Summary
Den nåværende protokollen beskriver en klonbar elektronmikroskopimerkingsteknologi for å oppdage metallothionein-merkede proteiner i celler ved hjelp av en ny autonukleasjonsundertrykkelsesmekanismebasert gullnanopartikkelsynteseteknikk.
Abstract
Analyse av nøyaktig lokalisering av proteinmolekyler i celler med ultrastrukturell oppløsning er av stor betydning for studiet av ulike fysiologiske eller patologiske prosesser i alle levende organismer. Derfor er utviklingen av klonbare koder som kan brukes som elektronmikroskopiprober av stor verdi, akkurat som fluorescerende proteiner har spilt en avgjørende rolle innen optisk bildebehandling. Autonukleasjonsundertrykkelsesmekanismen (ANSM) ble nylig avdekket, noe som muliggjør den spesifikke syntesen av gullnanopartikler (AuNP) på cysteinrike koder, som metallothionein (MT) og frostvæskeprotein (AFP).
Basert på ANSM ble det utviklet en elektronmikroskopisk merkingsteknologi som muliggjør spesifikk deteksjon av merkede proteiner i prokaryote og eukaryote celler med en enestående merkingseffektivitet. Denne studien illustrerer en protokoll for påvisning av MTn (en konstruert MT-variant som mangler aldehydreaktive rester) fusjonsproteiner i pattedyrceller med godt bevart ultrastruktur. I denne protokollen ble høytrykksfrysing og frysesubstitusjonsfiksering utført ved bruk av ikke-aldehydfikseringsmidler (som garvesyre, uranylacetat) for å bevare nær-naturlig ultrastruktur og unngå skade på merkeaktiviteten forårsaket av aldehyd-tverrbinding.
En enkel ett-trinns rehydrering ble brukt før den ANSM-baserte AuNP-syntesen. Resultatene viste at de merkede proteinene målrettet mot forskjellige organeller, inkludert membranene og lumen i endoplasmatisk retikulum (ER), og mitokondrielle matriser ble detektert med høy effektivitet og spesifisitet. Denne forskningen gir biologer en robust protokoll for å løse et enormt spekter av biologiske spørsmål på enkeltmolekylnivå i cellulære ultrastrukturelle sammenhenger.
Introduction
I postgenomisk tid har utviklingen av grønt fluorescerende protein (GFP) som en enkeltmolekylær reporter for lysmikroskopi revolusjonert feltet moderne livsvitenskapsforskning 1,2. I flere tiår har elektronmikroskopi (EM) vært et kraftig verktøy for intuitivt å observere den cellulære ultrastrukturen med nanoskalaoppløsning3; Den nøyaktige identifiseringen og lokaliseringen av proteinmolekyler er imidlertid fortsatt utfordrende.
Den mest brukte EM-merkingsteknikken er merkingsteknikken for immunelektronmikroskopi (IEM), som er basert på antigen-antistoffreaksjonen. Selv om mange teknikker er utviklet innen IEM-merking, inkludert pre-embedding IEM og post-embedding IEM (på harpiksseksjoner eller hydrerte kryoseksjoner), lider den imidlertid fortsatt av lav merkingseffektivitet (<10%)4,5, som er relatert til prøvepreparering og antistoffkvalitet. For å overvinne disse begrensningene har utvikling av genetisk kodede koder stort applikasjonspotensial.
To hovedtyper av EM-koder har blitt grundig utforsket de siste årene. En type er DAB-fargemetoden, som bruker tagger som APEX2 for å oksidere 3,3'-diaminobenzidin (DAB) til osmiofile polymerer for EM-visualisering 6,7,8,9,10,11,12. Det muliggjør merking av proteiner med høy overflod i subcellulære regioner, men er ikke egnet for telling av enkeltmolekyler. Den andre typen benytter metallbindende proteiner, slik som ferritin 13 og metallothionein (MT) 14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26, for å generere elektrontette metallavsetninger i situ for EM-visualisering. Bare sistnevnte har reelt potensial for enkeltmolekylvisualisering og telling. Den molekylære størrelsen på ferritin er for stor (~ 450 kD) for at den skal brukes som en lovende tag, mens den lille størrelsen (~ 5 kD) av MT og dens evne til å binde forskjellige ioner gjennom sine 20 cysteiner har tiltrukket seg stor oppmerksomhet. Flere laboratorier har forsøkt å merke rensede MT-fusjonsproteiner eller MT-uttrykkende celler ved å inkubere direkte med Au +. Disse forsøkene har i utgangspunktet vist at MT-tagger kan binde gullioner for å danne signaler med høy kontrast, men ingen har virkelig oppnådd effektiv identifisering av individuelle proteiner i celler, og de er ikke allment anvendelige 14,15,16,17,18,19,20,21,22,23.
Den ANSM-baserte AuNP-synteseteknikken, som innebærer syntetisering av 2-6 nm-størrelse AuNPs direkte på cysteinrike koder (f.eks. MT, MT-variantene MTn og MTα, AFP) som elektrontette etiketter for EM-visualisering, er den første pålitelige og anvendelige tilnærmingen for proteinmerking og enkeltmolekyldeteksjon i celler24,25,26. Det muliggjør den spesifikke syntesen av AuNPs på isolerte tagfusjonsproteiner og har oppnådd en enestående merkingseffektivitet i ikke-faste eller kjemisk faste prokaryote (E. coli) og eukaryote (S. pombe) celler. Imidlertid innebærer implementering av samme protokoll i mer avanserte systemer som pattedyrceller eller vev ytterligere utfordringer, for eksempel den mer komplekse intracellulære redokshomeostasen og mer skjøre cellulære strukturer.
Denne studien presenterer en klonbar EM-merkingsteknologi, som kombinerer den nye ANSM-baserte AuNP-synteseteknikken for merking av genetisk kodede cysteinrike koder (MT) med HPF / FSF-rehydrering-HPF / FSF-prøveprepareringsmetoden, muliggjør entydig enkeltmolekylidentifikasjon av merkede proteiner i ER-membranen, ER-lumen og mitokondriematrise i HeLa-celler. Den nåværende metoden kombinerer egenskapene til høy merkingseffektivitet, et høyt signal-støy-forhold, enkeltmolekylmerking og sterk universalitet, og denne metoden har brede applikasjonsutsikter innen livsvitenskapsforskning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle forsyningene som brukes i dette eksperimentet, er oppført i materialfortegnelsen. Den trinnvise arbeidsflyten for gjeldende protokoll er vist i figur 1.
1. Cellekultur på safirskiver
- Overfør 3 mm x 0,16 mm safirskiver til et 2 ml sentrifugerør inneholdende 1 ml etanol, og sonicate i en ultralydrenser i 10 minutter.
- Brenn hver safirskive i en alkohollampeflamme til det ikke er synlige avleiringer på overflaten.
MERK: Gjennom metoden ovenfor kan safirskiver resirkuleres mange ganger. - Merk én side av hver safirskive med et tall med en løsemiddelbestandig penn (figur 1A).
MERK: Markørpennen som brukes må testes for å avgjøre om den er motstandsdyktig mot aceton og metanolløsningsmidler på forhånd for å forhindre tap av merker. - Plasser de merkede safirskivene på bunnen av en 35 mm kulturskål med den merkede siden opp.
- Steriliser cellekulturfatet med safirskiver under UV-lys i 30 minutter.
- Vend safirskivene med pinsett (den merkede siden vendt ned), og steriliser under UV-lys i ytterligere 30 minutter. Nå er kulturfatet med safirskivene klart for cellekultur.
MERK: Safirskivene kan også steriliseres ved autoklavering. - Frø cellene på safirskivene som er fremstilt ovenfor, og vokse til 80% -90% konfluens i en celleinkubator ved 37 ° C, 95% fuktighet og 5% CO2 (figur 1B).
MERK: Stabile HeLa-cellelinjer som uttrykker MTn-koder ble generert som beskrevet i Jiang et al.26.
2. Høytrykksfrysing (HPF)
FORSIKTIG: Flytende nitrogen brukes i dette eksperimentet. Når du arbeider med flytende nitrogen, bruk riktige sikkerhetsprosedyrer og personlig verneutstyr for å forhindre frostskader og kvælning.
- Forbered høytrykksfrysemaskinen minst 2 timer før forsøket i henhold til produsentens instruksjoner.
- Overføring type A HPF aluminiumbærere (fordypning: 0,025/0,275 mm) til et 2 ml sentrifugerør inneholdende 1 ml etanol, og sonicate i en ultralyd renere i 10 minutter.
- Tørk bærerne i en petriskål dekket med kvalitativt filterpapir (middels hastighet).
- Bløtlegg de forrensede bærerne i 1-heksadecen.
MERK: BSA anbefales ikke som et kryobeskyttelsesmiddel i det nåværende eksperimentet, da det vil forstyrre den påfølgende gull nanopartikkelsyntesen. - Bruk fin pinsett til å plukke opp en safirskive med celler fra kulturretten; Berør den merkede overflaten med kvalitativt filterpapir (middels hastighet) for å fjerne overflødig medium.
MERK: Vannets varmeledningsevne er svært lav, og for mye restvann vil påvirke fryseeffekten. Behold minimalt med vann for å forhindre at cellene tørker ut. - Monter safirskiven i HPF-prøveholderen, og dekk skiven raskt med en 0,025 mm dyp aluminiumsbærer som inneholder 1-heksadeken (figur 1C).
- Aspirer overflødig løsning med kvalitativ filterpapir (middels hastighet).
- Legg prøveholderen for høytrykksfrysing (figur 1D).
MERK: Prøvelastingsprosessen må være så rask som mulig (innen 1 min) for å minimere fysiologiske endringer på grunn av endringer i temperatur, fuktighet, pH og oksygeninnhold. - Losse safirskivebærerenheten under flytende nitrogen i en skumkryoboks, og oppbevar enheten i et kryovial i flytende nitrogen før bruk.
MERK: Protokollen kan settes på pause her. Prøvene i kryovialer kan lagres i en flytende nitrogendewar i årevis.
3. Frysesubstitusjonsfiksering (FSF) og rehydrering (figur 1E)
- Fyll den automatiske frysesubstitusjonsmaskinen (AFS) med flytende nitrogen, og avkjøl kammeret til -90 °C.
FORSIKTIG: Flytende nitrogen brukes i dette eksperimentet. Når du arbeider med flytende nitrogen, bruk riktige sikkerhetsprosedyrer og personlig verneutstyr for å forhindre frostskader og kvælning. - Klargjør 2 ml 0,01 % garvesyre (w/v) i aceton (FSF oppløsning 1) i en 20 mm rund polypropylenbeholder (figur 1E) i en avtrekkshette og frys den i flytende nitrogen.
- Legg prøvene (safirskivebærerenhetene) i beholderen med frossen FSF-løsning 1 under LN2 ved hjelp av en forhåndskjølt pinsett.
- Overfør beholderen til det forkjølte AFS-kammeret for FSF-behandling ved -90 °C.
- Oppbevar prøvene ved -90 °C i 1 time; Deretter skiller du safirskivene fra bærerne med forhåndskjølt pinsett, og sørger for at de merkede sidene av safirskivene vender ned.
MERK: Pinsetten må være tilstrekkelig forkjølt for å forhindre temperaturendringer. Safirskivene skal enkelt separeres. - Oppbevares ved -90 °C i ytterligere 8-10 timer; deretter varm til -60 ° C innen 3 timer.
- Bytt FSF-oppløsningen 1 i beholderen med forkjølt aceton, og inkuber i 1 time. Gjenta denne acetonvasken 2x.
- Varm til -30 °C innen 3 timer. I løpet av denne perioden, tilbered og forkjøl 2 ml 0,01% uranylacetat i aceton (FSF-oppløsning 2, fortynnet fra 10% uranylacetat i metanol) i et 2 ml sentrifugerør.
FORSIKTIG: Uranylacetat, brukt i det nåværende eksperimentet, er radioaktivt og svært giftig; Det må håndteres i henhold til forsvarlige sikkerhetsprosedyrer og kastes som farlig kjemisk avfall. - Erstatt aceton med FSF-oppløsning 2, og inkuber ved -30 °C i 3 timer.
- Erstatt FSF oppløsning 2 i beholderen med forkjølt aceton, og inkuber i 30 minutter ved -30 °C. Gjenta denne acetonvasken 2x.
- Varm fra -30 °C til 4 °C innen 2 timer.
- Erstatt aceton med 2 ml 0,2 M HEPES-buffer inneholdende 1 mM CaCl2 og 1 mMMgCl2 ved pH 5,5.
- Bytt buffer én gang, og bløs ved romtemperatur i 1 time eller ved 4 °C over natten.
MERK: Protokollen kan settes på pause her i én natt eller fortsette i minst 6 timer til prøvene fryses ned igjen i trinn 5.
4. ANSM-basert AuNP-syntese for pattedyrceller (figur 1F)
- Vask med PBS-A buffer 3x i 5 min hver gang.
- Overfør safirskivene til en 35 mm dyrkningsskål som inneholder 1 ml PBS-A-buffer ved romtemperatur.
MERK: Hold alltid de merkede sidene av safirskivene vendt ned, og unngå å overlappe safirskivene og gni av cellene. - Klargjør reduksjonsløsningen ved å tilsette 4,28 μl 2-merkaptoetanol i et 2 ml sentrifugerør inneholdende 1 ml PBS-A-buffer og blande godt i en avtrekkshette.
FORSIKTIG: 2-Merkaptoetanol er giftig og har en skarp lukt; Det må håndteres i henhold til riktige sikkerhetsprosedyrer. - Bytt PBS-A-bufferen i kulturfatet med 1 ml reduserende løsning, og inkuber i 1 time ved romtemperatur.
- Forbered gullforløperen før bruk.
- Tilsett 80 μL 10 mM HAuCl4 i ddH 2 O i et2ml sentrifugerør inneholdende 1 ml reduksjonsløsning, og umiddelbart virvel.
MERK: Løsningen kan bli uklar. - Tilsett 80 μL 500 mM D-penicillamin i ddH2O i løsningen ovenfor, og umiddelbart virvel.
MERK: Løsningen kan bli klar igjen.
- Tilsett 80 μL 10 mM HAuCl4 i ddH 2 O i et2ml sentrifugerør inneholdende 1 ml reduksjonsløsning, og umiddelbart virvel.
- Erstatt oppløsningen i dyrkningsfatet med 1 ml gullforløperoppløsning tilberedt i trinn 4,5, og inkuber i 2 timer ved 4 °C.
MERK: En milliliter av gullforløperen er tilstrekkelig til å reagere med omtrent 1 × 106 celler (sammenløpende på en 35 mm tallerken). Større volumer av forløperen er nødvendig når AuNPene blir betydelig mindre. - Vei 0,0038 g NaBH 4 inn i et 1,5 ml sentrifugerør, tilsett 1 ml iskald ddH2O og virvel for å lage fersk 100 mM NaBH4 like før bruk.
- Tilsett 20-100 μL 100 mM NaBH 4 til løsningen fra trinn4.6 , rist umiddelbart for å blande godt, og inkuber i 5 minutter ved romtemperatur.
MERK: Tilbered 100 mM NaBH4 ferskt til umiddelbar bruk. Etter tilsetning av NaBH4 vil fargen på løsningen gradvis bli rød og deretter utdype. Hvis ingen fargeendring observeres, indikerer det i stor grad at eksperimentet har mislyktes. - Erstatt løsningen med 2 ml PBS-A-buffer for å stoppe reaksjonen.
MERK: Å stoppe reaksjonen innen 30 minutter er kritisk, da en langvarig reaksjon gradvis vil bryte ned AuNPene.
5. Høytrykksfrysing og frysesubstitusjonsfiksering (figur 1C-F)
MERK: Prøvene er HPF og FSF igjen, og prosedyren er nesten den samme som tidligere beskrevet i avsnitt 2 og seksjon 3 med noen få modifikasjoner.
- Forbered 1% osmiumtetroxid og 0,1% uranylacetat i aceton (FSF-oppløsning 3, fortynnet fra 4% osmiumtetroxid i aceton og 10% uranylacetat i metanol).
FORSIKTIG: Osmiumtetroxid og uranylacetat er svært giftige kjemikalier; De må håndteres i henhold til riktige sikkerhetsprosedyrer og kastes som farlig kjemisk avfall. - Legg prøvene (safirskivebærerenhetene) i beholderen med frossen FSF-løsning 3 under LN2 ved hjelp av en forhåndskjølt pinsett.
- Overfør beholderen til det forkjølte AFS-kammeret for FSF-behandling ved -90 °C, og kjør FSF-programmet som følger: oppbevares ved -90 °C i 8-10 timer; deretter, varm til -60 ° C innen 3 timer; holdes ved -60 °C i 3 timer; deretter, varm til -30 ° C innen 3 timer; holdes ved -30 °C i 3 timer; Varm deretter til 4 °C innen 2 timer.
- Når temperaturen når 4 °C, overføres prøvene til avtrekkshetten og oppbevares i romtemperatur i 15 minutter.
- Vask med aceton 3x i 15 min hver gang.
- Oppbevares i aceton ved romtemperatur i minst 2 timer.
6. Harpiks infiltrasjon, innebygging og polymerisering
- Forbered epoksyharpiksblandingen i henhold til produsentens instruksjoner før bruk.
FORSIKTIG: Epoksyharpiksen som brukes i det nåværende eksperimentet er giftig før polymerisasjon; Det må håndteres i henhold til riktige sikkerhetsprosedyrer. Upolymerisert harpiks skal kastes som farlig kjemisk avfall eller polymeriseres før deponering. - Overfør safirskivene til flatbunnede innebyggingskapsler, og infiltrer med harpiks i minst 30 minutter ved romtemperatur.
NOTAT: Hold de markerte sidene av safirskivene vendt ned. - Polymeriser prøven ved 60 °C i en ovn i minst 18 timer.
MERK: Protokollen kan settes på pause her etter polymerisering. Polymeriserte prøveblokker kan lagres i en tørr beholder i årevis.
7. Ultratynn seksjonering
- Trim de polymeriserte prøveblokkene forsiktig ved hjelp av en barberhøvel for å avsløre safirskivene.
- Dypp blokkspissene med safirskiver i flytende nitrogen i flere sekunder, og tine ved romtemperatur. Gjenta fryse-tine-virkningen flere ganger for å løsne platene fra blokkene.
MERK: Unngå langvarig frysing, da dette kan sprekke prøveblokkene. Ta safirskivene forsiktig av med et blad, og unngå overdreven kraft, noe som kan skade prøvene. - Trim blokkflaten til en trapesformet form for ultratynn seksjonering (figur 1G).
- Oppnå 70-100 nm ultratynne seksjoner med en ultramicrotome (figur 1H).
- Velg seksjonene på 200-mesh sekskantede kobbergitter.
MERK: Protokollen kan settes på pause her etter seksjonering. Seksjonene på belter kan lagres i en tørr beholder i årevis. Om ønskelig kan seksjonene på rutene farges med 2% uranylaceton for å oppnå bedre membrankontrast. Blyfarging bør unngås, da det vil maskere nanogullpartikkelsignalene.
8. TEM-avbildning (figur 1I)
- Undersøk de ultratynne seksjonene på kobbergitter ved hjelp av et transmisjonselektronmikroskop. Vanligvis er et forstørrelsesområde fra 11 kX til 30 kX egnet for visualisering av AuNPs i celler, og en passende defokusverdi er nødvendig for å sikre at 2-3 nm AuNPs er synlige.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den ANSM-baserte AuNP-synteseteknikken er et ekstremt nyttig verktøy for merking og påvisning av MT-merkede proteiner med TEM26. For å validere robustheten i pattedyrceller ble det generert tre stabile cellelinjer som uttrykker EGFP-MTn-KDEL, Ost4-EGFP-MTn eller Mito-acGFP-MTn i Hela-celler. KDEL er en kanonisk C-terminal endoplasmatisk retikulum (ER) retensjons-/gjenfinningssekvens, som opprettholder fusjonsproteinet EGFP-MTn-KDEL i ER-lumen eller det perinukleære rommet til kjernekonvolutten (NE). Ost4 er en underenhet av oligosakkaryltransferasekomplekset, som er et membranproteinkompleks lokalisert i ER og NE som katalyserer N-glykosyleringen av naserende polypeptider. C-enden av Ost4-fusjonsproteinet Ost4-EGFP-MTn vender mot cytosolen. Mito er en mitokondriell målrettingssekvens som retter seg mot fusjonsproteinet Mito-acGFP-MTn i mitokondriematrisen.
HPF/FSF-prøveprepareringen, kombinert med bruk av garvesyre og urannullacetat i stedet for aldehydfikseringsmidler, bevarte utmerket ultrastruktur med god membrankontrast (figur 2, figur 3 og figur 4). Prøvens samlede struktur var tett, uten tydelig cytoplasma og lipidekstraksjon. Membranstrukturen var glatt, uten åpenbar deformasjon, og fosfolipid-dobbeltlagsstrukturen ble tydelig avslørt.
I tillegg til den godt bevarte ultrastrukturen, ble effektiv merking observert i alle tre tilfeller som representerte forskjellige organellspesifisiteter. EGFP-MTn-KDEL-proteinet dukket opp som 2-5 nm størrelse gull nanopartikler utelukkende fordelt i perifert ER-lumen og i det perinukleære rommet til NE (figur 2A-C). Den godt bevarte ultrastrukturen muliggjorde ikke bare enkeltmolekylidentifikasjon av merkede proteiner, men lettet også analysen av organelle interaksjoner, for eksempel ER-mitokondrie-interaksjoner (figur 2D, E). Nanopartikler av Ost4-EGFP-MTn-proteinet avgrenset ER-membranen (figur 3A-D) og den ytre membranen til NE (figur 3E). Nanopartikler ble også fordelt på den indre membranen til NE, men antall nanopartikler var lavere enn på den ytre membranen, noe som indikerer at proteinsammensetningen av de indre og ytre membranene var forskjellig (figur 3E). På samme måte viste Mito-acGFP-MTn-uttrykkende celler spesifikk merking i mitokondriematrisen (figur 4A-E). Ingen partikler ble observert i vesiklene eller ER (figur 4A-D), og få partikler ble vist i MVBene (figur 4D).
Figur 1: Skjema for arbeidsflyten til den klobare elektronmikroskopimerkingsteknologien . (A) Safirskiver er merket og sterilisert for cellekultur. (B) Celler dyrkes på safirskiver i en 35 mm kulturskål. (C) Safirskivene med celler er avkortet med 0,025 mm dype aluminiumsbærere for høytrykksfrysing, og den ekstra plassen er fylt med 1-heksadeken. (D) Cellene er kryofiksert av HPF. (E) Fiksering av frysesubstitusjon. (F) De skjematiske trinnene i den ANSM-baserte AuNP-syntesen. (G) Safirskivene med celler er innebygd i flatbunnede innebyggingskapsler. Harpiksblokkene er trimmet for ultratynn seksjonering. (H) De trimmede harpiksblokkene er seksjonert med en ultramikrotom. (I) De ultratynne seksjonene er avbildet med TEM. Forkortelser: ANSM = autonukleasjonsundertrykkelsesmekanisme; AuNP = gull nanopartikkel; HPF = høytrykksfrysing; FSF = frysesubstitusjonsfiksering; TEM = transmisjonselektronmikroskopi. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: ANSM-basert AuNP-syntese på EGFP-MTn-KDEL uttrykt i HeLa-celler. (A,D) EM-bilder av en 90 nm tykk del av HeLa-celler som uttrykker EGFP-MTn-KDEL viser AuNPer spesifikt akkumulert i lumen i endoplasmatisk retikulum og i det perinukleære rommet til den nukleære konvolutten. Få partikler observeres i mitokondriene, lysosomet, kjernen eller cytosolen. (B,C) Innzoomede bilder av henholdsvis de røde og gule rektangelområdene i (A). (E) Innzoomet bilde av det grønne rektangelområdet i (D). Denne figuren er modifisert fra Jiang et al.26. Skalastenger = (B,C,E) 200 nm; (A,D) 500 nm. Forkortelser: ANSM = autonukleasjonsundertrykkelsesmekanisme; AuNP = gull nanopartikkel; EGFP = forbedret grønt fluorescerende protein; ER = endoplasmatisk retikulum; NE = kjernefysisk konvolutt; M = mitokondrier; Lyso = lysosom; N = kjernen. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: ANSM-basert AuNP-syntese på Ost4-EGFP-MTn uttrykt i HeLa-celler. (A-D) EM-bilder av en 90 nm tykk del av HeLa-celler som uttrykker Ost4-EGFP-MTn, viser AuNPs spesifikt akkumulert på membranen til endoplasmatisk retikulum. (E) Et EM-bilde av en 90 nm tykk del av HeLa-celler som uttrykker OST4-EGFP-MTn viser AuNPs spesifikt akkumulert på membranen til NE (nukleær konvolutt). Få partikler observeres i mitokondriene, lysosomet, kjernen eller cytosolen. (C) Zoomet inn bilde av det røde rektangelområdet i (A). Denne figuren er modifisert fra Jiang et al.26. Skalastenger = (B-E) 200 nm; (A) 500 nm. Forkortelser: ANSM = autonukleasjonsundertrykkelsesmekanisme; AuNP = gull nanopartikkel; EGFP = forbedret grønt fluorescerende protein; ER = endoplasmatisk retikulum; NE = kjernefysisk konvolutt; M = mitokondrier; Lyso = lysosom; N = kjernen; EM = elektronmikroskopi. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: ANSM-basert AuNP-syntese på Mito-acGFP-MTn uttrykt i HeLa-celler. (A,D,E) EM-bilder av en 90 nm tykk del av HeLa-celler som uttrykker Mito-acGFP-MTn, viser AuNPer spesifikt akkumulert i matrisen til mitokondriene (M). Få partikler observeres i endoplasmatisk retikulum, kjerne, vesikkel, multivesikulær kropp eller cytosol. (B,C) Zoomet inn bilde av henholdsvis de røde og gule rektangelområdene i (A). Denne figuren er modifisert fra Jiang et al.26. Skalastenger = (D,E) 200 nm; (B,C) 500 nm; (A) 1 μm. Forkortelser: ANSM = autonukleasjonsundertrykkelsesmekanisme; AuNP = gull nanopartikkel; EGFP = forbedret grønt fluorescerende protein; ER = endoplasmatisk retikulum; NE = kjernefysisk konvolutt; M = mitokondrier; Lyso = lysosom; N = kjernen; V = vesikkel; MVB = multivesikulær kropp. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Studien presenterer her en robust klonbar EM-merkingsteknologi for enkeltmolekylvisualisering av proteinmolekyler i det cellulære miljøet med ultrastrukturell oppløsning. AuNPene direkte syntetisert på genetisk kodede cysteinrike koder gir entydig og presis lokalisering av målproteinene. Høytrykksfrysing og frysesubstitusjonsteknikk bevarer utmerket ultrastrukturen til biologiske prøver. Til sammen gir den klonbare elektronmikroskopimerkingsteknologien som presenteres her, et kraftig verktøy for effektiv lokalisering og anerkjennelse av et enkelt molekyl i cellulære ultrastrukturelle sammenhenger in situ med EM.
ANSM-mekanismen undertrykker autonukleasjonsprosessen av tiolat-Au (I) polymerer26, som er en typisk reaksjon i den klassiske Brust-Schiffrin-metoden (BSM)27 som er mye brukt til å syntetisere tiolat-capped gull nanoklynger. Derfor kan den ANSM-baserte AuNP-synteseteknikken spesifikt syntetisere 2-6 nm-størrelse AuNP direkte på cysteinrike koder som elektrontette etiketter for EM-visualisering med høyt signal-støyforhold og høy effektivitet. I motsetning til APEX2- eller HPR-merkingsteknikker som er avhengige av DAB-polymeravsetning, som er utallige og ikke egnet for løselige proteiner i cytosolen, er den ANSM-baserte AuNP-synteseteknikken den eneste teknikken som muliggjør enkeltmolekyldeteksjon så langt.
Ulempen med den klonbare elektronmikroskopieringsteknologien er at den ANSM-baserte AuNP-synteseteknikken er avhengig av aktiviteten til tiolgruppen cystein, som er følsom for aldehydfikseringsmidler. Den oksidative beskyttelsen av tioler med 3,3'-dithiodipropionsyre (DTDPA) er introdusert før aldehydfiksering i E. coli og fisjonsgjæren S. pombe, noe som resulterer i god morfologi og utmerket merkingseffektivitet24,25,26. I dette arbeidet fungerte oksidasjons- / fikseringsmetoden riktig for de kodene som ble uttrykt i et relativt oksidativt rom, slik som ER-lumen- og mitokondriematrisen (i EGFP-MTn-KDEL og Mito-acGFP-MTn-celler). Det var imidlertid suboptimalt for cytosoliske koder (Ost4-GFP-MTn) i pattedyrceller. Årsaken kan være at merkene i reduksjonsrommene ikke er godt brettet, og de reduserende stoffene som GSH som er tilstede i overflod i cytoplasma, kan motstå oksidasjon.
HPF-FSF-teknikken er gullstandarden i ultrastrukturell bevaring av biologiske prøver for elektronmikroskopi. I dette arbeidet oppnådde metoden for HPF / FSF-rehydrering-HPF / FSF, som helt unngår konvensjonell kjemisk fiksering og permeabilisering, effektiv merking med Ost4-GFP-MTn og ga utmerket cellestruktur. Denne metoden har imidlertid fortsatt visse begrensninger. For det første kan en annen HPF føre til betydelig iskrystallskade. For det andre har forskjellige partier av uranylacetat problemer med inkonsekvent kvalitet og løselighet. Akikulære utfellinger dukket av og til opp i de rehydrerte prøvene når de ble visualisert ved elektronmikroskopi. Vasking med HEPES-buffer ved pH 5,5 kan lindre dette problemet. For det tredje trenger prøveprepareringen for vevsprøver ytterligere optimalisering.
Avslutningsvis muliggjør den klonbare EM-merkingsteknologien, som kombinerer den ANSM-baserte AuNP-synteseteknikken med prøveprepareringsmetoden for HPF / FSF-rehydrering-HPF / FSF, den entydige enkeltmolekylidentifikasjonen av genetisk merkede proteiner i celler ved elektronmikroskopi. Den nåværende protokollen bør tillate et enormt spekter av biologiske spørsmål som skal tas opp.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatteren oppgir ingen interessekonflikter.
Acknowledgments
Protokollen beskrevet her er hentet fra artikkelen publisert av Jiang et al. (2020). Dette arbeidet ble støttet av tilskudd fra MOST (973 programmer nr. 2011CB812502 og 2014CB849902) og ved finansieringsstøtte fra Beijing kommunestyre.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.025 mm/0.275 mm Aluminum carrier | Beijing Wulundes Biotech Ltd., or Engineering Office of M. Wohlwend | ||
| 0.2 M HEPES buffer | Dissolve HEPES (0.2 M) in 980 mL of ddH2O, then add 10 mL of 100 mM MgCl2 and 10 mL of 100 mM CaCl2 (final concentration 1 mM), respectively, adjust pH to 5.5 | ||
| 1.5 mL MaxyClear snaplock microtube | Axygen Scientific | MCT150C | |
| 2 mL polypropylene screw cap microtubes | Biologix | 81-0204 | |
| 200 mesh hexagonal copper grid | Tedpella inc | G200HEX | |
| 2-mercaptoethanol | Amresco | 0482-250ML | |
| 35 mm cell culture dishes | Corning | 430165 | |
| 50 mL polypropylene centrifuge tubes | Corning | 430928 | |
| Acetone | Beiijng Tong Guang Fine Chemicals Company | 31025 | |
| Automated freeze substitution machine | Leica | AFS2 | |
| Customized 3.05 mm x 0.66 mm specimen holders for HPF | Beijing Wulundes Biotech Ltd. | ||
| D-penicillamine | TCI | P0147 | |
| Dulbecco’s modified Eagle medium | GBICO | C11965500BT | |
| Fetal bovine serum | GBICO | 10099-141C | |
| Flat bottom embedding capsule | Tedpella inc | ||
| Foam cryobox | |||
| Formvar 15/95 resin | Electron Microscopy Sciences | 15800 | |
| HAuCl4 | Sigma | 4022-1G | |
| HEPES | sigma | H3375-500G | |
| HPF machine | Wohlwend | HPF compact01 | |
| Methonal | Beiijng Tong Guang Fine Chemicals Company | 12397 | |
| NaBH4 | Sigma | 480886-25G | |
| OsO4 | Electron Microscopy Sciences | 19110 | |
| PBS-A buffer | Dissolve NaH2PO4 (1.125 mM), Na2HPO4 (3.867 mM), NaCl (100 mM) in 1 L of ddH2O, adjust to pH 7.4 | ||
| Qualitative filter paper (medium speed) | Beyotime Biotechnology | FFT08 | |
| Sapphire discs | Beijing Wulundes Biotech Ltd., or Engineering Office of M. Wohlwend | ||
| Solvent resistant pen | Electron Microscopy Sciences | 62053-B | |
| SPI-Pon 812 resin | SPI Inc | 02659-AB | |
| Transmission electron microscopy | FEI | Tecnai G2 spirit | |
| Trypsin-EDTA | GBICO | C25200-056 | |
| Tweezers | Dumont | ||
| Ultramictotome | Leica | FC7 | |
| Uranyl acetate | Electron Microscopy Sciences | 22400 |
References
- Tsien, R. Y.
- Shaner, N. C., Patterson, G. H., Davidson, M. W.
- Masters, B. R. History of the electron microscope in cell biology. Encylopedia of Life Sciences. , (2009).
- Griffiths, G., Hoppeler, H. Quantitation in immunocytochemistry: Correlation of immunogold labeling to absolute number of membrane antigens. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 34 (11), 1389-1398 (1986).
- Tokuyasu, K. T. A technique for ultracryotomy of cell suspensions and tissues. Journal of Cell Biology. 57 (2), 551-565 (1973).
- Connolly, C. N., Futter, C. E., Gibson, A., Hopkins, C. R., Cutler, D. F. Transport into and out of the Golgi complex studied by transfecting cells with cDNAs encoding horseradish peroxidase. Journal of Cell Biology. 127 (3), 641-652 (1994).
- Grabenbauer, M., et al. Correlative microscopy and electron tomography of GFP through photooxidation. Nature Methods. 2 (11), 857-862 (2005).
- Gaietta, G., et al. Multicolor and electron microscopic imaging of connexin trafficking. Science. 296 (5567), 503-507 (2002).
- Shu, X., et al. A genetically encoded tag for correlated light and electron microscopy of intact cells, tissues, and organisms. PLoS Biology. 9 (4), e1001041 (2011).
- Martell, J. D., et al. Engineered ascorbate peroxidase as a genetically encoded reporter for electron microscopy. Nature Biotechnology. 30 (11), 1143-1148 (2012).
- Lam, S. S., et al. Directed evolution of APEX2 for electron microscopy and proximity labeling. Nature Methods. 12 (1), 51-54 (2015).
- Mavlyutov, T. A., et al. APEX2-enhanced electron microscopy distinguishes sigma-1 receptor localization in the nucleoplasmic reticulum. Oncotarget. 8 (31), 51317-51330 (2017).
- Wang, Q., Mercogliano, C. P., Lowe, J. A ferritin-based label for cellular electron cryotomography. Structure. 19 (2), 147-154 (2011).
- Sano, T., Glazer, A. N., Cantor, C. R. A streptavidin-metallothionein chimera that allows specific labeling of biological materials with many different heavy metal ions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 89 (5), 1534-1538 (1992).
- Mercogliano, C. P., DeRosier, D. J. Gold nanocluster formation using metallothionein: Mass spectrometry and electron microscopy. Journal of Molecular Biology. 355 (2), 211-223 (2006).
- Mercogliano, C. P., DeRosier, D. J. Concatenated metallothionein as a clonable gold label for electron microscopy. Journal of Structural Biology. 160 (1), 70-82 (2007).
- Morphew, M. K., et al. Metallothionein as a clonable tag for protein localization by electron microscopy of cells. Journal of Microscopy. 260 (1), 20-29 (2015).
- Nishino, Y., Yasunaga, T., Miyazawa, A. A genetically encoded metallothionein tag enabling efficient protein detection by electron microscopy. Journal of Electron Microscopy. 56 (3), 93-101 (2007).
- Bouchet-Marquis, C., Pagratis, M., Kirmse, R., Hoenger, A. Metallothionein as a clonable high-density marker for cryo-electron microscopy. Journal of Structural Biology. 177 (1), 119-127 (2012).
- Fukunaga, Y., et al. Electron microscopic analysis of a fusion protein of postsynaptic density-95 and metallothionein in cultured hippocampal neurons. Journal of Electron Microscopy. 56 (4), 119-129 (2007).
- Diestra, E., Fontana, J., Guichard, P., Marco, S., Risco, C. Visualization of proteins in intact cells with a clonable tag for electron microscopy. Journal of Structural Biology. 165 (3), 157-168 (2009).
- Risco, C., et al. sensitive, high-resolution detection of protein molecules in eukaryotic cells using metal-tagging transmission electron microscopy. Structure. 20 (5), 759-766 (2012).
- Ding, S. -W., et al. Noncanonical role for the host Vps4 AAA+ ATPase ESCRT protein in the formation of tomato bushy stunt virus replicase. PLoS Pathogens. 10 (4), e1004087 (2014).
- Jiang, Z., et al. Direct synthesis of gold nanoparticles on cysteine-rich tags in yeast cells. Protocol Exchange. , (2020).
- Jiang, Z., et al. Direct synthesis of gold nanoparticles on cysteine-rich tags in mammalian cells. Protocol Exchange. , (2020).
- Jiang, Z., et al. Genetically encoded tags for direct synthesis of EM-visible gold nanoparticles in cells. Nature Methods. 17 (9), 937-946 (2020).
- Brust, M., Walker, M., Bethell, D., Schiffrin, D. J., Whyman, R. Synthesis of thiol-derivatised gold nanoparticles in a two-phase liquid-liquid system. Journal of the Chemical Society, Chemical Communications. 7, 801-802 (1994).
