細胞内EM可視金ナノ粒子の直接合成によるタンパク質局在解析(英語)
Summary
本プロトコルは、新規自己核生成抑制機構に基づく金ナノ粒子合成技術を用いて細胞内のメタロチオネインタグ付きタンパク質を検出するためのクローン可能な電子顕微鏡標識技術を記載する。
Abstract
細胞内のタンパク質分子の正確な局在を微細構造分解能で分析することは、すべての生物におけるさまざまな生理学的または病理学的プロセスの研究にとって非常に重要です。したがって、蛍光タンパク質が光イメージングの分野で重要な役割を果たしてきたように、電子顕微鏡プローブとして使用できるクローンタグの開発は大きな価値があります。最近、自己核生成抑制機構(ANSM)が明らかになり、メタロチオネイン(MT)や不凍タンパク質(AFP)などのシステインリッチタグ上の金ナノ粒子(AuNP)の特異的合成が可能になりました。
ANSMに基づいて、電子顕微鏡標識技術が開発され、前例のない標識効率で原核細胞および真核細胞内のタグ付きタンパク質の特異的検出が可能になりました。この研究は、微細構造が良好に保存されている哺乳類細胞におけるMTn(アルデヒド反応性残基を欠く改変されたMT変異体)融合タンパク質を検出するためのプロトコルを示しています。このプロトコルでは、非アルデヒド固定剤(タンニン酸、酢酸ウラニルなど)を使用して高圧凍結および凍結置換固定を行い、天然に近い微細構造を維持し、アルデヒド架橋によって引き起こされるタグ活性の損傷を回避しました。
ANSMベースのAuNP合成の前に、単純なワンステップ再水和を使用しました。その結果、タグ付きタンパク質は、小胞体(ER)の膜や内腔を含むさまざまな細胞小器官を標的とし、ミトコンドリアマトリックスが高効率かつ特異性で検出されたことが示されました。この研究は、生物学者に、細胞の微細構造の文脈における単一分子レベルでの膨大な範囲の生物学的問題に対処するための堅牢なプロトコルを提供します。
Introduction
ポストゲノム時代には、光学顕微鏡用の単一分子レポーターとしての緑色蛍光タンパク質(GFP)の開発は、現代の生命科学研究の分野に革命をもたらしました1,2。何十年もの間、電子顕微鏡(EM)は、ナノスケールの分解能で細胞の微細構造を直感的に観察するための強力なツールでした3。しかし、タンパク質分子の正確な同定と局在化は依然として困難です。
最も一般的に使用されるEM標識技術は、抗原抗体反応に基づく免疫電子顕微鏡(IEM)標識技術です。しかし、IEMラベリングの分野では、プレエンベディングIEMやポストエンベディングIEM(樹脂切片または水和凍結切片上)など、多くの技術が開発されていますが、サンプル調製と抗体の品質に関連する低いラベディング効率(<10%)4,5に悩まされています。これらの制限を克服するために、遺伝的にコード化されたタグの開発は大きな応用の可能性を秘めています。
近年、EMタグには主に2つのタイプが徹底的に調査されています。1つのタイプはDAB染色法であり、APEX2などのタグを利用して3,3′-ジアミノベンジジン(DAB)を浸透親和性ポリマーに酸化し、EM可視化6,7,8,9,10,11,12を行います。細胞内領域の高存在量のタンパク質の標識は可能ですが、単一分子の計数には適していません。他のタイプは、フェリチン13やメタロチオネイン(MT)14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26などの金属結合タンパク質を利用して、電子密度の高い金属堆積物を生成します。 EMの可視化のための現場。後者だけが、単一分子の視覚化とカウントの真の可能性を秘めています。フェリチンの分子サイズは、有望なタグとして使用するには大きすぎる(~450 kD)が、MTのサイズが小さい(~5 kD)ことと、20個のシステインを介してさまざまなイオンと結合する能力が大きな注目を集めています。いくつかのラボでは、Au+と直接インキュベートすることにより、精製されたMT融合タンパク質またはMT発現細胞を標識しようとしました。これらの試みは、MTタグが金イオンに結合して高コントラストシグナルを形成できることを最初に証明しましたが、細胞内の個々のタンパク質の効果的な同定を実際に達成したものはなく、広く適用できません14,15,16,17,18,19,20,21,22,23。
ANSMベースのAuNP合成技術は、システインリッチタグ(例えば、MT、MT変異体MTnおよびMTα、AFP)上に2〜6 nmサイズのAuNPをEM可視化用の電子密度の高い標識として直接合成することを含み、細胞におけるタンパク質標識および単一分子検出のための最初の信頼性が高く適用可能なアプローチです24,25,26.単離されたタグ融合タンパク質上でのAuNPの特異的合成を可能にし、非固定または化学的に固定された原核生物(大腸菌)および真核生物(S.ポンベ)細胞で前例のない標識効率を達成しました。しかし、哺乳類細胞や組織などのより高度なシステムで同じプロトコルを実装するには、より複雑な細胞内酸化還元恒常性やより脆弱な細胞構造など、追加の課題が伴います。
この研究では、遺伝的にコードされたシステインリッチタグ(MT)を標識するための新しいANSMベースのAuNP合成技術とHPF / FSF再水和-HPF / FSFサンプル調製法を組み合わせたクローン可能なEM標識技術を提示し、HeLa細胞の小胞体膜、小胞体内腔、およびミトコンドリアマトリックス内のタグ付きタンパク質の明確な単一分子同定を可能にします。現在の方法は、高い標識効率、高いS/N比、単一分子標識、および強力な普遍性の特性を兼ね備えており、この方法はライフサイエンス研究への幅広い応用の見通しがあります。
Protocol
Representative Results
Discussion
本研究では、細胞環境内のタンパク質分子を微細構造分解能で1分子可視化するための堅牢なクローン性EM標識技術を紹介します。遺伝的にコードされたシステインリッチタグ上で直接合成されたAuNPは、標的タンパク質の明確で正確な局在化を提供します。高圧凍結および凍結置換技術は、生物学的サンプルの微細構造を良好に保存します。まとめると、ここで紹介するクローン型電子顕微鏡…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ここに記載されているプロトコルは、Jiangら(2020)によって公開された記事から導き出されました。この作業は、MOST(973プログラム番号2011CB812502および2014CB849902)からの助成金と北京市政府からの資金援助によって支援されました。
Materials
| 0.025 mm/0.275 mm Aluminum carrier | Beijing Wulundes Biotech Ltd., or Engineering Office of M. Wohlwend | ||
| 0.2 M HEPES buffer | Dissolve HEPES (0.2 M) in 980 mL of ddH2O, then add 10 mL of 100 mM MgCl2 and 10 mL of 100 mM CaCl2 (final concentration 1 mM), respectively, adjust pH to 5.5 | ||
| 1.5 mL MaxyClear snaplock microtube | Axygen Scientific | MCT150C | |
| 2 mL polypropylene screw cap microtubes | Biologix | 81-0204 | |
| 200 mesh hexagonal copper grid | Tedpella inc | G200HEX | |
| 2-mercaptoethanol | Amresco | 0482-250ML | |
| 35 mm cell culture dishes | Corning | 430165 | |
| 50 mL polypropylene centrifuge tubes | Corning | 430928 | |
| Acetone | Beiijng Tong Guang Fine Chemicals Company | 31025 | |
| Automated freeze substitution machine | Leica | AFS2 | |
| Customized 3.05 mm x 0.66 mm specimen holders for HPF | Beijing Wulundes Biotech Ltd. | ||
| D-penicillamine | TCI | P0147 | |
| Dulbecco’s modified Eagle medium | GBICO | C11965500BT | |
| Fetal bovine serum | GBICO | 10099-141C | |
| Flat bottom embedding capsule | Tedpella inc | ||
| Foam cryobox | |||
| Formvar 15/95 resin | Electron Microscopy Sciences | 15800 | |
| HAuCl4 | Sigma | 4022-1G | |
| HEPES | sigma | H3375-500G | |
| HPF machine | Wohlwend | HPF compact01 | |
| Methonal | Beiijng Tong Guang Fine Chemicals Company | 12397 | |
| NaBH4 | Sigma | 480886-25G | |
| OsO4 | Electron Microscopy Sciences | 19110 | |
| PBS-A buffer | Dissolve NaH2PO4 (1.125 mM), Na2HPO4 (3.867 mM), NaCl (100 mM) in 1 L of ddH2O, adjust to pH 7.4 | ||
| Qualitative filter paper (medium speed) | Beyotime Biotechnology | FFT08 | |
| Sapphire discs | Beijing Wulundes Biotech Ltd., or Engineering Office of M. Wohlwend | ||
| Solvent resistant pen | Electron Microscopy Sciences | 62053-B | |
| SPI-Pon 812 resin | SPI Inc | 02659-AB | |
| Transmission electron microscopy | FEI | Tecnai G2 spirit | |
| Trypsin-EDTA | GBICO | C25200-056 | |
| Tweezers | Dumont | ||
| Ultramictotome | Leica | FC7 | |
| Uranyl acetate | Electron Microscopy Sciences | 22400 |
References
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