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Biology

在细胞中直接合成EM-可见金纳米颗粒,用于蛋白质定位分析,具有保存完好的超微结构

Published: April 28, 2023 doi: 10.3791/65246

Summary

本协议描述了一种可克隆的电子显微镜标记技术,用于使用基于新型自成核抑制机制的金纳米颗粒合成技术检测细胞中的金属硫蛋白标记蛋白。

Abstract

以超微结构分辨率分析细胞中蛋白质分子的精确定位,对于研究所有生物体的各种生理或病理过程具有重要意义。因此,开发可用作电子显微镜探针的可克隆标签具有重要价值,就像荧光蛋白在光学成像领域发挥了至关重要的作用一样。最近发现了自成核抑制机制(ANSM),它允许在富含半胱氨酸的标签上特异性合成金纳米颗粒(AuNPs),例如金属硫蛋白(MT)和防冻蛋白(AFP)。

基于ANSM,开发了一种电子显微镜标记技术,该技术能够以前所未有的标记效率对原核和真核细胞中的标记蛋白进行特异性检测。这项研究说明了在具有良好保存的超微结构的哺乳动物细胞中检测MTn(一种缺乏醛反应性残基的工程MT变体)融合蛋白的方案。在该协议中,使用非醛固定剂(如单宁酸,乙酸铀酰)进行高压冷冻和冷冻取代固定,以保持近乎天然的超微结构并避免醛交联对标签活性的损害。

在基于ANSM的AuNP合成之前,使用简单的一步复液。结果表明,标记蛋白靶向内质网(ER)膜和管腔等多种细胞器,线粒体基质高效、特异性高。这项研究为生物学家提供了一个强大的协议,以解决细胞超微结构背景下单分子水平上的大量生物学问题。

Introduction

在后基因组时代,绿色荧光蛋白(GFP)作为光学显微镜单分子报告基因的发展彻底改变了现代生命科学研究领域12。几十年来,电子显微镜(EM)一直是直观观察细胞超微结构的强大工具,分辨率为纳米级分辨率3;然而,蛋白质分子的精确鉴定和定位仍然具有挑战性。

最常用的EM标记技术是基于抗原 - 抗体反应的免疫电子显微镜(IEM)标记技术。然而,尽管在IEM标记领域已经开发了许多技术,包括预包埋IEM和后嵌入IEM(在树脂切片或水合冷冻切片上),但它仍然存在标记效率低(<10%)45,这与样品制备和抗体质量有关。为了克服这些限制,开发基因编码标签具有巨大的应用潜力。

近年来,EM标签的两种主要类型已被彻底探索。一种类型是DAB染色法,该方法利用APEX2等标签将3,3'-二氨基联苯胺(DAB)氧化为亲渗透聚合物,用于EM可视化678910,1112它可以标记亚细胞区域中的高丰度蛋白质,但不适用于单分子计数。另一种类型利用金属结合蛋白,如铁蛋白13和金属硫蛋白(MT)14,15,16,17,181920,212223242526用于电磁可视化的原位。只有后者具有单分子可视化和计数的真正潜力。铁蛋白的分子尺寸太大(~450 kD),无法用作有前途的标签,而MT的小尺寸(~5 kD)及其通过其20个半胱氨酸结合各种离子的能力引起了极大的关注。一些实验室试图通过直接与Au+孵育来标记纯化的MT融合蛋白或表达MT的细胞。这些尝试初步证明了MT标签可以结合金离子形成高对比度信号,但没有一个真正实现细胞中单个蛋白质的有效鉴定,并且它们并不广泛适用14,15,1617181920,212223

基于ANSM的AuNP合成技术涉及直接在富含半胱氨酸的标签(例如MT,MT变体MTn和MTα,AFP)上合成2-6 nm大小的AuNP,作为EM可视化的电子致密标记,是细胞中蛋白质标记和单分子检测的第一个可靠且适用的方法242526.它允许在分离的标签融合蛋白上特异性合成AuNPs,并在非固定或化学固定的原核(大肠杆菌)和真核(S. pombe)细胞中实现了前所未有的标记效率。然而,在哺乳动物细胞甚至组织等更先进的系统中实施相同的协议涉及额外的挑战,例如更复杂的细胞内氧化还原稳态和更脆弱的细胞结构。

本研究提出了一种可克隆的EM标记技术,该技术将基于ANSM的新型AuNP合成技术与HPF / FSF-再水化-HPF / FSF样品制备方法相结合,能够明确单分子鉴定HeLa细胞中ER膜,ER腔和线粒体基质中的标记蛋白。目前的方法综合了标记效率高、信噪比高、单分子标记、通用性强等特点,在生命科学研究中具有广阔的应用前景。

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Protocol

本实验中使用的所有耗材都列在 材料表中。当前协议的分步工作流程如图 1 所示。

1. 蓝宝石盘上的细胞培养

  1. 将 3 mm x 0.16 mm 蓝宝石盘转移到含有 1 mL 乙醇的 2 mL 离心管中,并在超声波清洗器中超声处理 10 分钟。
  2. 在酒精灯火焰中燃烧每个蓝宝石圆盘,直到表面上没有可见的沉积物。
    注意:通过上述方法,蓝宝石盘可以多次回收。
  3. 使用耐溶剂笔在每个蓝宝石圆盘的一侧标记一个数字(图 1A)。
    注意:使用的记号笔需要事先进行测试,以确定它是否耐丙酮和甲醇溶剂,以防止标记丢失。
  4. 将标记的蓝宝石圆盘放在 35 mm 培养皿的底部,标记的一面朝上。
  5. 在紫外线下用蓝宝石盘对细胞培养皿进行灭菌30分钟。
  6. 用镊子翻转蓝宝石光盘(标记的一面朝下),并在紫外线下再消毒 30 分钟。现在,含有蓝宝石盘的培养皿已准备好进行细胞培养。
    注意:蓝宝石盘也可以通过高压灭菌进行灭菌。
  7. 将细胞接种在上面制备的蓝宝石盘上,并在37°C,95%湿度和5%CO2 的细胞培养箱中生长至80%-90%汇合度(图1B)。
    注意:表达MTn标签的稳定HeLa细胞系如Jiang等人26中所述产生。

2. 高压冷冻

注意:本实验使用液氮。使用液氮时,请使用适当的安全程序和个人防护设备,以防止冻伤和窒息。

  1. 根据制造商的说明在实验前至少2小时准备高压冷冻机。
  2. 将 A 型 HPF 铝载体(凹槽:0.025/0.275 mm)转移到含有 1 mL 乙醇的 2 mL 离心管中,并在超声波清洗器中超声处理 10 分钟。
  3. 在覆盖有定性滤纸(中速)的培养皿中干燥载体。
  4. 将预清洁的载体浸泡在1-十六碳烯中。
    注意:在当前的实验中,不建议将BSA用作冷冻保护剂,因为它会干扰随后的金纳米颗粒合成。
  5. 使用细镊子从培养皿中取出带有细胞的蓝宝石盘;用定性滤纸(中速)触摸标记的表面以去除多余的介质。
    注意:水的导热系数很低,残留水过多会影响冷冻效果。保留最少的水以防止细胞变干。
  6. 将蓝宝石圆盘安装到 HPF 试样支架中,并用含有 1-十六烯的 0.025 毫米深铝载体快速盖住圆盘(图 1C)。
  7. 用定性滤纸(中速)吸出过量溶液。
  8. 加载试样支架进行高压冷冻(图1D)。
    注意:试样加载过程需要尽可能快(1 分钟内),以尽量减少由于温度、湿度、pH 值和氧含量变化而导致的生理变化。
  9. 在泡沫冷冻箱中的液氮下卸载蓝宝石盘载体组件,并在使用前将组件存放在液氮中的冷冻管中。
    注意:协议可能在此处暂停。冷冻管中的标本可以在液氮杜瓦瓶中储存多年。

3. 冷冻替代固定(FSF)和补液(图1E

  1. 用液氮填充自动冷冻替代机(AFS),并将腔室冷却至-90°C。
    注意:本实验使用液氮。使用液氮时,请使用适当的安全程序和个人防护设备,以防止冻伤和窒息。
  2. 在通风橱中的20mm圆形聚丙烯容器(图1E)中制备2mL的0.01%单宁酸(w / v)丙酮(FSF溶液1),并将其冷冻在液氮中。
  3. 使用一对预冷的镊子将标本(蓝宝石圆盘载体组件)装入装有LN2下的冷冻FSF溶液1的容器中。
  4. 将容器转移到预冷的AFS室中进行FSF处理,温度为-90°C。
  5. 将样品在-90°C下保持1小时;然后,用预冷镊子将蓝宝石圆盘与载体分开,并确保蓝宝石圆盘的标记侧面朝下。
    注意:镊子必须充分预冷以防止温度变化。蓝宝石圆盘应易于分离。
  6. 在-90°C下再保持8-10小时;然后,在3小时内加热至-60°C。
  7. 用预冷的丙酮替换容器中的FSF溶液1,孵育1小时。重复这种丙酮洗涤2次。
  8. 在3小时内加热至-30°C。在此期间,在2 mL离心管中制备并预冷2mL 0.01%乙酸铀酰丙酮溶液(FSF溶液2,由10%乙酸铀酰在甲醇中稀释)。
    注意:当前实验中使用的乙酸铀酰具有放射性和剧毒;必须按照适当的安全程序进行处理,并作为危险化学废物处理。
  9. 用FSF溶液2替换丙酮,并在-30°C下孵育3小时。
  10. 用预冷的丙酮替换容器中的FSF溶液2,并在-30°C下孵育30分钟。 重复这种丙酮洗涤2次。
  11. 在2小时内从-30°C加热至4°C。
  12. 用 pH 5.5 的 2 mL 含有 1 mM CaCl 2 和 1 mM MgCl 2 的0.2 M HEPES 缓冲液替换丙酮。
  13. 更换缓冲液一次,并在室温下孵育1小时或在4°C孵育过夜。
    注意:方案可以在这里暂停一晚或持续至少6小时,直到在步骤5中再次冷冻标本。

4. 哺乳动物细胞基于ANSM的AuNP合成(图1F

  1. 用PBS-A缓冲液洗涤3次,每次5分钟。
  2. 在室温下将蓝宝石盘转移到含有 1 mL PBS-A 缓冲液的 35 mm 培养皿中。
    注意:始终保持蓝宝石圆盘的标记面朝下,并避免蓝宝石圆盘重叠并擦掉细胞。
  3. 通过将 4.28 μL 2-巯基乙醇加入含有 1 mL PBS-A 缓冲液的 2 mL 离心管中并在通风橱中充分混合来制备还原溶液。
    注意:2-巯基乙醇有毒,有刺激性气味;必须按照适当的安全程序进行处理。
  4. 用1mL还原溶液替换培养皿中的PBS-A缓冲液,并在室温下孵育1小时。
  5. 使用前准备黄金前体。
    1. 将 80 μL 10 mM HAuCl4 中的 ddH 2 O 加入含有 1 mL 还原溶液的2mL 离心管中,并立即涡旋。
      注意:解决方案可能会变得浑浊。
    2. 将 80 μL 500 mM D-青霉胺的 ddH 2 O 加入上述溶液中,并立即涡旋。
      注意:解决方案可能会再次变得清晰。
  6. 用步骤4.5中制备的1mL金前体溶液替换培养皿中的溶液,并在4°C下孵育2小时。
    注意:一毫升金前体足以与大约1×106 个细胞(在35毫米培养皿上汇合)反应。当AuNPs明显变小时,需要更大体积的前体。
  7. 称取 0.0038 g NaBH 4 到 1.5 mL 离心管中,加入 1 mL 冰冷的 ddH2O,并在使用前涡旋制成新鲜的 100 mM NaBH4
  8. 将 20-100 μL 的 100 mM NaBH 4 加入步骤4.6 的溶液中,立即摇匀混合,并在室温下孵育 5 分钟。
    注意:新鲜准备 100 mM NaBH4 以立即使用。加入NaBH4后,溶液的颜色会逐渐变红,然后加深。如果没有观察到颜色变化,则在很大程度上表明实验失败。
  9. 用 2 mL PBS-A 缓冲液替换溶液以停止反应。
    注意:在30分钟内停止反应至关重要,因为长时间的反应会逐渐分解AuNP。

5.高压冷冻和冷冻替代固定(图1C-F

注意:标本再次是HPF和FSF,程序与前面在第2节和第3节中描述的程序几乎相同,但进行了一些修改。

  1. 在丙酮中制备1%四氧化锇和0.1%乙酸铀酰(FSF溶液3,由4%四氧化锇丙酮溶液和10%乙酸铀酰甲醇稀释)。
    注意:四氧化锇和乙酸铀酰是剧毒化学品;它们必须按照适当的安全程序进行处理,并作为危险化学废物处理。
  2. 使用一对预冷镊子将标本(蓝宝石圆盘载体组件)装入装有LN2下的冷冻FSF溶液3的容器中。
  3. 将容器转移到预冷的AFS室中进行-90°C的FSF处理,并按如下方式运行FSF程序:在-90°C下保持8-10小时;然后,在3小时内加热至-60°C;在-60°C下保持3小时;然后,在3小时内加热至-30°C;在-30°C下保持3小时;然后,在2小时内加热至4°C。
  4. 当温度达到4°C时,将试样转移到通风橱中,并在室温下保持15分钟。
  5. 用丙酮洗涤3次,每次15分钟。
  6. 在室温下在丙酮中保持至少2小时。

6. 树脂浸润、包埋和聚合

  1. 使用前,请根据制造商的说明准备环氧树脂混合物。
    注意:当前实验中使用的环氧树脂在聚合之前是有毒的;必须按照适当的安全程序进行处理。未聚合的树脂在处置前应作为危险化学废物处理或聚合。
  2. 将蓝宝石盘转移到平底包埋胶囊中,并在室温下用树脂浸润至少 30 分钟。
    注意:保持蓝宝石圆盘的标记侧面朝下。
  3. 将样品在60°C的烘箱中聚合至少18小时。
    注意:聚合后,协议可以在此处暂停。聚合的试样块可以在干燥的容器中储存多年。

7. 超薄切片

  1. 使用剃须刀小心修剪聚合的试样块,露出蓝宝石盘。
  2. 将带有蓝宝石圆盘的块尖端浸入液氮中几秒钟,然后在室温下解冻。重复冻融动作几次,将光盘从块上拆下。
    注意:避免长时间冷冻,因为这可能会使试样块破裂。用刀片轻轻地拆下蓝宝石圆盘,避免过度用力,以免损坏样品。
  3. 将块面修剪为梯形形状以进行超薄切片(图1G)。
  4. 用超薄切片机获得70-100nm超薄切片(图1H)。
  5. 在 200 目六角形铜网格上选取截面。
    注意:分段后,协议可以在此处暂停。腰带上的部分可以在干燥的容器中存放多年。如果需要,网格上的切片可以用2%铀酰丙酮染色,以获得更好的膜对比度。应避免铅染色,因为它会掩盖纳米金颗粒信号。

8. 透射电镜成像(图1I

  1. 使用透射电子显微镜检查铜栅上的超薄切片。通常,11 kX 至 30 kX 的放大倍率范围适用于可视化细胞中的 AuNP,并且需要适当的散焦值以确保 2-3 nm AuNP 可见。

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Representative Results

基于ANSM的AuNP合成技术是用TEM26标记和检测MT标记蛋白的非常有用的工具。为了验证其在哺乳动物细胞中的稳健性,在Hela细胞中产生了三种表达EGFP-MTn-KDEL,Ost4-EGFP-MTn或Mito-acGFP-MTn的稳定细胞系。KDEL是一个规范的C端内质网(ER)保留/检索序列,其将融合蛋白EGFP-MTn-KDEL维持在ER腔内或核包膜(NE)的核周空间内。Ost4是寡糖转移酶复合物的一个亚基,寡糖转移酶复合物是一种位于ER和NE中的膜蛋白复合物,可催化新生多肽的N-糖基化。Ost4融合蛋白Ost4-EGFP-MTn的C末端面向细胞质。Mito是一种线粒体靶向序列,靶向线粒体基质中的融合蛋白Mito-acGFP-MTn。

HPF/FSF样品制备与使用单宁酸和乙酸铀酰代替醛固定剂相结合,保留了优异的超微结构和良好的膜对比度(图2、图3图4)。样品整体结构致密,无明显的细胞质和脂质提取。膜结构光滑,无明显变形,磷脂双层结构明显显露。

除了保存完好的超微结构外,在所有三种情况下都观察到有效的标记,代表不同的细胞器特异性。EGFP-MTn-KDEL蛋白表现为2-5nm大小的金纳米颗粒,专门分布在NE的外周ER腔和核周空间中(图2A-C)。保存完好的超微结构不仅能够单分子鉴定标记的蛋白质,而且还有助于分析细胞器相互作用,例如ER-线粒体相互作用(图2DE)。Ost4-EGFP-MTn蛋白的纳米颗粒描绘了ER膜(图3A-D)和NE的外膜(图3E)。纳米颗粒也分布在NE的内膜上,但纳米颗粒的数量低于外膜,表明内膜和外膜的蛋白质组成不同(图3E)。同样,表达Mito-acGFP-MTn的细胞在线粒体基质中表现出特异性标记(图4A-E)。在囊泡或ER中未观察到颗粒(图4A-D),并且在MVB中显示很少的颗粒(图4D)。

Figure 1
图 1:可克隆电子显微镜标记技术的工作流程方案 。 (A) 对蓝宝石盘进行标记和灭菌以进行细胞培养。(B)细胞在35毫米培养皿中的蓝宝石盘上生长。(C)带电池的蓝宝石盘上盖有0.025毫米深的铝载体,用于高压冷冻,多余的空间充满1-十六烯。(D)细胞通过HPF冷冻固定。()冻替固定。(F)基于ANSM的AuNP合成的示意图步骤。(G)带有细胞的蓝宝石盘嵌入平底包埋胶囊中。树脂块经过修整以实现超薄切片。(H)修剪过的树脂块用超薄切片机切片。(I)超薄切片用TEM成像。缩写:ANSM = 自成核抑制机制;AuNP = 金纳米颗粒;HPF = 高压冷冻;FSF = 冷冻替代固定;透射电镜 = 透射电子显微镜。 请点击此处查看此图的大图。

Figure 2
图2:在HeLa细胞中表达的EGFP-MTn-KDEL上基于ANSM的AuNP合成 。 (AD)表达EGFP-MTn-KDEL的90 nm厚的HeLa细胞切片的EM图像显示AuNPs特异性地积累在内质网腔和核包膜的核周空间中。在线粒体、溶酶体、细胞核或细胞质中观察到的颗粒很少。()(A) 中红色和黄色矩形区域的放大图像。(E) (D) 中绿色矩形区域的放大图像。这个数字是从Jiang等人26修改而来的。比例尺 = (BCE) 200 nm;(AD) 500 纳米。缩写:ANSM = 自成核抑制机制;AuNP = 金纳米颗粒;EGFP = 增强绿色荧光蛋白;ER = 内质网;NE = 核包膜;M = 线粒体;溶酶=溶酶体;N = 细胞核。 请点击此处查看此图的大图。

Figure 3
图3:在HeLa细胞中表达的Ost4-EGFP-MTn上基于ANSM的AuNP合成。 表达Ost4-EGFP-MTn的90 nm厚的HeLa细胞切片的EM图像显示AuNPs特异性地积累在内质网膜上。E)表达Ost4-EGFP-MTn的90nm厚的HeLa细胞切片的EM图像显示AuNPs特异性地积累在NE(核包膜)的膜上。在线粒体、溶酶体、细胞核或细胞质中观察到的颗粒很少。(C) (A) 中红色矩形区域的放大图像。这个数字是从Jiang等人26修改而来的。比例尺 = (B-E) 200 nm;(A) 500 纳米。缩写:ANSM = 自成核抑制机制;AuNP = 金纳米颗粒;EGFP = 增强绿色荧光蛋白;ER = 内质网;NE = 核包膜;M = 线粒体;溶酶=溶酶体;N = 细胞核;EM = 电子显微镜。请点击此处查看此图的大图。

Figure 4
图 4:在 HeLa 细胞中表达的 Mito-acGFP-MTn 上基于 ANSM 的 AuNP 合成。 表达 Mito-acGFP-MTn 的 90 nm 厚的 HeLa 细胞切片的 EM 图像显示在线粒体 (M) 基质中特异性积累的 AuNP。在内质网、细胞核、囊泡、多囊泡体或细胞质中观察到的颗粒很少。()(A) 中红色和黄色矩形区域的放大图像。这个数字是从Jiang等人26修改而来的。比例尺 = (DE) 200 nm;(BC) 500 纳米;(A) 1微米。缩写:ANSM = 自成核抑制机制;AuNP = 金纳米颗粒;EGFP = 增强绿色荧光蛋白;ER = 内质网;NE = 核包膜;M = 线粒体;溶酶=溶酶体;N = 细胞核;V=囊泡;MVB = 多泡体。请点击此处查看此图的大图。

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Discussion

该研究在这里展示了一种强大的可克隆EM标记技术,用于以超微结构分辨率在细胞环境中对蛋白质分子进行单分子可视化。直接在富含半胱氨酸的基因编码标签上合成的AuNPs提供了目标蛋白的明确和精确的定位。高压冷冻和冷冻替代技术很好地保留了生物样品的超微结构。综上所述,这里介绍的可克隆电子显微镜标记技术为在细胞超微结构环境中使用EM原 定位和识别单个分子提供了强大的工具。

ANSM机制抑制了硫代-Au(I)聚合物26的自成核过程,这是经典的Brust-Schiffrin方法(BSM)27 中的典型反应,广泛用于合成硫代盐封端的金纳米簇。因此,基于ANSM的AuNP合成技术可以直接在富含半胱氨酸的标签上特异性合成2-6 nm尺寸的AuNPs作为电子致密标签,用于EM可视化,具有高信噪比和高效率。与依赖于DAB聚合物沉积的APEX2或HPR标记技术不同,DAB聚合物沉积是不可计数的,并且不适合细胞质中的可溶性蛋白质,基于ANSM的AuNP合成技术是迄今为止唯一能够进行单分子检测的技术。

可克隆电镜标记技术的缺点是基于ANSM的AuNP合成技术依赖于半胱氨酸的硫醇基团的活性,半胱氨酸对醛固定剂敏感。在大肠杆菌和裂变酵母柚子的醛固定之前,已经引入了3,3'-二硫代二丙酸(DTDPA)对硫醇的氧化保护,从而产生了良好的形貌和优异的标记效率242526在这项工作中,氧化/固定方法适用于那些在相对氧化区室中表达的标签,例如ER腔和线粒体基质(在EGFP-MTn-KDEL和Mito-acGFP-MTn细胞中)。然而,它对哺乳动物细胞中的胞质标签(Ost4-GFP-MTn)并不理想。原因可能是还原室中的标签折叠不好,细胞质中大量存在的还原性物质如GSH可以抵抗氧化。

HPF-FSF技术是用于电子显微镜的生物标本超微结构保存的黄金标准。本工作采用HPF/FSF-再水化-HPF/FSF方法完全避免了常规的化学固定和透化,实现了Ost4-GFP-MTn的高效标记,并获得了优异的细胞结构。但是,这种方法仍然有一定的局限性。首先,第二次HPF可能导致严重的冰晶损伤。其次,不同批次的醋酸铀酰存在质量和溶解度不一致的问题。当通过电子显微镜观察时,再水化的样品中偶尔会出现针状沉淀。用pH 5.5的HEPES缓冲液洗涤可以缓解这个问题。第三,组织样本的样品制备需要进一步优化。

综上所述,基于ANSM的AuNP合成技术与HPF/FSF-复水化-HPF/FSF的样品制备方法相结合,通过电子显微镜对细胞中的基因标记蛋白进行明确的单分子鉴定。目前的协议应该允许解决大量的生物学问题。

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Disclosures

作者声明不存在利益冲突。

Acknowledgments

此处描述的协议源自 Jiang 等人 (2020) 发表的文章。这项工作得到了科技部的资助(973项目编号2011CB812502和2014CB849902)和北京市政府的资助。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.025 mm/0.275 mm Aluminum carrier Beijing Wulundes Biotech Ltd., or Engineering Office of M. Wohlwend
0.2 M HEPES buffer Dissolve HEPES (0.2 M) in 980 mL of ddH2O, then add 10 mL of 100 mM MgCl2 and 10 mL of 100 mM CaCl2 (final concentration 1 mM), respectively, adjust pH to 5.5
1.5 mL MaxyClear snaplock microtube Axygen Scientific MCT150C
2 mL polypropylene screw cap microtubes Biologix 81-0204
200 mesh hexagonal copper grid Tedpella inc G200HEX
2-mercaptoethanol Amresco 0482-250ML
35 mm cell culture dishes Corning 430165
50 mL polypropylene centrifuge tubes Corning 430928
Acetone Beiijng Tong Guang Fine Chemicals Company 31025
Automated freeze substitution machine Leica AFS2
Customized 3.05 mm x 0.66 mm specimen holders for HPF Beijing Wulundes Biotech Ltd.
D-penicillamine TCI P0147
Dulbecco’s modified Eagle medium GBICO C11965500BT
Fetal bovine serum GBICO 10099-141C
Flat bottom embedding capsule Tedpella inc
Foam cryobox
Formvar 15/95 resin Electron Microscopy Sciences 15800
HAuCl4 Sigma 4022-1G
HEPES sigma  H3375-500G
HPF machine Wohlwend  HPF compact01
Methonal  Beiijng Tong Guang Fine Chemicals Company 12397
NaBH4 Sigma 480886-25G
OsO4 Electron Microscopy Sciences 19110
PBS-A buffer Dissolve NaH2PO4 (1.125 mM), Na2HPO4 (3.867 mM), NaCl (100 mM) in 1 L of ddH2O, adjust to pH 7.4
Qualitative filter paper (medium speed) Beyotime Biotechnology FFT08
Sapphire discs Beijing Wulundes Biotech Ltd., or Engineering Office of M. Wohlwend
Solvent resistant pen Electron Microscopy Sciences 62053-B
SPI-Pon 812 resin SPI Inc 02659-AB
Transmission electron microscopy FEI Tecnai G2 spirit
Trypsin-EDTA GBICO C25200-056
Tweezers Dumont
Ultramictotome Leica FC7
Uranyl acetate Electron Microscopy Sciences 22400

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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生物学,第194期,富半胱氨酸标签,电子显微镜,金纳米颗粒,金属硫蛋白,AuNP合成,单分子,高压冷冻,冷冻替代固定,超微结构,EM标记
在细胞中直接合成EM-可见金纳米颗粒,用于蛋白质定位分析,具有保存完好的超微结构
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Jiang, Z. Direct Synthesis ofMore

Jiang, Z. Direct Synthesis of EM-Visible Gold Nanoparticles in Cells for Protein Localization Analysis with Well-Preserved Ultrastructure. J. Vis. Exp. (194), e65246, doi:10.3791/65246 (2023).

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