Direkte syntese av EM-synlige gullnanopartikler i celler for proteinlokaliseringsanalyse med godt bevart ultrastruktur
Summary
Den nåværende protokollen beskriver en klonbar elektronmikroskopimerkingsteknologi for å oppdage metallothionein-merkede proteiner i celler ved hjelp av en ny autonukleasjonsundertrykkelsesmekanismebasert gullnanopartikkelsynteseteknikk.
Abstract
Analyse av nøyaktig lokalisering av proteinmolekyler i celler med ultrastrukturell oppløsning er av stor betydning for studiet av ulike fysiologiske eller patologiske prosesser i alle levende organismer. Derfor er utviklingen av klonbare koder som kan brukes som elektronmikroskopiprober av stor verdi, akkurat som fluorescerende proteiner har spilt en avgjørende rolle innen optisk bildebehandling. Autonukleasjonsundertrykkelsesmekanismen (ANSM) ble nylig avdekket, noe som muliggjør den spesifikke syntesen av gullnanopartikler (AuNP) på cysteinrike koder, som metallothionein (MT) og frostvæskeprotein (AFP).
Basert på ANSM ble det utviklet en elektronmikroskopisk merkingsteknologi som muliggjør spesifikk deteksjon av merkede proteiner i prokaryote og eukaryote celler med en enestående merkingseffektivitet. Denne studien illustrerer en protokoll for påvisning av MTn (en konstruert MT-variant som mangler aldehydreaktive rester) fusjonsproteiner i pattedyrceller med godt bevart ultrastruktur. I denne protokollen ble høytrykksfrysing og frysesubstitusjonsfiksering utført ved bruk av ikke-aldehydfikseringsmidler (som garvesyre, uranylacetat) for å bevare nær-naturlig ultrastruktur og unngå skade på merkeaktiviteten forårsaket av aldehyd-tverrbinding.
En enkel ett-trinns rehydrering ble brukt før den ANSM-baserte AuNP-syntesen. Resultatene viste at de merkede proteinene målrettet mot forskjellige organeller, inkludert membranene og lumen i endoplasmatisk retikulum (ER), og mitokondrielle matriser ble detektert med høy effektivitet og spesifisitet. Denne forskningen gir biologer en robust protokoll for å løse et enormt spekter av biologiske spørsmål på enkeltmolekylnivå i cellulære ultrastrukturelle sammenhenger.
Introduction
I postgenomisk tid har utviklingen av grønt fluorescerende protein (GFP) som en enkeltmolekylær reporter for lysmikroskopi revolusjonert feltet moderne livsvitenskapsforskning 1,2. I flere tiår har elektronmikroskopi (EM) vært et kraftig verktøy for intuitivt å observere den cellulære ultrastrukturen med nanoskalaoppløsning3; Den nøyaktige identifiseringen og lokaliseringen av proteinmolekyler er imidlertid fortsatt utfordrende.
Den mest brukte EM-merkingsteknikken er merkingsteknikken for immunelektronmikroskopi (IEM), som er basert på antigen-antistoffreaksjonen. Selv om mange teknikker er utviklet innen IEM-merking, inkludert pre-embedding IEM og post-embedding IEM (på harpiksseksjoner eller hydrerte kryoseksjoner), lider den imidlertid fortsatt av lav merkingseffektivitet (<10%)4,5, som er relatert til prøvepreparering og antistoffkvalitet. For å overvinne disse begrensningene har utvikling av genetisk kodede koder stort applikasjonspotensial.
To hovedtyper av EM-koder har blitt grundig utforsket de siste årene. En type er DAB-fargemetoden, som bruker tagger som APEX2 for å oksidere 3,3′-diaminobenzidin (DAB) til osmiofile polymerer for EM-visualisering 6,7,8,9,10,11,12. Det muliggjør merking av proteiner med høy overflod i subcellulære regioner, men er ikke egnet for telling av enkeltmolekyler. Den andre typen benytter metallbindende proteiner, slik som ferritin 13 og metallothionein (MT) 14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26, for å generere elektrontette metallavsetninger i situ for EM-visualisering. Bare sistnevnte har reelt potensial for enkeltmolekylvisualisering og telling. Den molekylære størrelsen på ferritin er for stor (~ 450 kD) for at den skal brukes som en lovende tag, mens den lille størrelsen (~ 5 kD) av MT og dens evne til å binde forskjellige ioner gjennom sine 20 cysteiner har tiltrukket seg stor oppmerksomhet. Flere laboratorier har forsøkt å merke rensede MT-fusjonsproteiner eller MT-uttrykkende celler ved å inkubere direkte med Au +. Disse forsøkene har i utgangspunktet vist at MT-tagger kan binde gullioner for å danne signaler med høy kontrast, men ingen har virkelig oppnådd effektiv identifisering av individuelle proteiner i celler, og de er ikke allment anvendelige 14,15,16,17,18,19,20,21,22,23.
Den ANSM-baserte AuNP-synteseteknikken, som innebærer syntetisering av 2-6 nm-størrelse AuNPs direkte på cysteinrike koder (f.eks. MT, MT-variantene MTn og MTα, AFP) som elektrontette etiketter for EM-visualisering, er den første pålitelige og anvendelige tilnærmingen for proteinmerking og enkeltmolekyldeteksjon i celler24,25,26. Det muliggjør den spesifikke syntesen av AuNPs på isolerte tagfusjonsproteiner og har oppnådd en enestående merkingseffektivitet i ikke-faste eller kjemisk faste prokaryote (E. coli) og eukaryote (S. pombe) celler. Imidlertid innebærer implementering av samme protokoll i mer avanserte systemer som pattedyrceller eller vev ytterligere utfordringer, for eksempel den mer komplekse intracellulære redokshomeostasen og mer skjøre cellulære strukturer.
Denne studien presenterer en klonbar EM-merkingsteknologi, som kombinerer den nye ANSM-baserte AuNP-synteseteknikken for merking av genetisk kodede cysteinrike koder (MT) med HPF / FSF-rehydrering-HPF / FSF-prøveprepareringsmetoden, muliggjør entydig enkeltmolekylidentifikasjon av merkede proteiner i ER-membranen, ER-lumen og mitokondriematrise i HeLa-celler. Den nåværende metoden kombinerer egenskapene til høy merkingseffektivitet, et høyt signal-støy-forhold, enkeltmolekylmerking og sterk universalitet, og denne metoden har brede applikasjonsutsikter innen livsvitenskapsforskning.
Protocol
Representative Results
Discussion
Studien presenterer her en robust klonbar EM-merkingsteknologi for enkeltmolekylvisualisering av proteinmolekyler i det cellulære miljøet med ultrastrukturell oppløsning. AuNPene direkte syntetisert på genetisk kodede cysteinrike koder gir entydig og presis lokalisering av målproteinene. Høytrykksfrysing og frysesubstitusjonsteknikk bevarer utmerket ultrastrukturen til biologiske prøver. Til sammen gir den klonbare elektronmikroskopimerkingsteknologien som presenteres her, et kraftig verktøy for effektiv lokalise…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Protokollen beskrevet her er hentet fra artikkelen publisert av Jiang et al. (2020). Dette arbeidet ble støttet av tilskudd fra MOST (973 programmer nr. 2011CB812502 og 2014CB849902) og ved finansieringsstøtte fra Beijing kommunestyre.
Materials
| 0.025 mm/0.275 mm Aluminum carrier | Beijing Wulundes Biotech Ltd., or Engineering Office of M. Wohlwend | ||
| 0.2 M HEPES buffer | Dissolve HEPES (0.2 M) in 980 mL of ddH2O, then add 10 mL of 100 mM MgCl2 and 10 mL of 100 mM CaCl2 (final concentration 1 mM), respectively, adjust pH to 5.5 | ||
| 1.5 mL MaxyClear snaplock microtube | Axygen Scientific | MCT150C | |
| 2 mL polypropylene screw cap microtubes | Biologix | 81-0204 | |
| 200 mesh hexagonal copper grid | Tedpella inc | G200HEX | |
| 2-mercaptoethanol | Amresco | 0482-250ML | |
| 35 mm cell culture dishes | Corning | 430165 | |
| 50 mL polypropylene centrifuge tubes | Corning | 430928 | |
| Acetone | Beiijng Tong Guang Fine Chemicals Company | 31025 | |
| Automated freeze substitution machine | Leica | AFS2 | |
| Customized 3.05 mm x 0.66 mm specimen holders for HPF | Beijing Wulundes Biotech Ltd. | ||
| D-penicillamine | TCI | P0147 | |
| Dulbecco’s modified Eagle medium | GBICO | C11965500BT | |
| Fetal bovine serum | GBICO | 10099-141C | |
| Flat bottom embedding capsule | Tedpella inc | ||
| Foam cryobox | |||
| Formvar 15/95 resin | Electron Microscopy Sciences | 15800 | |
| HAuCl4 | Sigma | 4022-1G | |
| HEPES | sigma | H3375-500G | |
| HPF machine | Wohlwend | HPF compact01 | |
| Methonal | Beiijng Tong Guang Fine Chemicals Company | 12397 | |
| NaBH4 | Sigma | 480886-25G | |
| OsO4 | Electron Microscopy Sciences | 19110 | |
| PBS-A buffer | Dissolve NaH2PO4 (1.125 mM), Na2HPO4 (3.867 mM), NaCl (100 mM) in 1 L of ddH2O, adjust to pH 7.4 | ||
| Qualitative filter paper (medium speed) | Beyotime Biotechnology | FFT08 | |
| Sapphire discs | Beijing Wulundes Biotech Ltd., or Engineering Office of M. Wohlwend | ||
| Solvent resistant pen | Electron Microscopy Sciences | 62053-B | |
| SPI-Pon 812 resin | SPI Inc | 02659-AB | |
| Transmission electron microscopy | FEI | Tecnai G2 spirit | |
| Trypsin-EDTA | GBICO | C25200-056 | |
| Tweezers | Dumont | ||
| Ultramictotome | Leica | FC7 | |
| Uranyl acetate | Electron Microscopy Sciences | 22400 |
References
- Tsien, R. Y. The green fluorescent protein. Annual Review of Biochemistry. 67, 509-544 (1998).
- Shaner, N. C., Patterson, G. H., Davidson, M. W. Advances in fluorescent protein technology. Journal of Cell Science. 120, 4247-4260 (2007).
- Masters, B. R. History of the electron microscope in cell biology. Encylopedia of Life Sciences. , (2009).
- Griffiths, G., Hoppeler, H. Quantitation in immunocytochemistry: Correlation of immunogold labeling to absolute number of membrane antigens. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 34 (11), 1389-1398 (1986).
- Tokuyasu, K. T. A technique for ultracryotomy of cell suspensions and tissues. Journal of Cell Biology. 57 (2), 551-565 (1973).
- Connolly, C. N., Futter, C. E., Gibson, A., Hopkins, C. R., Cutler, D. F. Transport into and out of the Golgi complex studied by transfecting cells with cDNAs encoding horseradish peroxidase. Journal of Cell Biology. 127 (3), 641-652 (1994).
- Grabenbauer, M., et al. Correlative microscopy and electron tomography of GFP through photooxidation. Nature Methods. 2 (11), 857-862 (2005).
- Gaietta, G., et al. Multicolor and electron microscopic imaging of connexin trafficking. Science. 296 (5567), 503-507 (2002).
- Shu, X., et al. A genetically encoded tag for correlated light and electron microscopy of intact cells, tissues, and organisms. PLoS Biology. 9 (4), e1001041 (2011).
- Martell, J. D., et al. Engineered ascorbate peroxidase as a genetically encoded reporter for electron microscopy. Nature Biotechnology. 30 (11), 1143-1148 (2012).
- Lam, S. S., et al. Directed evolution of APEX2 for electron microscopy and proximity labeling. Nature Methods. 12 (1), 51-54 (2015).
- Mavlyutov, T. A., et al. APEX2-enhanced electron microscopy distinguishes sigma-1 receptor localization in the nucleoplasmic reticulum. Oncotarget. 8 (31), 51317-51330 (2017).
- Wang, Q., Mercogliano, C. P., Lowe, J. A ferritin-based label for cellular electron cryotomography. Structure. 19 (2), 147-154 (2011).
- Sano, T., Glazer, A. N., Cantor, C. R. A streptavidin-metallothionein chimera that allows specific labeling of biological materials with many different heavy metal ions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 89 (5), 1534-1538 (1992).
- Mercogliano, C. P., DeRosier, D. J. Gold nanocluster formation using metallothionein: Mass spectrometry and electron microscopy. Journal of Molecular Biology. 355 (2), 211-223 (2006).
- Mercogliano, C. P., DeRosier, D. J. Concatenated metallothionein as a clonable gold label for electron microscopy. Journal of Structural Biology. 160 (1), 70-82 (2007).
- Morphew, M. K., et al. Metallothionein as a clonable tag for protein localization by electron microscopy of cells. Journal of Microscopy. 260 (1), 20-29 (2015).
- Nishino, Y., Yasunaga, T., Miyazawa, A. A genetically encoded metallothionein tag enabling efficient protein detection by electron microscopy. Journal of Electron Microscopy. 56 (3), 93-101 (2007).
- Bouchet-Marquis, C., Pagratis, M., Kirmse, R., Hoenger, A. Metallothionein as a clonable high-density marker for cryo-electron microscopy. Journal of Structural Biology. 177 (1), 119-127 (2012).
- Fukunaga, Y., et al. Electron microscopic analysis of a fusion protein of postsynaptic density-95 and metallothionein in cultured hippocampal neurons. Journal of Electron Microscopy. 56 (4), 119-129 (2007).
- Diestra, E., Fontana, J., Guichard, P., Marco, S., Risco, C. Visualization of proteins in intact cells with a clonable tag for electron microscopy. Journal of Structural Biology. 165 (3), 157-168 (2009).
- Risco, C., et al. sensitive, high-resolution detection of protein molecules in eukaryotic cells using metal-tagging transmission electron microscopy. Structure. 20 (5), 759-766 (2012).
- Ding, S. -. W., et al. Noncanonical role for the host Vps4 AAA+ ATPase ESCRT protein in the formation of tomato bushy stunt virus replicase. PLoS Pathogens. 10 (4), e1004087 (2014).
- Jiang, Z., et al. Direct synthesis of gold nanoparticles on cysteine-rich tags in yeast cells. Protocol Exchange. , (2020).
- Jiang, Z., et al. Direct synthesis of gold nanoparticles on cysteine-rich tags in mammalian cells. Protocol Exchange. , (2020).
- Jiang, Z., et al. Genetically encoded tags for direct synthesis of EM-visible gold nanoparticles in cells. Nature Methods. 17 (9), 937-946 (2020).
- Brust, M., Walker, M., Bethell, D., Schiffrin, D. J., Whyman, R. Synthesis of thiol-derivatised gold nanoparticles in a two-phase liquid-liquid system. Journal of the Chemical Society, Chemical Communications. 7, 801-802 (1994).
