miyazawa, A. A genetically encoded metallothionein tag enabling efficient protein detection by electron microscopy. Journal of Electron Microscopy. 56 (3), 93-101 (2007).
- Bouchet-Marquis, C., Pagratis, M., Kirmse, R., Hoenger, A. Metallothionein as a clonable high-density marker for cryo-electron microscopy. Journal of Structural Biology. 177 (1), 119-127 (2012).
- Fukunaga, Y., et al. Electron microscopic analysis of a fusion protein of postsynaptic density-95 and metallothionein in cultured hippocampal neurons. Journal of Electron Microscopy. 56 (4), 119-129 (2007).
- Diestra, E., Fontana, J., Guichard, P., Marco, S., Risco, C. Visualization of proteins in intact cells with a clonable tag for electron microscopy. Journal of Structural Biology. 165 (3), 157-168 (2009).
- Risco, C., et al. sensitive, high-resolution detection of protein molecules in eukaryotic cells using metal-tagging transmission electron microscopy. Structure. 20 (5), 759-766 (2012).
- Ding, S. -W., et al. Noncanonical role for the host Vps4 AAA+ ATPase ESCRT protein in the formation of tomato bushy stunt virus replicase. PLoS Pathogens. 10 (4), e1004087 (2014).
- Jiang, Z., et al. Direct synthesis of gold nanoparticles on cysteine-rich tags in yeast cells. Protocol Exchange. , (2020).
- Jiang, Z., et al. Direct synthesis of gold nanoparticles on cysteine-rich tags in mammalian cells. Protocol Exchange. , (2020).
- Jiang, Z., et al. Genetically encoded tags for direct synthesis of EM-visible gold nanoparticles in cells. Nature Methods. 17 (9), 937-946 (2020).
- Brust, M., Walker, M., Bethell, D., Schiffrin, D. J., Whyman, R. Synthesis of thiol-derivatised gold nanoparticles in a two-phase liquid-liquid system. Journal of the Chemical Society, Chemical Communications. 7, 801-802 (1994).
