在细胞中直接合成EM-可见金纳米颗粒，用于蛋白质定位分析，具有保存完好的超微结构
Summary
本协议描述了一种可克隆的电子显微镜标记技术，用于使用基于新型自成核抑制机制的金纳米颗粒合成技术检测细胞中的金属硫蛋白标记蛋白。
Abstract
以超微结构分辨率分析细胞中蛋白质分子的精确定位，对于研究所有生物体的各种生理或病理过程具有重要意义。因此，开发可用作电子显微镜探针的可克隆标签具有重要价值，就像荧光蛋白在光学成像领域发挥了至关重要的作用一样。最近发现了自成核抑制机制（ANSM），它允许在富含半胱氨酸的标签上特异性合成金纳米颗粒（AuNPs），例如金属硫蛋白（MT）和防冻蛋白（AFP）。
基于ANSM，开发了一种电子显微镜标记技术，该技术能够以前所未有的标记效率对原核和真核细胞中的标记蛋白进行特异性检测。这项研究说明了在具有良好保存的超微结构的哺乳动物细胞中检测MTn（一种缺乏醛反应性残基的工程MT变体）融合蛋白的方案。在该协议中，使用非醛固定剂（如单宁酸，乙酸铀酰）进行高压冷冻和冷冻取代固定，以保持近乎天然的超微结构并避免醛交联对标签活性的损害。
在基于ANSM的AuNP合成之前，使用简单的一步复液。结果表明，标记蛋白靶向内质网（ER）膜和管腔等多种细胞器，线粒体基质高效、特异性高。这项研究为生物学家提供了一个强大的协议，以解决细胞超微结构背景下单分子水平上的大量生物学问题。
Introduction
在后基因组时代，绿色荧光蛋白（GFP）作为光学显微镜单分子报告基因的发展彻底改变了现代生命科学研究领域1，2。几十年来，电子显微镜（EM）一直是直观观察细胞超微结构的强大工具，分辨率为纳米级分辨率3;然而，蛋白质分子的精确鉴定和定位仍然具有挑战性。
最常用的EM标记技术是基于抗原 – 抗体反应的免疫电子显微镜（IEM）标记技术。然而，尽管在IEM标记领域已经开发了许多技术，包括预包埋IEM和后嵌入IEM（在树脂切片或水合冷冻切片上），但它仍然存在标记效率低（<10%）4，5，这与样品制备和抗体质量有关。为了克服这些限制，开发基因编码标签具有巨大的应用潜力。
近年来，EM标签的两种主要类型已被彻底探索。一种类型是DAB染色法，该方法利用APEX2等标签将3，3′-二氨基联苯胺（DAB）氧化为亲渗透聚合物，用于EM可视化6，7，8，9，10，11，12。它可以标记亚细胞区域中的高丰度蛋白质，但不适用于单分子计数。另一种类型利用金属结合蛋白，如铁蛋白13和金属硫蛋白（MT）14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，在用于电磁可视化的原位。只有后者具有单分子可视化和计数的真正潜力。铁蛋白的分子尺寸太大（~450 kD），无法用作有前途的标签，而MT的小尺寸（~5 kD）及其通过其20个半胱氨酸结合各种离子的能力引起了极大的关注。一些实验室试图通过直接与Au+孵育来标记纯化的MT融合蛋白或表达MT的细胞。这些尝试初步证明了MT标签可以结合金离子形成高对比度信号，但没有一个真正实现细胞中单个蛋白质的有效鉴定，并且它们并不广泛适用14，15，16，17，18，19，20，21，22，23。
基于ANSM的AuNP合成技术涉及直接在富含半胱氨酸的标签（例如MT，MT变体MTn和MTα，AFP）上合成2-6 nm大小的AuNP，作为EM可视化的电子致密标记，是细胞中蛋白质标记和单分子检测的第一个可靠且适用的方法24，25，26.它允许在分离的标签融合蛋白上特异性合成AuNPs，并在非固定或化学固定的原核（大肠杆菌）和真核（S. pombe）细胞中实现了前所未有的标记效率。然而，在哺乳动物细胞甚至组织等更先进的系统中实施相同的协议涉及额外的挑战，例如更复杂的细胞内氧化还原稳态和更脆弱的细胞结构。
本研究提出了一种可克隆的EM标记技术，该技术将基于ANSM的新型AuNP合成技术与HPF / FSF-再水化-HPF / FSF样品制备方法相结合，能够明确单分子鉴定HeLa细胞中ER膜，ER腔和线粒体基质中的标记蛋白。目前的方法综合了标记效率高、信噪比高、单分子标记、通用性强等特点，在生命科学研究中具有广阔的应用前景。
Protocol
Representative Results
Discussion
该研究在这里展示了一种强大的可克隆EM标记技术，用于以超微结构分辨率在细胞环境中对蛋白质分子进行单分子可视化。直接在富含半胱氨酸的基因编码标签上合成的AuNPs提供了目标蛋白的明确和精确的定位。高压冷冻和冷冻替代技术很好地保留了生物样品的超微结构。综上所述，这里介绍的可克隆电子显微镜标记技术为在细胞超微结构环境中使用EM原 位 定位和识别单个分子提供了强大?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
此处描述的协议源自 Jiang 等人 （2020） 发表的文章。这项工作得到了科技部的资助（973项目编号2011CB812502和2014CB849902）和北京市政府的资助。
Materials
| 0.025 mm/0.275 mm Aluminum carrier | Beijing Wulundes Biotech Ltd., or Engineering Office of M. Wohlwend | ||
| 0.2 M HEPES buffer | Dissolve HEPES (0.2 M) in 980 mL of ddH2O, then add 10 mL of 100 mM MgCl2 and 10 mL of 100 mM CaCl2 (final concentration 1 mM), respectively, adjust pH to 5.5 | ||
| 1.5 mL MaxyClear snaplock microtube | Axygen Scientific | MCT150C | |
| 2 mL polypropylene screw cap microtubes | Biologix | 81-0204 | |
| 200 mesh hexagonal copper grid | Tedpella inc | G200HEX | |
| 2-mercaptoethanol | Amresco | 0482-250ML | |
| 35 mm cell culture dishes | Corning | 430165 | |
| 50 mL polypropylene centrifuge tubes | Corning | 430928 | |
| Acetone | Beiijng Tong Guang Fine Chemicals Company | 31025 | |
| Automated freeze substitution machine | Leica | AFS2 | |
| Customized 3.05 mm x 0.66 mm specimen holders for HPF | Beijing Wulundes Biotech Ltd. | ||
| D-penicillamine | TCI | P0147 | |
| Dulbecco’s modified Eagle medium | GBICO | C11965500BT | |
| Fetal bovine serum | GBICO | 10099-141C | |
| Flat bottom embedding capsule | Tedpella inc | ||
| Foam cryobox | |||
| Formvar 15/95 resin | Electron Microscopy Sciences | 15800 | |
| HAuCl4 | Sigma | 4022-1G | |
| HEPES | sigma | H3375-500G | |
| HPF machine | Wohlwend | HPF compact01 | |
| Methonal | Beiijng Tong Guang Fine Chemicals Company | 12397 | |
| NaBH4 | Sigma | 480886-25G | |
| OsO4 | Electron Microscopy Sciences | 19110 | |
| PBS-A buffer | Dissolve NaH2PO4 (1.125 mM), Na2HPO4 (3.867 mM), NaCl (100 mM) in 1 L of ddH2O, adjust to pH 7.4 | ||
| Qualitative filter paper (medium speed) | Beyotime Biotechnology | FFT08 | |
| Sapphire discs | Beijing Wulundes Biotech Ltd., or Engineering Office of M. Wohlwend | ||
| Solvent resistant pen | Electron Microscopy Sciences | 62053-B | |
| SPI-Pon 812 resin | SPI Inc | 02659-AB | |
| Transmission electron microscopy | FEI | Tecnai G2 spirit | |
| Trypsin-EDTA | GBICO | C25200-056 | |
| Tweezers | Dumont | ||
| Ultramictotome | Leica | FC7 | |
| Uranyl acetate | Electron Microscopy Sciences | 22400 |
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