Summary
Mevcut protokol, yeni bir otonükleasyon bastırma mekanizmasına dayalı altın nanopartikül sentez tekniği kullanarak hücrelerdeki metallothionein etiketli proteinleri tespit etmek için klonlanabilir bir elektron mikroskobu etiketleme teknolojisini tanımlamaktadır.
Abstract
Protein moleküllerinin ultrayapısal çözünürlüğe sahip hücrelerdeki hassas lokalizasyonunun analiz edilmesi, tüm canlı organizmalarda çeşitli fizyolojik veya patolojik süreçlerin incelenmesi için büyük önem taşımaktadır. Bu nedenle, elektron mikroskobu probları olarak kullanılabilecek klonlanabilir etiketlerin geliştirilmesi, floresan proteinlerin optik görüntüleme alanında çok önemli bir rol oynadığı gibi, büyük bir değere sahiptir. Otonükleasyon bastırma mekanizması (ANSM) yakın zamanda ortaya çıkarıldı, bu da metallothionein (MT) ve antifriz proteini (AFP) gibi sistein bakımından zengin etiketler üzerinde altın nanopartiküllerinin (AuNP'ler) spesifik sentezine izin veriyor.
ANSM'ye dayanarak, prokaryotik ve ökaryotik hücrelerdeki etiketlenmiş proteinlerin benzeri görülmemiş bir etiketleme verimliliği ile spesifik olarak algılanmasını sağlayan bir elektron mikroskobu etiketleme teknolojisi geliştirilmiştir. Bu çalışma, iyi korunmuş ultra yapıya sahip memeli hücrelerinde MTn (aldehit-reaktif kalıntıları olmayan mühendislik ürünü bir MT varyantı) füzyon proteinlerinin tespiti için bir protokol göstermektedir. Bu protokolde, yüksek basınçlı dondurma ve dondurarak ikame fiksasyonu, aldehit olmayan fiksatifler (tanik asit, uranil asetat gibi) kullanılarak, doğal ultrayapıyı korumak ve aldehit çapraz bağlanmasının neden olduğu etiket aktivitesinin zarar görmesini önlemek için gerçekleştirilmiştir.
ANSM tabanlı AuNP sentezinden önce basit bir tek adımlı rehidrasyon kullanılmıştır. Sonuçlar, etiketlenmiş proteinlerin endoplazmik retikulumun (ER) zarları ve lümeni de dahil olmak üzere çeşitli organelleri hedeflediğini ve mitokondriyal matrislerin yüksek verimlilik ve özgüllükle tespit edildiğini gösterdi. Bu araştırma, biyologlara hücresel ultrayapısal bağlamlarda tek molekül düzeyinde çok çeşitli biyolojik soruları ele almak için sağlam bir protokol sunmaktadır.
Introduction
Postgenomik çağda, ışık mikroskobu için tek moleküllü bir muhabir olarak yeşil floresan proteinin (GFP) geliştirilmesi, modern yaşam bilimleri araştırma alanında devrim yaratmıştır 1,2. Onlarca yıldır, elektron mikroskobu (EM), nano ölçekli çözünürlük3 ile hücresel ultrayapıyı sezgisel olarak gözlemlemek için güçlü bir araç olmuştur; Bununla birlikte, protein moleküllerinin kesin olarak tanımlanması ve lokalizasyonu zor olmaya devam etmektedir.
En sık kullanılan EM etiketleme tekniği, antijen-antikor reaksiyonuna dayanan immünoelektron mikroskopi (IEM) etiketleme tekniğidir. Bununla birlikte, IEM etiketleme alanında, IEM gömme öncesi ve gömme sonrası IEM (reçine kesitleri veya hidratlı kriyokesitler üzerinde) dahil olmak üzere birçok teknik geliştirilmiş olmasına rağmen, numune hazırlama ve antikor kalitesi ile ilgili düşük etiketleme verimliliğinden (% <10) 4,5 muzdariptir. Bu sınırlamaların üstesinden gelmek için, genetik olarak kodlanmış etiketler geliştirmek büyük bir uygulama potansiyeline sahiptir.
Son yıllarda iki ana EM etiketi türü kapsamlı bir şekilde araştırılmıştır. Bir tip, EM görselleştirme 6,7,8,9,10,11,12 için 3,3'-diaminobenzidine (DAB) ozmiofilik polimerlere oksitlemek için APEX2 gibi etiketleri kullanan DAB boyama yöntemidir. Hücre altı bölgelerde yüksek bolluktaki proteinlerin etiketlenmesini sağlar, ancak tek moleküllü sayım için uygun değildir. Diğer tip, ferritin 13 ve metallothionein (MT) 14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26 gibi metal bağlayıcı proteinleri kullanır. EM görselleştirme için situ. Sadece ikincisi tek moleküllü görselleştirme ve sayma için gerçek potansiyele sahiptir. Ferritinin moleküler boyutu, umut verici bir etiket olarak kullanılamayacak kadar büyüktür (~ 450 kD), MT'nin küçük boyutu (~ 5 kD) ve 20 sistein yoluyla çeşitli iyonları bağlama kabiliyeti büyük ilgi görmüştür. Birkaç laboratuvar, saflaştırılmış MT-füzyon proteinlerini veya MT eksprese eden hücreleri doğrudan Au + ile inkübe ederek etiketlemeye çalışmıştır. Bu girişimler başlangıçta MT etiketlerinin altın iyonlarını yüksek kontrastlı sinyaller oluşturmak için bağlayabildiğini kanıtladı, ancak hiçbiri hücrelerdeki bireysel proteinlerin etkili bir şekilde tanımlanmasını gerçekten başaramadı ve yaygın olarak uygulanamıyor 14,15,16,17,18,19,20,21,22,23.
EM görselleştirme için elektron yoğun etiketler olarak 2-6 nm boyutlu AuNP'lerin doğrudan sistein bakımından zengin etiketler (örneğin, MT, MT varyantları MTn ve MTa, AFP) üzerinde sentezlenmesini içeren ANSM tabanlı AuNP sentez tekniği,24,25,26 hücrelerinde protein etiketleme ve tek molekül tespiti için ilk güvenilir ve uygulanabilir yaklaşımdır. İzole etiket füzyon proteinleri üzerinde AuNP'lerin spesifik sentezine izin verir ve sabit olmayan veya kimyasal olarak sabitlenmiş prokaryotik (E. coli) ve ökaryotik (S. pombe) hücrelerde benzeri görülmemiş bir etiketleme verimliliği elde etmiştir. Bununla birlikte, aynı protokolün memeli hücreleri ve hatta dokular gibi daha gelişmiş sistemlerde uygulanması, daha karmaşık hücre içi redoks homeostazı ve daha kırılgan hücresel yapı gibi ek zorluklar içerir.
Bu çalışma, genetik olarak kodlanmış sistein bakımından zengin etiketleri (MT) etiketlemek için yeni ANSM tabanlı AuNP sentez tekniğini HPF / FSF-rehidrasyon-HPF / FSF numune hazırlama yöntemiyle birleştiren klonlanabilir bir EM etiketleme teknolojisi sunarak, HeLa hücrelerinde ER membranı, ER lümeni ve mitokondriyal matristeki etiketlenmiş proteinlerin açık bir şekilde tek moleküllü tanımlanmasını sağlar. Mevcut yöntem, yüksek etiketleme verimliliği, yüksek sinyal-gürültü oranı, tek moleküllü etiketleme ve güçlü evrensellik özelliklerini birleştirir ve bu yöntemin yaşam bilimleri araştırmalarında geniş uygulama beklentileri vardır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bu deneyde kullanılan tüm malzemeler Malzeme Tablosunda listelenmiştir. Geçerli protokolün adım adım iş akışı Şekil 1'de gösterilmiştir.
1. Safir disklerde hücre kültürü
- 3 mm x 0.16 mm safir diskleri, 1 mL etanol içeren 2 mL santrifüj tüpüne aktarın ve 10 dakika boyunca ultrasonik bir temizleyicide sonikleştirin.
- Her safir diski, yüzeyde görünür birikintiler kalmayana kadar bir alkol lambası alevinde yakın.
NOT: Yukarıdaki yöntemle, safir diskler birçok kez geri dönüştürülebilir. - Solvente dayanıklı bir kalem kullanarak her safir diskin bir tarafını bir sayı ile etiketleyin (Şekil 1A).
NOT: İşaret kaybını önlemek için kullanılan işaretleyici kalemin aseton ve metanol çözücülere karşı dirençli olup olmadığını belirlemek için önceden test edilmesi gerekir. - Etiketli safir diskleri, etiketli tarafı yukarı bakacak şekilde 35 mm'lik bir kültür kabının altına yerleştirin.
- Hücre kültürü kabını safir disklerle UV ışığı altında 30 dakika sterilize edin.
- Safir diskleri cımbızla çevirin (etiketli tarafı aşağı bakacak şekilde) ve UV ışığı altında 30 dakika daha sterilize edin. Şimdi, safir diskleri içeren kültür kabı hücre kültürü için hazır.
NOT: Safir diskler otoklavlama ile de sterilize edilebilir. - Hücreleri yukarıda hazırlanan safir disklere tohumlayın ve bir hücre inkübatöründe 37 ° C'de,% 95 nemde ve% 5 CO2'de % 80-90 akıcılığa kadar büyüyün (Şekil 1B).
NOT: MTn etiketlerini ifade eden kararlı HeLa hücre çizgileri, Jiang ve ark.26'da açıklandığı gibi oluşturulmuştur.
2. Yüksek basınçlı dondurma (HPF)
DİKKAT: Bu deneyde sıvı azot kullanılmıştır. Sıvı azotla çalışırken, donma ve boğulmayı önlemek için uygun güvenlik prosedürleri ve kişisel koruyucu ekipman kullanın.
- Yüksek basınçlı dondurma makinesini deneyden en az 2 saat önce üreticinin talimatlarına göre hazırlayın.
- A tipi HPF alüminyum taşıyıcıları (girinti: 0.025 / 0.275 mm) 1 mL etanol içeren 2 mL'lik bir santrifüj tüpüne aktarın ve 10 dakika boyunca ultrasonik bir temizleyicide sonikleştirin.
- Taşıyıcıları kalitatif filtre kağıdı (orta hız) ile kaplı bir Petri kabında kurutun.
- Önceden temizlenmiş taşıyıcıları 1-hekzadesen içine batırın.
NOT: BSA, mevcut deneyde bir kriyoprotektan olarak önerilmemektedir, çünkü sonraki altın nanopartikül sentezine müdahale edecektir. - Kültür kabından hücrelere sahip safir bir disk almak için ince cımbız kullanın; fazla ortamı çıkarmak için etiketli yüzeye kalitatif filtre kağıdıyla (orta hız) dokunun.
NOT: Suyun ısıl iletkenliği çok düşüktür ve çok fazla artık su donma etkisini etkileyecektir. Hücrelerin kurumasını önlemek için minimum su tutun. - Safir diski HPF numune tutucusuna monte edin ve diski 1-hekzadesen içeren 0,025 mm derinliğinde alüminyum taşıyıcı ile hızlı bir şekilde kapatın (Şekil 1C).
- Kalitatif filtre kağıdı (orta hız) ile fazla çözeltiyi aspire edin.
- Numune tutucuyu yüksek basınçlı dondurma için yükleyin (Şekil 1D).
NOT: Sıcaklık, nem, pH ve oksijen içeriğindeki değişikliklerden kaynaklanan fizyolojik değişiklikleri en aza indirmek için numune yükleme işleminin mümkün olduğunca hızlı (1 dakika içinde) olması gerekir. - Safir disk taşıyıcı tertibatı bir köpük kriyokutuda sıvı azot altında boşaltın ve kullanmadan önce tertibatı sıvı azot içinde bir kriyovyal içinde saklayın.
NOT: Protokol burada duraklatılabilir. Kriyovyallerdeki örnekler yıllarca sıvı azot dewar'da saklanabilir.
3. Dondurarak ikame fiksasyonu (FSF) ve rehidrasyon (Şekil 1E)
- Otomatik dondurarak ikame makinesini (AFS) sıvı azotla doldurun ve odayı -90 ° C'ye soğutun.
DİKKAT: Bu deneyde sıvı azot kullanılmıştır. Sıvı azotla çalışırken, donma ve boğulmayı önlemek için uygun güvenlik prosedürleri ve kişisel koruyucu ekipman kullanın. - Bir duman davlumbazında 20 mm'lik yuvarlak bir polipropilen kapta (Şekil 1E) aseton (FSF çözeltisi 1) içinde 2 mL% 0.01 tanik asit (w/v) hazırlayın ve sıvı azotta dondurun.
- Numuneleri (safir disk taşıyıcı tertibatları) bir çift önceden soğutulmuş cımbız kullanarak LN2 altında dondurulmuş FSF çözeltisi 1 ile kaba yükleyin.
- Kabı -90 °C'de FSF işlemesi için önceden soğutulmuş AFS odasına aktarın.
- Numuneleri 1 saat boyunca -90 ° C'de tutun; Ardından, safir diskleri önceden soğutulmuş cımbızla taşıyıcılardan ayırın ve safir disklerin işaretli taraflarının aşağı baktığından emin olun.
NOT: Cımbızlar, sıcaklık değişikliklerini önlemek için yeterince önceden soğutulmalıdır. Safir diskler kolayca ayrılmalıdır. - 8-10 saat daha -90 ° C'de tutun; daha sonra, 3 saat içinde -60 ° C'ye ısıtın.
- Kaptaki FSF çözeltisi 1'i önceden soğutulmuş asetonla değiştirin ve 1 saat boyunca inkübe edin. Bu aseton yıkamayı 2x tekrarlayın.
- 3 saat içinde −30 °C'ye kadar ılık. Bu süre zarfında, 2 mL'lik bir santrifüj tüpünde asetonda (FSF çözeltisi 2, metanol içinde% 10 uranil asetattan seyreltilmiş) 2 mL% 0.01 uranil asetat hazırlayın ve önceden soğutun.
DİKKAT: Mevcut deneyde kullanılan uranil asetat radyoaktif ve oldukça toksiktir; uygun güvenlik prosedürlerine göre ele alınmalı ve tehlikeli kimyasal atık olarak bertaraf edilmelidir. - Asetonu FSF çözeltisi 2 ile değiştirin ve 3 saat boyunca -30 ° C'de inkübe edin.
- Kaptaki FSF çözeltisi 2'yi önceden soğutulmuş asetonla değiştirin ve -30 ° C'de 30 dakika inkübe edin. Bu aseton yıkamayı 2x tekrarlayın.
- 2 saat içinde −30 °C ila 4 °C arasında ılık.
- Asetonu, pH 5,5'te 1 mM CaCl 2 ve 1 mM MgCl 2 içeren 2 mL0,2 M HEPES tampon ile değiştirin.
- Tamponu bir kez değiştirin ve oda sıcaklığında 1 saat veya gece boyunca 4 ° C'de inkübe edin.
NOT: Protokol burada bir gece duraklatılabilir veya 5. adımda numuneler tekrar dondurulana kadar en az 6 saat devam edebilir.
4. Memeli hücreleri için ANSM tabanlı AuNP sentezi (Şekil 1F)
- PBS-A tamponu ile her seferinde 5 dakika boyunca 3x yıkayın.
- Safir diskleri oda sıcaklığında 1 mL PBS-A tamponu içeren 35 mm'lik bir kültür kabına aktarın.
NOT: Safir disklerin işaretli taraflarını daima aşağı bakacak şekilde tutun ve safir disklerin üst üste binmesini ve hücrelerin ovalanmasını önleyin. - 1 mL PBS-A tamponu içeren 2 mL'lik bir santrifüj tüpüne 4,28 μL 2-merkaptoetanol ekleyerek ve bir duman davlumbazında iyice karıştırarak indirgeyici çözeltiyi hazırlayın.
DİKKAT: 2-Merkaptoetanol toksiktir ve keskin bir kokuya sahiptir; uygun güvenlik prosedürlerine göre ele alınmalıdır. - Kültür kabındaki PBS-A tamponunu 1 mL indirgeyici çözelti ile değiştirin ve oda sıcaklığında 1 saat inkübe edin.
- Kullanmadan önce altın öncülünü hazırlayın.
- ddH2O'da 80 μL 10 mM HAuCl4'ü, 1 mL indirgeyici çözelti içeren 2 mL'lik bir santrifüj tüpüne ekleyin ve hemen vorteks yapın.
NOT: Çözelti bulutlu olabilir. - Yukarıdaki çözeltiye ddH2O içinde 80 μL 500 mM D-penisilamin ekleyin ve hemen vorteks ekleyin.
NOT: Çözüm tekrar netleşebilir.
- ddH2O'da 80 μL 10 mM HAuCl4'ü, 1 mL indirgeyici çözelti içeren 2 mL'lik bir santrifüj tüpüne ekleyin ve hemen vorteks yapın.
- Kültür kabındaki çözeltiyi, adım 4.5'te hazırlanan 1 mL altın öncü çözeltisi ile değiştirin ve 4 ° C'de 2 saat inkübe edin.
NOT: Altın öncülünün bir mililitresi, yaklaşık 1 × 106 hücre (35 mm'lik bir tabak üzerinde birleşir) ile reaksiyona girmek için yeterlidir. AuNP'ler önemli ölçüde küçüldüğünde öncülün daha büyük hacimlerine ihtiyaç duyulur. - 1,5 mL'lik bir santrifüj tüpüne 0,0038 g NaBH 4 ağırlığında, kullanımdan hemen önce 1 mL buz gibi soğuk ddH2O ve vorteks ekleyerek taze 100 mM NaBH4 yapın.
- Çözeltiye adım 4.6'dan itibaren 20-100 μL 100 mM NaBH4 ekleyin, hemen iyice karıştırmak için çalkalayın ve oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edin.
NOT: Hemen kullanım için 100 mM NaBH4'ü taze olarak hazırlayın. NaBH4'ü ekledikten sonra, çözeltinin rengi yavaş yavaş kırmızıya dönecek ve daha sonra derinleşecektir. Herhangi bir renk değişikliği gözlenmezse, büyük ölçüde deneyin başarısız olduğunu gösterir. - Reaksiyonu durdurmak için çözeltiyi 2 mL PBS-A tamponu ile değiştirin.
NOT: Reaksiyonun 30 dakika içinde durdurulması çok önemlidir, çünkü uzun süreli bir reaksiyon AuNP'leri yavaş yavaş parçalayacaktır.
5. Yüksek basınçlı dondurma ve dondurarak ikame fiksasyonu (Şekil 1C-F)
NOT: Örnekler yine HPF ve FSF'dir ve prosedür, birkaç değişiklikle bölüm 2 ve bölüm 3'te daha önce tarif edilenlerle neredeyse aynıdır.
- Asetonda% 1 ozmiyum tetroksit ve% 0.1 uranil asetat hazırlayın (FSF çözeltisi 3, asetonda% 4 osmiyum tetroksit ve metanolde% 10 uranil asetat ile seyreltilir).
DİKKAT: Osmiyum tetroksit ve uranil asetat oldukça toksik kimyasallardır; uygun güvenlik prosedürlerine göre ele alınmalı ve tehlikeli kimyasal atık olarak bertaraf edilmelidir. - Numuneleri (safir disk taşıyıcı tertibatları) bir çift önceden soğutulmuş cımbız kullanarak LN2 altında dondurulmuş FSF çözeltisi 3 ile kaba yükleyin.
- Kabı -90 °C'de FSF işlemesi için önceden soğutulmuş AFS odasına aktarın ve FSF programını aşağıdaki gibi çalıştırın: 8-10 saat boyunca -90 °C'de tutun; daha sonra, 3 saat içinde -60 ° C'ye ısıtın; 3 saat boyunca −60 ° C'de tutun; daha sonra, 3 saat içinde -30 ° C'ye ısıtın; 3 saat boyunca −30 ° C'de tutun; daha sonra, 2 saat içinde 4 ° C'ye ısıtın.
- Sıcaklık 4 ° C'ye ulaştığında, numuneleri davlumbaza aktarın ve 15 dakika boyunca oda sıcaklığında tutun.
- Her seferinde 15 dakika boyunca asetonla 3x yıkayın.
- Asetonda oda sıcaklığında en az 2 saat bekletin.
6. Reçine infiltrasyonu, gömme ve polimerizasyon
- Epoksi reçine karışımını kullanmadan önce üreticinin talimatlarına göre hazırlayın.
DİKKAT: Mevcut deneyde kullanılan epoksi reçinesi polimerizasyondan önce toksiktir; uygun güvenlik prosedürlerine göre ele alınmalıdır. Polimerize edilmemiş reçine, tehlikeli kimyasal atık olarak atılmalı veya bertaraf edilmeden önce polimerize edilmelidir. - Safir diskleri düz tabanlı gömme kapsüllere aktarın ve oda sıcaklığında en az 30 dakika reçine ile süzülün.
NOT: Safir disklerin işaretli kenarlarını aşağı bakacak şekilde tutun. - Numuneyi 60 °C'de bir fırında en az 18 saat polimerize edin.
NOT: Protokol, polimerizasyondan sonra burada duraklatılabilir. Polimerize numune blokları yıllarca kuru bir kapta saklanabilir.
7. Ultra ince kesitleme
- Safir diskleri açığa çıkarmak için polimerize numune bloklarını bir tıraş bıçağı kullanarak dikkatlice kesin.
- Blok uçlarını safir disklerle birkaç saniye boyunca sıvı azota batırın ve oda sıcaklığında çözün. Diskleri bloklardan ayırmak için donma-çözme işlemini birkaç kez tekrarlayın.
NOT: Uzun süreli donmadan kaçının, çünkü bu numune bloklarını çatlatabilir. Safir diskleri bir bıçakla nazikçe ayırın, numunelere zarar verebilecek aşırı kuvvetten kaçının. - Ultra ince kesitleme için blok yüzünü yamuk bir şekle kırpın (Şekil 1G).
- Bir ultramikrotom ile 70-100 nm ultra ince kesitler elde edin (Şekil 1H).
- 200 örgülü altıgen bakır ızgaralardaki bölümleri seçin.
NOT: Protokol, bölümlemeden sonra burada duraklatılabilir. Kuşaklar üzerindeki bölümler yıllarca kuru bir kapta saklanabilir. İstenirse, ızgaralardaki bölümler daha iyi membran kontrastı elde etmek için% 2 uranil aseton ile boyanabilir. Nanogold parçacık sinyallerini maskeleyeceği için kurşun lekelenmesinden kaçınılmalıdır.
8. TEM görüntüleme (Şekil 1I)
- Bir transmisyon elektron mikroskobu kullanarak bakır ızgaralar üzerindeki ultra ince bölümleri inceleyin. Tipik olarak, hücrelerdeki AuNP'leri görselleştirmek için 11 kX ila 30 kX arasında bir büyütme aralığı uygundur ve 2-3 nm AuNP'lerin görünür olmasını sağlamak için uygun bir bulanıklaştırma değeri gereklidir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ANSM tabanlı AuNP sentez tekniği, MT etiketli proteinleri TEM26 ile etiketlemek ve tespit etmek için son derece yararlı bir araçtır. Memeli hücrelerinde sağlamlığını doğrulamak için, Hela hücrelerinde EGFP-MTn-KDEL, Ost4-EGFP-MTn veya Mito-acGFP-MTn'yi ifade eden üç kararlı hücre hattı üretildi. KDEL, füzyon proteini EGFP-MTn-KDEL'i ER lümeni veya nükleer zarfın (NE) perinükleer boşluğu içinde tutan kanonik bir C-terminal endoplazmik retikulum (ER) retansiyon/geri alma sekansıdır. Ost4, oligosakkaritransferaz kompleksinin bir alt birimidir; bu, ER ve NE'de lokalize olan ve yeni ortaya çıkan polipeptitlerin N-glikozilasyonunu katalize eden bir membran protein kompleksidir. Ost4 füzyon proteini Ost4-EGFP-MTn'nin C terminüsü sitozol ile karşı karşıyadır. Mito, mitokondriyal matristeki füzyon proteini Mito-acGFP-MTn'yi hedef alan mitokondriyal bir hedefleme dizisidir.
HPF/FSF numune preparasyonu, aldehit fiksatörleri yerine tanik asit ve uranil asetat kullanımı ile birleştirildiğinde, iyi membran kontrastı ile mükemmel ultra yapıyı korumuştur (Şekil 2, Şekil 3 ve Şekil 4). Numunenin genel yapısı, belirgin sitoplazma ve lipit ekstraksiyonu olmadan yoğundu. Membran yapısı belirgin bir deformasyon olmadan pürüzsüzdü ve fosfolipid çift katmanlı yapı açıkça ortaya çıktı.
İyi korunmuş ultrayapıya ek olarak, farklı organel özelliklerini temsil eden her üç durumda da etkili etiketleme gözlenmiştir. EGFP-MTn-KDEL proteini, yalnızca periferik ER lümeninde ve NE'nin perinükleer boşluğunda dağılmış 2-5 nm boyutlu altın nanopartiküller olarak ortaya çıkmıştır (Şekil 2A-C). İyi korunmuş ultrayapı, etiketlenmiş proteinlerin tek moleküllü tanımlanmasını sağlamakla kalmadı, aynı zamanda ER-mitokondri etkileşimleri gibi organel etkileşimlerinin analizini de kolaylaştırdı (Şekil 2D, E). Ost4-EGFP-MTn proteininin nanopartikülleri ER membranını (Şekil 3A-D) ve NE'nin dış zarını (Şekil 3E) tanımlamıştır. Nanopartiküller ayrıca NE'nin iç zarına da dağıtıldı, ancak oradaki nanopartiküllerin sayısı dış zardan daha düşüktü, bu da iç ve dış zarların protein bileşiminin farklı olduğunu gösteriyordu (Şekil 3E). Benzer şekilde, Mito-acGFP-MTn-eksprese eden hücreler, mitokondriyal matriste spesifik etiketleme sergilemiştir (Şekil 4A-E). Veziküllerde veya ER'de hiçbir parçacık gözlenmedi (Şekil 4A-D) ve MVB'lerde az sayıda parçacık gösterildi (Şekil 4D).
Şekil 1: Klonlanabilir elektron mikroskobu etiketleme teknolojisinin iş akışı için şema . (A) Safir diskler hücre kültürü için etiketlenir ve sterilize edilir. (B) Hücreler 35 mm'lik bir kültür kabında safir diskler üzerinde yetiştirilir. (C) Hücreli safir diskler, yüksek basınçlı dondurma için 0,025 mm derinliğinde alüminyum taşıyıcılarla kaplanır ve ekstra alan 1-hekzadesen ile doldurulur. (D) Hücreler HPF tarafından kriyosabitlenir. (E) Donma-ikame fiksasyonu. (F) ANSM tabanlı AuNP sentezinin şematik adımları. (G) Hücreli safir diskler düz tabanlı gömme kapsüllerine gömülüdür. Reçine blokları ultra ince kesitleme için kesilir. (H) Kesilmiş reçine blokları bir ultramikrotom ile kesitlenmiştir. (I) Ultra ince kesitler TEM ile görüntülenir. Kısaltmalar: ANSM = otonükleasyon bastırma mekanizması; AuNP = altın nanopartikül; HPF = yüksek basınçlı donma; FSF = dondurarak ikame fiksasyonu; TEM = transmisyon elektron mikroskobu. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: HeLa hücrelerinde eksprese edilen EGFP-MTn-KDEL üzerinde ANSM bazlı AuNP sentezi. (A,D) EGFP-MTn-KDEL'i eksprese eden HeLa hücrelerinin 90 nm kalınlığındaki bir bölümünün EM görüntüleri, özellikle endoplazmik retikulumun lümeninde ve nükleer zarfın perinükleer boşluğunda biriken AuNP'leri göstermektedir. Mitokondri, lizozom, çekirdek veya sitozolde az sayıda parçacık gözlenir. (B,C) Kırmızı ve sarı dikdörtgen alanlarının sırasıyla (A) içinde yakınlaştırılmış görüntüleri. (E) (D)'deki yeşil dikdörtgen alanın yakınlaştırılmış görüntüsü. Bu rakam Jiang ve ark.26'dan değiştirilmiştir. Ölçek çubukları = (B,C,E) 200 nm; (A,D) 500 nm. Kısaltmalar: ANSM = otonükleasyon bastırma mekanizması; AuNP = altın nanopartikül; EGFP = gelişmiş yeşil floresan proteini; ER = endoplazmik retikulum; NE = nükleer zarf; M = mitokondri; Lyso = lizozom; N = çekirdek. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: HeLa hücrelerinde eksprese edilen Ost4-EGFP-MTn üzerinde ANSM tabanlı AuNP sentezi. Ost4-EGFP-MTn'yi eksprese eden HeLa hücrelerinin 90 nm kalınlığındaki bir bölümünün EM görüntüleri, özellikle endoplazmik retikulumun zarında biriken AuNP'leri göstermektedir. (E) Ost4-EGFP-MTn'yi eksprese eden HeLa hücrelerinin 90 nm kalınlığındaki bir bölümünün EM görüntüsü, özellikle NE'nin (nükleer zarf) zarında biriken AuNP'leri gösterir. Mitokondri, lizozom, çekirdek veya sitozolde az sayıda parçacık gözlenir. (C) (A)'daki kırmızı dikdörtgen alanın yakınlaştırılmış görüntüsü. Bu rakam Jiang ve ark.26'dan değiştirilmiştir. Ölçek çubukları = (B-E) 200 nm; (A) 500 nm. Kısaltmalar: ANSM = otonükleasyon bastırma mekanizması; AuNP = altın nanopartikül; EGFP = gelişmiş yeşil floresan proteini; ER = endoplazmik retikulum; NE = nükleer zarf; M = mitokondri; Lyso = lizozom; N = çekirdek; EM = elektron mikroskobu. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: HeLa hücrelerinde eksprese edilen Mito-acGFP-MTn üzerinde ANSM bazlı AuNP sentezi. Mito-acGFP-MTn'yi eksprese eden HeLa hücrelerinin 90 nm kalınlığındaki bir bölümünün EM görüntüleri, özellikle mitokondri matrisinde (M) biriken AuNP'leri göstermektedir. Endoplazmik retikulumda, çekirdekte, vezikülde, multi-veziküler gövdede veya sitosolde az sayıda parçacık gözlenir. (B,C) Kırmızı ve sarı dikdörtgen alanlarının sırasıyla (A) içinde yakınlaştırılmış görüntüsü. Bu rakam Jiang ve ark.26'dan değiştirilmiştir. Ölçek çubukları = (D,E) 200 nm; (B,C) 500 nm; (A) 1 μm. Kısaltmalar: ANSM = otonükleasyon bastırma mekanizması; AuNP = altın nanopartikül; EGFP = gelişmiş yeşil floresan proteini; ER = endoplazmik retikulum; NE = nükleer zarf; M = mitokondri; Lyso = lizozom; N = çekirdek; V= vezikül; MVB = çok veziküler gövde. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Çalışma burada, hücresel ortamdaki protein moleküllerinin ultrayapısal çözünürlükle tek moleküllü görselleştirilmesi için sağlam bir klonlanabilir EM etiketleme teknolojisi sunmaktadır. Doğrudan genetik olarak kodlanmış sistein bakımından zengin etiketler üzerinde sentezlenen AuNP'ler, hedef proteinlerin açık ve kesin lokalizasyonunu sağlar. Yüksek basınçlı dondurma ve dondurarak ikame tekniği, biyolojik numunelerin ultra yapısını mükemmel bir şekilde korur. Birlikte ele alındığında, burada sunulan klonlanabilir elektron mikroskobu etiketleme teknolojisi, EM ile yerinde hücresel ultrayapısal bağlamlarda tek bir molekülün verimli lokalizasyonu ve tanınması için güçlü bir araç sağlar.
ANSM mekanizması, tiyolat kapaklı altın nanokümeleri sentezlemek için yaygın olarak kullanılan klasik Brust-Schiffrin yönteminde (BSM) 27 tipik bir reaksiyon olan tiyolat-Au (I) polimerleri26'nın otonükleasyon işlemini baskılar. Bu nedenle, ANSM tabanlı AuNP sentez tekniği, 2-6 nm boyutlu AuNP'leri, yüksek sinyal-gürültü oranı ve yüksek verimlilikle EM görselleştirmesi için elektron yoğun etiketler olarak doğrudan sistein bakımından zengin etiketler üzerinde sentezleyebilir. Sayılamayan ve sitozoldeki çözünür proteinler için uygun olmayan DAB polimer birikimine dayanan APEX2 veya HPR etiketleme tekniklerinin aksine, ANSM tabanlı AuNP sentez tekniği şimdiye kadar tek moleküllü tespiti sağlayan tek tekniktir.
Klonlanabilir elektron mikroskobu etiketleme teknolojisinin dezavantajı, ANSM tabanlı AuNP sentez tekniğinin, aldehit fiksatiflerine duyarlı olan sisteinin tiol grubunun aktivitesine dayanmasıdır. Tiyollerin 3,3'-ditiyodipropiyonik asit (DTDPA) ile oksidatif korunması, E. coli ve fisyon mayası S. pombe'de aldehit fiksasyonundan önce uygulanmıştır, bu da iyi morfoloji ve mükemmel etiketleme verimliliği24,25,26 ile sonuçlanmıştır. Bu çalışmada, oksidasyon / fiksasyon yöntemi, ER lümeni ve mitokondri matrisi (EGFP-MTn-KDEL ve Mito-acGFP-MTn hücrelerinde) gibi nispeten oksidatif bir bölmede ifade edilen etiketler için uygun şekilde çalıştı. Bununla birlikte, memeli hücrelerinde sitozolik etiketler (Ost4-GFP-MTn) için suboptimal idi. Bunun nedeni, indirgeyici bölmelerdeki etiketlerin iyi katlanmamış olması ve sitoplazmada bol miktarda bulunan GSH gibi indirgeyici maddelerin oksidasyona direnebilmesi olabilir.
HPF-FSF tekniği, elektron mikroskobu için biyolojik örneklerin ultrayapısal korunmasında altın standarttır. Bu çalışmada, geleneksel kimyasal fiksasyon ve geçirgenlikten tamamen kaçınan HPF / FSF-rehidrasyon-HPF / FSF yöntemi, Ost4-GFP-MTn ile verimli etiketleme elde etti ve mükemmel hücre yapısı elde etti. Ancak, bu yöntemin hala belirli sınırlamaları vardır. İlk olarak, ikinci bir HPF önemli buz kristali hasarına yol açabilir. İkincisi, farklı uranil asetat partilerinin tutarsız kalite ve çözünürlük sorunları vardır. Asiküler çökeltiler, elektron mikroskobu ile görselleştirildiğinde rehidre numunelerde zaman zaman ortaya çıkmıştır. HEPES tamponu ile pH 5.5'te yıkamak bu sorunu hafifletebilir. Üçüncüsü, doku örnekleri için numune hazırlamanın daha fazla optimizasyona ihtiyacı vardır.
Sonuç olarak, ANSM tabanlı AuNP sentez tekniğini HPF / FSF-rehidrasyon-HPF / FSF'nin numune hazırlama yöntemiyle birleştiren klonlanabilir EM etiketleme teknolojisi, hücrelerdeki genetik olarak etiketlenmiş proteinlerin elektron mikroskobu ile kesin olarak tek moleküllü olarak tanımlanmasını sağlar. Mevcut protokol, çok çeşitli biyolojik soruların ele alınmasına izin vermelidir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazar çıkar çatışması olmadığını beyan eder.
Acknowledgments
Burada açıklanan protokol, Jiang et al. (2020) tarafından yayınlanan makaleden türetilmiştir. Bu çalışma, MOST'tan (973 Program no. 2011CB812502 ve 2014CB849902) gelen hibeler ve Pekin Belediye Hükümeti'nin finansman desteği ile desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.025 mm/0.275 mm Aluminum carrier | Beijing Wulundes Biotech Ltd., or Engineering Office of M. Wohlwend | ||
| 0.2 M HEPES buffer | Dissolve HEPES (0.2 M) in 980 mL of ddH2O, then add 10 mL of 100 mM MgCl2 and 10 mL of 100 mM CaCl2 (final concentration 1 mM), respectively, adjust pH to 5.5 | ||
| 1.5 mL MaxyClear snaplock microtube | Axygen Scientific | MCT150C | |
| 2 mL polypropylene screw cap microtubes | Biologix | 81-0204 | |
| 200 mesh hexagonal copper grid | Tedpella inc | G200HEX | |
| 2-mercaptoethanol | Amresco | 0482-250ML | |
| 35 mm cell culture dishes | Corning | 430165 | |
| 50 mL polypropylene centrifuge tubes | Corning | 430928 | |
| Acetone | Beiijng Tong Guang Fine Chemicals Company | 31025 | |
| Automated freeze substitution machine | Leica | AFS2 | |
| Customized 3.05 mm x 0.66 mm specimen holders for HPF | Beijing Wulundes Biotech Ltd. | ||
| D-penicillamine | TCI | P0147 | |
| Dulbecco’s modified Eagle medium | GBICO | C11965500BT | |
| Fetal bovine serum | GBICO | 10099-141C | |
| Flat bottom embedding capsule | Tedpella inc | ||
| Foam cryobox | |||
| Formvar 15/95 resin | Electron Microscopy Sciences | 15800 | |
| HAuCl4 | Sigma | 4022-1G | |
| HEPES | sigma | H3375-500G | |
| HPF machine | Wohlwend | HPF compact01 | |
| Methonal | Beiijng Tong Guang Fine Chemicals Company | 12397 | |
| NaBH4 | Sigma | 480886-25G | |
| OsO4 | Electron Microscopy Sciences | 19110 | |
| PBS-A buffer | Dissolve NaH2PO4 (1.125 mM), Na2HPO4 (3.867 mM), NaCl (100 mM) in 1 L of ddH2O, adjust to pH 7.4 | ||
| Qualitative filter paper (medium speed) | Beyotime Biotechnology | FFT08 | |
| Sapphire discs | Beijing Wulundes Biotech Ltd., or Engineering Office of M. Wohlwend | ||
| Solvent resistant pen | Electron Microscopy Sciences | 62053-B | |
| SPI-Pon 812 resin | SPI Inc | 02659-AB | |
| Transmission electron microscopy | FEI | Tecnai G2 spirit | |
| Trypsin-EDTA | GBICO | C25200-056 | |
| Tweezers | Dumont | ||
| Ultramictotome | Leica | FC7 | |
| Uranyl acetate | Electron Microscopy Sciences | 22400 |
References
- Tsien, R. Y.
- Shaner, N. C., Patterson, G. H., Davidson, M. W.
- Masters, B. R. History of the electron microscope in cell biology. Encylopedia of Life Sciences. , (2009).
- Griffiths, G., Hoppeler, H. Quantitation in immunocytochemistry: Correlation of immunogold labeling to absolute number of membrane antigens. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 34 (11), 1389-1398 (1986).
- Tokuyasu, K. T. A technique for ultracryotomy of cell suspensions and tissues. Journal of Cell Biology. 57 (2), 551-565 (1973).
- Connolly, C. N., Futter, C. E., Gibson, A., Hopkins, C. R., Cutler, D. F. Transport into and out of the Golgi complex studied by transfecting cells with cDNAs encoding horseradish peroxidase. Journal of Cell Biology. 127 (3), 641-652 (1994).
- Grabenbauer, M., et al. Correlative microscopy and electron tomography of GFP through photooxidation. Nature Methods. 2 (11), 857-862 (2005).
- Gaietta, G., et al. Multicolor and electron microscopic imaging of connexin trafficking. Science. 296 (5567), 503-507 (2002).
- Shu, X., et al. A genetically encoded tag for correlated light and electron microscopy of intact cells, tissues, and organisms. PLoS Biology. 9 (4), e1001041 (2011).
- Martell, J. D., et al. Engineered ascorbate peroxidase as a genetically encoded reporter for electron microscopy. Nature Biotechnology. 30 (11), 1143-1148 (2012).
- Lam, S. S., et al. Directed evolution of APEX2 for electron microscopy and proximity labeling. Nature Methods. 12 (1), 51-54 (2015).
- Mavlyutov, T. A., et al. APEX2-enhanced electron microscopy distinguishes sigma-1 receptor localization in the nucleoplasmic reticulum. Oncotarget. 8 (31), 51317-51330 (2017).
- Wang, Q., Mercogliano, C. P., Lowe, J. A ferritin-based label for cellular electron cryotomography. Structure. 19 (2), 147-154 (2011).
- Sano, T., Glazer, A. N., Cantor, C. R. A streptavidin-metallothionein chimera that allows specific labeling of biological materials with many different heavy metal ions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 89 (5), 1534-1538 (1992).
- Mercogliano, C. P., DeRosier, D. J. Gold nanocluster formation using metallothionein: Mass spectrometry and electron microscopy. Journal of Molecular Biology. 355 (2), 211-223 (2006).
- Mercogliano, C. P., DeRosier, D. J. Concatenated metallothionein as a clonable gold label for electron microscopy. Journal of Structural Biology. 160 (1), 70-82 (2007).
- Morphew, M. K., et al. Metallothionein as a clonable tag for protein localization by electron microscopy of cells. Journal of Microscopy. 260 (1), 20-29 (2015).
- Nishino, Y., Yasunaga, T., Miyazawa, A. A genetically encoded metallothionein tag enabling efficient protein detection by electron microscopy. Journal of Electron Microscopy. 56 (3), 93-101 (2007).
- Bouchet-Marquis, C., Pagratis, M., Kirmse, R., Hoenger, A. Metallothionein as a clonable high-density marker for cryo-electron microscopy. Journal of Structural Biology. 177 (1), 119-127 (2012).
- Fukunaga, Y., et al. Electron microscopic analysis of a fusion protein of postsynaptic density-95 and metallothionein in cultured hippocampal neurons. Journal of Electron Microscopy. 56 (4), 119-129 (2007).
- Diestra, E., Fontana, J., Guichard, P., Marco, S., Risco, C. Visualization of proteins in intact cells with a clonable tag for electron microscopy. Journal of Structural Biology. 165 (3), 157-168 (2009).
- Risco, C., et al. sensitive, high-resolution detection of protein molecules in eukaryotic cells using metal-tagging transmission electron microscopy. Structure. 20 (5), 759-766 (2012).
- Ding, S. -W., et al. Noncanonical role for the host Vps4 AAA+ ATPase ESCRT protein in the formation of tomato bushy stunt virus replicase. PLoS Pathogens. 10 (4), e1004087 (2014).
- Jiang, Z., et al. Direct synthesis of gold nanoparticles on cysteine-rich tags in yeast cells. Protocol Exchange. , (2020).
- Jiang, Z., et al. Direct synthesis of gold nanoparticles on cysteine-rich tags in mammalian cells. Protocol Exchange. , (2020).
- Jiang, Z., et al. Genetically encoded tags for direct synthesis of EM-visible gold nanoparticles in cells. Nature Methods. 17 (9), 937-946 (2020).
- Brust, M., Walker, M., Bethell, D., Schiffrin, D. J., Whyman, R. Synthesis of thiol-derivatised gold nanoparticles in a two-phase liquid-liquid system. Journal of the Chemical Society, Chemical Communications. 7, 801-802 (1994).
