Summary
वर्तमान प्रोटोकॉल एक नए ऑटोन्यूक्लियेशन दमन तंत्र-आधारित सोने के नैनोपार्टिकल संश्लेषण तकनीक का उपयोग करके कोशिकाओं में मेटलोथियोनिन-टैग किए गए प्रोटीन का पता लगाने के लिए एक क्लोनेबल इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी लेबलिंग तकनीक का वर्णन करता है।
Abstract
अल्ट्रास्ट्रक्चरल रिज़ॉल्यूशन के साथ कोशिकाओं में प्रोटीन अणुओं के सटीक स्थानीयकरण का विश्लेषण करना सभी जीवित जीवों में विभिन्न शारीरिक या रोग प्रक्रियाओं के अध्ययन के लिए बहुत महत्वपूर्ण है। इसलिए, क्लोनेबल टैग का विकास जिसे इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी जांच के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है, बहुत मूल्य का है, जैसे फ्लोरोसेंट प्रोटीन ने ऑप्टिकल इमेजिंग के क्षेत्र में महत्वपूर्ण भूमिका निभाई है। ऑटोन्यूक्लियेशन दमन तंत्र (एएनएसएम) को हाल ही में उजागर किया गया था, जो सिस्टीन-समृद्ध टैग, जैसे मेटलोथियोनिन (एमटी) और एंटीफ्ऱीज़ प्रोटीन (एएफपी) पर सोने के नैनोकणों (एयूएनपी) के विशिष्ट संश्लेषण की अनुमति देता है।
एएनएसएम के आधार पर, एक इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी लेबलिंग तकनीक विकसित की गई थी, जो एक अभूतपूर्व लेबलिंग दक्षता के साथ प्रोकैरियोटिक और यूकेरियोटिक कोशिकाओं में टैग किए गए प्रोटीन का विशिष्ट पता लगाने में सक्षम बनाती है। यह अध्ययन अच्छी तरह से संरक्षित अल्ट्रास्ट्रक्चर के साथ स्तनधारी कोशिकाओं में एमटीएन (एल्डिहाइड-प्रतिक्रियाशील अवशेषों की कमी वाला एक इंजीनियर एमटी संस्करण) संलयन प्रोटीन का पता लगाने के लिए एक प्रोटोकॉल दिखाता है। इस प्रोटोकॉल में, उच्च दबाव ठंड और फ्रीज-प्रतिस्थापन निर्धारण गैर-एल्डिहाइड फिक्सेटिव (जैसे टैनिक एसिड, यूरिनिल एसीटेट) का उपयोग करके किया गया था ताकि निकट-देशी अल्ट्रास्ट्रक्चर को संरक्षित किया जा सके और एल्डिहाइड क्रॉसलिंकिंग के कारण टैग गतिविधि को नुकसान से बचाया जा सके।
एएनएसएम-आधारित एयूएनपी संश्लेषण से पहले एक सरल एक-चरण पुनर्जलीकरण का उपयोग किया गया था। परिणामों से पता चला कि टैग किए गए प्रोटीन ने एंडोप्लाज्मिक रेटिकुलम (ईआर) के झिल्ली और लुमेन सहित विभिन्न ऑर्गेनेल को लक्षित किया, और माइटोकॉन्ड्रियल मैट्रिसेस का उच्च दक्षता और विशिष्टता के साथ पता लगाया गया। यह शोध जीवविज्ञानियों को सेलुलर अल्ट्रास्ट्रक्चरल संदर्भों में एकल-अणु स्तर पर जैविक प्रश्नों की एक विशाल श्रृंखला को संबोधित करने के लिए एक मजबूत प्रोटोकॉल प्रदान करता है।
Introduction
पोस्टजीनोमिक युग में, प्रकाश माइक्रोस्कोपी के लिए एकल-अणु रिपोर्टर के रूप में हरे फ्लोरोसेंट प्रोटीन (जीएफपी) के विकास ने आधुनिक जीवन विज्ञान अनुसंधान 1,2 के क्षेत्र में क्रांति ला दी है। दशकों से, इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (ईएम) नैनोस्केल रिज़ॉल्यूशन3 के साथ सेलुलर अल्ट्रास्ट्रक्चर को सहज रूप से देखने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण रहा है; हालांकि, प्रोटीन अणुओं की सटीक पहचान और स्थानीयकरण चुनौतीपूर्ण बना हुआ है।
सबसे अधिक इस्तेमाल की जाने वाली ईएम लेबलिंग तकनीक इम्यूनोइलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (आईईएम) लेबलिंग तकनीक है, जो एंटीजन-एंटीबॉडी प्रतिक्रिया पर आधारित है। हालांकि, हालांकि आईईएम लेबलिंग के क्षेत्र में कई तकनीकों को विकसित किया गया है, जिसमें पूर्व-एम्बेडिंग आईईएम और पोस्ट-एम्बेडिंग आईईएम (राल अनुभागों या हाइड्रेटेड क्रायोसेक्शन पर) शामिल हैं, फिर भी यह कम लेबलिंग दक्षता (<10%) 4,5 से ग्रस्त है, जो नमूना तैयारी और एंटीबॉडी गुणवत्ता से संबंधित है। इन सीमाओं को दूर करने के लिए, आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड टैग विकसित करने में बड़ी अनुप्रयोग क्षमता है।
हाल के वर्षों में दो मुख्य प्रकार के ईएम टैग का पूरी तरह से पता लगाया गया है। एक प्रकार डीएबी स्टेनिंग विधि है, जो ईएम विज़ुअलाइज़ेशन 6,7,8,9,10,11,12 के लिए ओस्मियोफिलिक पॉलिमर में 3,3'-डायमिनोबेंज़िडीन (डीएबी) को ऑक्सीकरण करने के लिए एपेक्स 2 जैसे टैग का उपयोग करता है। यह उपकोशिकीय क्षेत्रों में उच्च-बहुतायत प्रोटीन के लेबलिंग को सक्षम बनाता है लेकिन एकल-अणु गिनती के लिए उपयुक्त नहीं है। अन्य प्रकार धातु-बाध्यकारी प्रोटीन का उपयोग करता है, जैसे फेरिटिन 13 और मेटलोथियोनिन (एमटी) 14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26, ईएम विज़ुअलाइज़ेशन के लिए सीटू। केवल उत्तरार्द्ध में एकल-अणु विज़ुअलाइज़ेशन और गिनती के लिए वास्तविक क्षमता है। फेरिटिन का आणविक आकार एक आशाजनक टैग के रूप में उपयोग किए जाने के लिए बहुत बड़ा (~ 450 केडी) है, जबकि एमटी के छोटे आकार (~ 5 केडी) और इसके 20 सिस्टीन के माध्यम से विभिन्न आयनों को बांधने की इसकी क्षमता ने बहुत ध्यान आकर्षित किया है। कई प्रयोगशालाओं ने एयू + के साथ सीधे इंजेक्ट करके शुद्ध एमटी-फ्यूजन प्रोटीन या एमटी-व्यक्त करने वाली कोशिकाओं को लेबल करने की कोशिश की है। इन प्रयासों ने शुरू में साबित कर दिया है कि एमटी टैग उच्च-कंट्रास्ट सिग्नल बनाने के लिए सोने के आयनों को बांध सकते हैं, लेकिन किसी ने भी वास्तव में कोशिकाओं में व्यक्तिगत प्रोटीन की प्रभावी पहचान हासिल नहीं की है, और वे व्यापक रूप से लागू नहीं हैं 14,15,16,17,18,19,20,21,22,23।
एएनएसएम-आधारित एयूएनपी संश्लेषण तकनीक, जिसमें ईएम विज़ुअलाइज़ेशन के लिए इलेक्ट्रॉन-घने लेबल के रूप में सिस्टीन-समृद्ध टैग (जैसे, एमटी, एमटी वेरिएंट एमटीएन और एमटी, एएफपी) पर सीधे 2-6 एनएम-आकार के एयूएनपी को संश्लेषित करना शामिल है, कोशिकाओं में प्रोटीन लेबलिंग और एकल अणु का पता लगाने के लिए पहला विश्वसनीय और लागू दृष्टिकोण है।. यह पृथक टैग संलयन प्रोटीन पर एयूएनपी के विशिष्ट संश्लेषण की अनुमति देता है और गैर-निर्धारित या रासायनिक रूप से निश्चित प्रोकैरियोटिक (ई कोलाई) और यूकेरियोटिक (एस पोम्बे) कोशिकाओं में एक अभूतपूर्व लेबलिंग दक्षता हासिल की है। हालांकि, स्तनधारी कोशिकाओं या यहां तक कि ऊतकों जैसे अधिक उन्नत प्रणालियों में एक ही प्रोटोकॉल को लागू करने में अतिरिक्त चुनौतियां शामिल हैं, जैसे कि अधिक जटिल इंट्रासेल्युलर रेडॉक्स होमियोस्टैसिस और अधिक नाजुक सेलुलर संरचना।
यह अध्ययन एक क्लोनेबल ईएम लेबलिंग तकनीक प्रस्तुत करता है, जो एचपीएफ / एफएसएफ-पुनर्जलीकरण-एचपीएफ / एफएसएफ नमूना तैयारी विधि के साथ आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड सिस्टीन-समृद्ध टैग (एमटी) को लेबल करने के लिए नई एएनएसएम-आधारित एयूएनपी संश्लेषण तकनीक को जोड़ती है, ईआर झिल्ली, ईआर लुमेन और हेला कोशिकाओं में माइटोकॉन्ड्रियल मैट्रिक्स में टैग किए गए प्रोटीन की स्पष्ट एकल-अणु पहचान को सक्षम बनाती है। वर्तमान विधि उच्च लेबलिंग दक्षता, एक उच्च सिग्नल-टू-शोर अनुपात, एकल-अणु लेबलिंग और मजबूत सार्वभौमिकता की विशेषताओं को जोड़ती है, और इस विधि में जीवन विज्ञान अनुसंधान में व्यापक अनुप्रयोग संभावनाएं हैं।
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
इस प्रयोग में उपयोग की जाने वाली सभी आपूर्ति सामग्री की तालिका में सूचीबद्ध हैं। वर्तमान प्रोटोकॉल का चरण-दर-चरण वर्कफ़्लो चित्र 1 में दिखाया गया है।
1. नीलम डिस्क पर सेल कल्चर
- 3 मिमी x 0.16 मिमी नीलम डिस्क को 2 एमएल सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें जिसमें 1 एमएल इथेनॉल होता है, और 10 मिनट के लिए अल्ट्रासोनिक क्लीनर में सोनिकेट होता है।
- प्रत्येक नीलम डिस्क को अल्कोहल लैंप लौ में तब तक जलाएं जब तक कि सतह पर कोई दिखाई न दे।
नोट: उपरोक्त विधि के माध्यम से, नीलम डिस्क को कई बार पुनर्नवीनीकरण किया जा सकता है। - विलायक-प्रतिरोधी पेन (चित्रा 1 ए) का उपयोग करके प्रत्येक नीलम डिस्क के एक तरफ को एक संख्या के साथ लेबल करें।
नोट: उपयोग किए जाने वाले मार्कर पेन को यह निर्धारित करने के लिए परीक्षण करने की आवश्यकता है कि क्या यह निशान के नुकसान को रोकने के लिए अग्रिम में एसीटोन और मेथनॉल सॉल्वैंट्स के लिए प्रतिरोधी है। - लेबल किए गए नीलम डिस्क को 35 मिमी कल्चर डिश के निचले हिस्से पर लेबल साइड के साथ रखें।
- 30 मिनट के लिए यूवी प्रकाश के तहत नीलम डिस्क के साथ सेल कल्चर डिश को स्टरलाइज़ करें।
- नीलम डिस्क को चिमटी (नीचे की ओर लेबल किया गया) के साथ फ्लिप करें, और अतिरिक्त 30 मिनट के लिए यूवी प्रकाश के नीचे निष्फल करें। अब, नीलम डिस्क युक्त कल्चर डिश सेल कल्चर के लिए तैयार है।
नोट: नीलम डिस्क को ऑटोक्लेविंग द्वारा भी निष्फल किया जा सकता है। - ऊपर तैयार नीलम डिस्क पर कोशिकाओं को बीज दें, और 37 डिग्री सेल्सियस, 95% आर्द्रता और 5% सीओ2 (चित्रा 1 बी) पर सेल इनक्यूबेटर में 80% -90% कंफ्लुएंसी तक बढ़ जाएं।
नोट: एमटीएन टैग व्यक्त करने वाली स्थिर हेला सेल लाइनें जियांग एट अल .26 में वर्णित के रूप में उत्पन्न हुई थीं।
2. उच्च दबाव ठंड (एचपीएफ)
सावधानी: इस प्रयोग में तरल नाइट्रोजन का उपयोग किया जाता है। तरल नाइट्रोजन के साथ काम करते समय, शीतदंश और श्वासावरोध को रोकने के लिए उचित सुरक्षा प्रक्रियाओं और व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरणों का उपयोग करें।
- निर्माता के निर्देशों के अनुसार प्रयोग से कम से कम 2 घंटे पहले उच्च दबाव फ्रीजिंग मशीन तैयार करें।
- टाइप ए एचपीएफ एल्यूमीनियम वाहक (अवकाश: 0.025/0.275 मिमी) को 2 एमएल सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें जिसमें 1 एमएल इथेनॉल होता है, और 10 मिनट के लिए अल्ट्रासोनिक क्लीनर में सोनिकेट होता है।
- गुणात्मक फिल्टर पेपर (मध्यम गति) के साथ कवर किए गए पेट्री डिश में वाहक को सुखाएं।
- पहले से साफ किए गए वाहक को 1-हेक्साडेसिन में भिगोदें।
नोट: बीएसए को वर्तमान प्रयोग में क्रायोप्रोटेक्टेंट के रूप में अनुशंसित नहीं किया गया है क्योंकि यह बाद में सोने के नैनोपार्टिकल संश्लेषण में हस्तक्षेप करेगा। - कल्चर डिश से कोशिकाओं के साथ नीलम डिस्क लेने के लिए ठीक चिमटी का उपयोग करें; अतिरिक्त माध्यम को हटाने के लिए गुणात्मक फ़िल्टर पेपर (मध्यम गति) के साथ लेबल की गई सतह को स्पर्श करें।
नोट: पानी की तापीय चालकता बहुत कम है, और बहुत अधिक अवशिष्ट पानी ठंड प्रभाव को प्रभावित करेगा। कोशिकाओं को सूखने से बचाने के लिए कम से कम पानी बनाए रखें। - नीलम डिस्क को एचपीएफ नमूना धारक में माउंट करें, और 1-हेक्साडेसीन युक्त 0.025 मिमी गहरे एल्यूमीनियम वाहक के साथ डिस्क को जल्दी से कैप करें (चित्रा 1 सी)।
- गुणात्मक फिल्टर पेपर (मध्यम गति) के साथ अतिरिक्त घोल को एस्पिरेट करें।
- उच्च दबाव ठंड के लिए नमूना धारक लोड करें (चित्रा 1 डी)।
नोट: तापमान, आर्द्रता, पीएच और ऑक्सीजन सामग्री में परिवर्तन के कारण शारीरिक परिवर्तनों को कम करने के लिए नमूना लोडिंग प्रक्रिया को यथासंभव तेज (1 मिनट के भीतर) होना चाहिए। - फोम क्रायोबॉक्स में तरल नाइट्रोजन के तहत नीलम डिस्क-वाहक असेंबली को अनलोड करें, और उपयोग करने से पहले तरल नाइट्रोजन में एक क्रायोवियल में असेंबली स्टोर करें।
नोट: प्रोटोकॉल यहाँ रोक दिया जा सकता है। क्रायोवियल में नमूने वर्षों तक तरल नाइट्रोजन देवर में संग्रहीत किए जा सकते हैं।
3. फ्रीज-प्रतिस्थापन निर्धारण (एफएसएफ) और पुनर्जलीकरण (चित्रा 1 ई)।
- तरल नाइट्रोजन के साथ स्वचालित फ्रीज-प्रतिस्थापन मशीन (एएफएस) भरें, और कक्ष को -90 डिग्री सेल्सियस तक ठंडा करें।
सावधानी: इस प्रयोग में तरल नाइट्रोजन का उपयोग किया जाता है। तरल नाइट्रोजन के साथ काम करते समय, शीतदंश और श्वासावरोध को रोकने के लिए उचित सुरक्षा प्रक्रियाओं और व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरणों का उपयोग करें। - एक फ्यूम हुड में 20 मिमी गोल पॉलीप्रोपाइलीन कंटेनर (चित्रा 1 ई) में एसीटोन (एफएसएफ समाधान 1) में 0.01% टैनिक एसिड (डब्ल्यू / वी) का 2 एमएल तैयार करें और इसे तरल नाइट्रोजन में फ्रीज करें।
- नमूने (नीलम डिस्क-वाहक असेंबली) को एलएन 2 के तहत जमे हुए एफएसएफ समाधान 1 के साथ कंटेनर में प्रीकूल्ड चिमटी की एक जोड़ी का उपयोग करके लोड करें।
- -90 डिग्री सेल्सियस पर एफएसएफ प्रसंस्करण के लिए कंटेनर को प्रीकूल्ड एएफएस चैंबर में स्थानांतरित करें।
- नमूनों को 1 घंटे के लिए -90 डिग्री सेल्सियस पर रखें; फिर, नीलम डिस्क को प्रीकूल्ड चिमटी के साथ वाहक से अलग करें, और सुनिश्चित करें कि नीलम डिस्क के चिह्नित पक्ष नीचे की ओर हैं।
नोट: तापमान परिवर्तन को रोकने के लिए चिमटी को पर्याप्त रूप से ठंडा किया जाना चाहिए। नीलम डिस्क को आसानी से अलग किया जाना चाहिए। - आगे 8-10 घंटे के लिए -90 डिग्री सेल्सियस पर रखें; फिर, 3 घंटे के भीतर -60 डिग्री सेल्सियस तक गर्म करें।
- कंटेनर में एफएसएफ समाधान 1 को प्रीकूल्ड एसीटोन के साथ बदलें, और 1 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें। इस एसीटोन धोने को 2 x दोहराएं।
- 3 घंटे के भीतर -30 डिग्री सेल्सियस तक गर्म करें। इस अवधि के दौरान, 2 एमएल सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में एसीटोन (एफएसएफ समाधान 2, मेथनॉल में 10% यूरिनल एसीटेट से पतला) में 0.01% यूरिनिल एसीटेट के 2 एमएल तैयार करें और प्रीकूल करें।
चेतावनी: वर्तमान प्रयोग में उपयोग किया जाने वाला यूरिनाइल एसीटेट, रेडियोधर्मी और अत्यधिक विषाक्त है; इसे उचित सुरक्षा प्रक्रियाओं के अनुसार संभाला जाना चाहिए और खतरनाक रासायनिक कचरे के रूप में निपटाया जाना चाहिए। - एसीटोन को एफएसएफ समाधान 2 के साथ बदलें, और 3 घंटे के लिए -30 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
- कंटेनर में एफएसएफ समाधान 2 को प्रीकूल्ड एसीटोन के साथ बदलें, और -30 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें। इस एसीटोन धोने को 2 x दोहराएं।
- 2 घंटे के भीतर -30 डिग्री सेल्सियस से 4 डिग्री सेल्सियस तक गर्म करें।
- एसीटोन को 0.2 एम एचईपीईएस बफर के 2 एमएल के साथ बदलें जिसमें पीएच 5.5 पर 1 एमएम सीएसीएल 2 और 1 एमएम एमजीसीएल2 हो।
- बफर को एक बार बदलें, और कमरे के तापमान पर 1 घंटे या रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
नोट: प्रोटोकॉल को यहां एक रात के लिए रोका जा सकता है या कम से कम 6 घंटे तक जारी रखा जा सकता है जब तक कि नमूने चरण 5 में फिर से जमे हुए न हों।
4. स्तनधारी कोशिकाओं के लिए एएनएसएम-आधारित एयूएनपी संश्लेषण (चित्रा 1 एफ)।
- हर बार 5 मिनट के लिए पीबीएस-ए बफर 3 x के साथ धोएं।
- नीलम डिस्क को कमरे के तापमान पर पीबीएस-ए बफर के 1 एमएल युक्त 35 मिमी कल्चर डिश में स्थानांतरित करें।
नोट: नीलम डिस्क के चिह्नित किनारों को हमेशा नीचे की ओर रखें, और नीलम डिस्क को ओवरलैप करने और कोशिकाओं को रगड़ने से बचें। - 2-मर्काप्टोइथेनॉल के 4.28 μL को 2 एमएल सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में जोड़कर कम करने वाला समाधान तैयार करें जिसमें 1 एमएल पीबीएस-ए बफर होता है और फ्यूम हुड में अच्छी तरह से मिलाया जाता है।
सावधानी: 2-मर्कैप्टोएथेनॉल विषाक्त है और इसमें तीखी गंध है; इसे उचित सुरक्षा प्रक्रियाओं के अनुसार संभाला जाना चाहिए। - कल्चर डिश में पीबीएस-ए बफर को 1 एमएल कम करने वाले घोल के साथ बदलें, और कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें।
- उपयोग करने से पहले सोने का अग्रदूत तैयार करें।
- डीडीएच 2 ओ में 10 एमएम एचएयूसीएल4 के 80 μL को2एमएल सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में जोड़ें जिसमें 1 एमएल कम करने वाला घोल हो, और तुरंत भंवर।
नोट: समाधान बादल हो सकता है। - उपरोक्त घोल में डीडीएच 2 ओ में 500 एमएम डी-पेनिसिलामाइन के 80 μL जोड़ें, और तुरंत भंवर।
नोट: समाधान फिर से स्पष्ट हो सकता है।
- डीडीएच 2 ओ में 10 एमएम एचएयूसीएल4 के 80 μL को2एमएल सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में जोड़ें जिसमें 1 एमएल कम करने वाला घोल हो, और तुरंत भंवर।
- कल्चर डिश में समाधान को चरण 4.5 में तैयार किए गए 1 मिलीलीटर सोने के अग्रदूत समाधान के साथ बदलें, और 4 डिग्री सेल्सियस पर 2 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें।
नोट: सोने के अग्रदूत का एक मिलीलीटर लगभग 1 × 106 कोशिकाओं (35 मिमी डिश पर कंफ्लुएंट) के साथ प्रतिक्रिया करने के लिए पर्याप्त है। अग्रदूत की बड़ी मात्रा की आवश्यकता होती है जब एयूएनपी काफी छोटे हो जाते हैं। - 1.5 एमएल सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में एनएबीएच 4 के 0.0038 ग्राम वजन करें, उपयोग से ठीक पहले ताजा 100 एमएम एनएबीएच4 बनाने के लिए 1 मिलीलीटर बर्फ-ठंडा डीडीएच2ओ और भंवर जोड़ें।
- चरण 4.6 से घोल में 100 mM NaBH4 के 20-100 μL जोड़ें, अच्छी तरह से मिश्रण करने के लिए तुरंत हिलाएं, और कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
नोट: तत्काल उपयोग के लिए 100 mM NaBH4 ताजा तैयार करें। एनएबीएच4 जोड़ने के बाद, घोल का रंग धीरे-धीरे लाल हो जाएगा और फिर गहरा हो जाएगा। यदि कोई रंग परिवर्तन नहीं देखा जाता है, तो यह काफी हद तक इंगित करता है कि प्रयोग विफल हो गया है। - प्रतिक्रिया को रोकने के लिए समाधान को 2 एमएल पीबीएस-ए बफर के साथ बदलें।
नोट: 30 मिनट के भीतर प्रतिक्रिया को रोकना महत्वपूर्ण है, क्योंकि लंबे समय तक प्रतिक्रिया धीरे-धीरे एयूएनपी को तोड़ देगी।
5. उच्च दबाव ठंड और फ्रीज-प्रतिस्थापन निर्धारण (चित्रा 1 सी-एफ)।
नोट: नमूने फिर से एचपीएफ और एफएसएफ हैं, और प्रक्रिया लगभग वही है जो पहले कुछ संशोधनों के साथ धारा 2 और धारा 3 में वर्णित थी।
- एसीटोन में 1% ऑस्मियम टेट्रोक्साइड और 0.1% यूरिनिल एसीटेट तैयार करें (एफएसएफ समाधान 3, एसीटोन में 4% ऑस्मियम टेट्रोक्साइड और मेथनॉल में 10% यूरिनिल एसीटेट से पतला)।
चेतावनी: ऑस्मियम टेट्रोक्साइड और यूरिनिल एसीटेट अत्यधिक जहरीले रसायन हैं; उन्हें उचित सुरक्षा प्रक्रियाओं के अनुसार संभाला जाना चाहिए और खतरनाक रासायनिक कचरे के रूप में निपटाया जाना चाहिए। - प्रीकूल्ड चिमटी की एक जोड़ी का उपयोग करके एलएन 2 के तहत जमे हुए एफएसएफ समाधान 3 के साथ कंटेनर में नमूने (नीलम डिस्क-वाहक विधानसभा) लोड करें।
- कंटेनर को -90 डिग्री सेल्सियस पर एफएसएफ प्रसंस्करण के लिए प्रीकूल्ड एएफएस चैंबर में स्थानांतरित करें, और एफएसएफ प्रोग्राम को निम्नानुसार चलाएं: 8-10 घंटे के लिए -90 डिग्री सेल्सियस पर रखें; फिर, 3 घंटे के भीतर -60 डिग्री सेल्सियस तक गर्म; 3 घंटे के लिए -60 डिग्री सेल्सियस पर रखें; फिर, 3 घंटे के भीतर -30 डिग्री सेल्सियस तक गर्म; 3 घंटे के लिए -30 डिग्री सेल्सियस पर रखें; फिर, 2 घंटे के भीतर 4 डिग्री सेल्सियस तक गर्म करें।
- जब तापमान 4 डिग्री सेल्सियस तक पहुंच जाता है, तो नमूनों को फ्यूम हुड में स्थानांतरित करें, और 15 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर बनाए रखें।
- हर बार 15 मिनट के लिए एसीटोन 3x से धोएं।
- कम से कम 2 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर एसीटोन में बनाए रखें।
6. राल घुसपैठ, एम्बेडिंग और पोलीमराइजेशन
- उपयोग करने से पहले निर्माता के निर्देशों के अनुसार एपॉक्सी राल मिश्रण तैयार करें।
सावधानी: वर्तमान प्रयोग में उपयोग किया जाने वाला एपॉक्सी राल पोलीमराइजेशन से पहले विषाक्त है; इसे उचित सुरक्षा प्रक्रियाओं के अनुसार संभाला जाना चाहिए। निपटान से पहले अनपॉलीमराइज्ड राल को खतरनाक रासायनिक अपशिष्ट या पॉलीमराइज्ड के रूप में निपटाया जाना चाहिए। - नीलम डिस्क को फ्लैट-बॉटम एम्बेडिंग कैप्सूल में स्थानांतरित करें, और कमरे के तापमान पर कम से कम 30 मिनट के लिए राल के साथ घुसपैठ करें।
नोट: नीलम डिस्क के चिह्नित किनारों को नीचे की ओर रखें। - कम से कम 18 घंटे के लिए ओवन में 60 डिग्री सेल्सियस पर नमूना को पॉलीमराइज्ड करें।
नोट: पोलीमराइजेशन के बाद प्रोटोकॉल को यहां रोका जा सकता है। पॉलीमराइज्ड नमूना ब्लॉक को वर्षों तक सूखे कंटेनर में संग्रहीत किया जा सकता है।
7. अल्ट्राथिन सेक्शनिंग
- नीलम डिस्क को उजागर करने के लिए रेजर का उपयोग करके पॉलीमराइज्ड नमूना ब्लॉक को सावधानीपूर्वक ट्रिम करें।
- नीलम डिस्क के साथ ब्लॉक टिप्स को तरल नाइट्रोजन में कई सेकंड के लिए डुबोएं, और कमरे के तापमान पर पिघलें। ब्लॉक से डिस्क को अलग करने के लिए फ्रीज-पिघलने की क्रिया को कई बार दोहराएं।
नोट: लंबे समय तक ठंड से बचें, क्योंकि इससे नमूना ब्लॉक क्रैक हो सकते हैं। नीलम डिस्क को धीरे से ब्लेड से अलग करें, अत्यधिक बल से बचें, जो नमूनों को नुकसान पहुंचा सकता है। - अल्ट्राथिन-सेक्शनिंग के लिए ब्लॉक चेहरे को एक ट्रेपोज़ॉइडल आकार में ट्रिम करें (चित्रा 1 जी)।
- अल्ट्रामाइक्रोटोम (चित्रा 1 एच) के साथ 70-100 एनएम अल्ट्राथिन अनुभाग प्राप्त करें।
- 200-जाल हेक्सागोनल कॉपर ग्रिड पर अनुभाग चुनें।
नोट: अनुभागके बाद प्रोटोकॉल को यहां रोका जा सकता है। गर्डों पर अनुभागों को वर्षों तक सूखे कंटेनर में संग्रहीत किया जा सकता है। यदि वांछित हो, तो ग्रिड पर अनुभागों को बेहतर झिल्ली कंट्रास्ट प्राप्त करने के लिए 2% यूरिनल एसीटोन के साथ दाग दिया जा सकता है। लीड धुंधला होने से बचना चाहिए क्योंकि यह नैनोगोल्ड कण संकेतों को मुखौटा करेगा।
8. टीईएम इमेजिंग (चित्रा 1 आई)।
- ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप का उपयोग करके कॉपर ग्रिड पर अल्ट्राथिन वर्गों की जांच करें। आमतौर पर, 11 kX से 30 kX तक की आवर्धन सीमा कोशिकाओं में AUNPs की कल्पना करने के लिए उपयुक्त है, और यह सुनिश्चित करने के लिए एक उपयुक्त डीफोकस मान की आवश्यकता होती है कि 2-3 nm AUNPs दिखाई दे रहे हैं।
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
एएनएसएम-आधारित एयूएनपी संश्लेषण तकनीक टीईएम26 के साथ एमटी-टैग किए गए प्रोटीन को लेबल करने और पता लगाने के लिए एक अत्यंत उपयोगी उपकरण है। स्तनधारी कोशिकाओं में इसकी मजबूती को मान्य करने के लिए, हेला कोशिकाओं में ईजीएफपी-एमटीएन-केडीईएल, ओएसटी 4-ईजीएफपी-एमटीएन, या मिटो-एसीजीएफपी-एमटीएन को व्यक्त करने वाली तीन स्थिर सेल लाइनें उत्पन्न हुईं। केडीईएल एक कैननिकल सी-टर्मिनल एंडोप्लाज्मिक रेटिकुलम (ईआर) प्रतिधारण / पुनर्प्राप्ति अनुक्रम है, जो ईआर लुमेन या परमाणु लिफाफे (एनई) के पेरिन्यूक्लियर स्पेस के भीतर संलयन प्रोटीन ईजीएफपी-एमटीएन-केडीईएल को बनाए रखता है। ओस्ट 4 ऑलिगोसैकरिलट्रांसफेरेज़ कॉम्प्लेक्स का एक सबयूनिट है, जो ईआर और एनई में स्थानीयकृत एक झिल्ली प्रोटीन कॉम्प्लेक्स है जो नवजात पॉलीपेप्टाइड्स के एन-ग्लाइकोसिलेशन को उत्प्रेरित करता है। ओस्ट 4 फ्यूजन प्रोटीन ओएसटी 4-ईजीएफपी-एमटीएन का सी टर्मिनस साइटोसोल का सामना करता है। माइटो एक माइटोकॉन्ड्रियल लक्ष्यीकरण अनुक्रम है जो माइटोकॉन्ड्रियल मैट्रिक्स में संलयन प्रोटीन मिटो-एसीजीएफपी-एमटीएन को लक्षित करता है।
एफएसएफ नमूना तैयारी, एल्डिहाइड फिक्सेटिव के बजाय टैनिक एसिड और यूरिनिल एसीटेट के उपयोग के साथ मिलकर, अच्छे झिल्ली कंट्रास्ट (चित्रा 2, चित्रा 3, और चित्रा 4) के साथ उत्कृष्ट अल्ट्रास्ट्रक्चर संरक्षित किया। नमूने की समग्र संरचना स्पष्ट साइटोप्लाज्म और लिपिड निष्कर्षण के बिना घनी थी। झिल्ली संरचना चिकनी थी, स्पष्ट विरूपण के बिना, और फॉस्फोलिपिड बाइलेयर संरचना स्पष्ट रूप से प्रकट हुई थी।
अच्छी तरह से संरक्षित अल्ट्रास्ट्रक्चर के अलावा, अलग-अलग ऑर्गेनेल विशिष्टताओं का प्रतिनिधित्व करने वाले सभी तीन मामलों में कुशल लेबलिंग देखी गई। ईजीएफपी-एमटीएन-केडीईएल प्रोटीन 2-5 एनएम आकार के सोने के नैनोकणों के रूप में दिखाई दिया, जो विशेष रूप से परिधीय ईआर लुमेन और एनई के पेरिन्यूक्लियर स्पेस में वितरित किए गए (चित्रा 2 ए-सी)। अच्छी तरह से संरक्षित अल्ट्रास्ट्रक्चर ने न केवल टैग किए गए प्रोटीन की एकल-अणु पहचान को सक्षम किया, बल्कि ईआर-माइटोकॉन्ड्रिया इंटरैक्शन (चित्रा 2 डी, ई) जैसे ऑर्गेनेल इंटरैक्शन के विश्लेषण की सुविधा भी प्रदान की। ओस्ट 4-ईजीएफपी-एमटीएन प्रोटीन के नैनोकणों ने ईआर झिल्ली (चित्रा 3 ए-डी) और एनई की बाहरी झिल्ली (चित्रा 3 ई) को चित्रित किया। नैनोकणों को एनई की आंतरिक झिल्ली पर भी वितरित किया गया था, लेकिन वहां नैनोकणों की संख्या बाहरी झिल्ली की तुलना में कम थी, यह दर्शाता है कि आंतरिक और बाहरी झिल्ली की प्रोटीन संरचना अलग थी (चित्रा 3 ई)। इसी तरह, मिटो-एसीजीएफपी-एमटीएन-व्यक्त करने वाली कोशिकाओं ने माइटोकॉन्ड्रियल मैट्रिक्स (चित्रा 4 ए-ई) में विशिष्ट लेबलिंग का प्रदर्शन किया। पुटिकाओं या ईआर (चित्रा 4 ए-डी) में कोई कण नहीं देखा गया था, और कुछ कणों को एमवीबी (चित्रा 4 डी) में दिखाया गया था।
चित्रा 1: क्लोनेबल इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी लेबलिंग तकनीक के वर्कफ़्लो के लिए योजना । (ए) नीलम डिस्क को सेल कल्चर के लिए लेबल और स्टरलाइज़ किया जाता है। (बी) कोशिकाओं को 35 मिमी कल्चर डिश में नीलम डिस्क पर उगाया जाता है। (सी) कोशिकाओं के साथ नीलम डिस्क को उच्च दबाव ठंड के लिए 0.025 मिमी गहरे एल्यूमीनियम वाहक के साथ कवर किया जाता है, और अतिरिक्त स्थान 1-हेक्साडेसिन से भरा होता है। (डी) कोशिकाओं को एचपीएफ द्वारा क्रायोफिक्स किया जाता है। (ई) फ्रीज-प्रतिस्थापन निर्धारण। (एफ) एएनएसएम-आधारित एयूएनपी संश्लेषण के योजनाबद्ध चरण। (जी) कोशिकाओं के साथ नीलम डिस्क फ्लैट-बॉटम एम्बेडिंग कैप्सूल में एम्बेडेड होते हैं। अल्ट्राथिन सेक्शनिंग के लिए राल ब्लॉकों को ट्रिम किया जाता है। (एच) छंटनी किए गए राल ब्लॉकों को एक अल्ट्रामाइक्रोटोम के साथ वर्गीकृत किया जाता है। (I) अल्ट्राथिन खंडों को टीईएम के साथ चित्रित किया गया है। संक्षेप: एएनएसएम = ऑटोन्यूक्लियेशन दमन तंत्र; एयूएनपी = गोल्ड नैनोपार्टिकल; एचपीएफ = उच्च दबाव ठंड; एफएसएफ = फ्रीज-प्रतिस्थापन निर्धारण; टीईएम = ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 2: ईजीएफपी-एमटीएन-केडीईएल पर एएनएसएम-आधारित एयूएनपी संश्लेषण हेला कोशिकाओं में व्यक्त किया गया। (ए, डी) ईजीएफपी-एमटीएन-केडीईएल को व्यक्त करने वाले हेला कोशिकाओं के 90 एनएम मोटे खंड की ईएम छवियां विशेष रूप से एंडोप्लाज्मिक रेटिकुलम के लुमेन में और परमाणु लिफाफे के पेरिन्यूक्लियर स्पेस में जमा एयूएनपी दिखाती हैं। माइटोकॉन्ड्रिया, लाइसोसोम, नाभिक या साइटोसोल में कुछ कण देखे जाते हैं। (बी, सी) (ए) में क्रमशः लाल और पीले आयत क्षेत्रों की ज़ूम-इन छवियां। (E) (D) में हरे आयत क्षेत्र की ज़ूम-इन छवि। इस आंकड़े को जियांग एट अल.26 से संशोधित किया गया है। स्केल बार = (बी, सी, ई) 200 एनएम; (ए, डी) 500 एनएम। संक्षेप: एएनएसएम = ऑटोन्यूक्लियेशन दमन तंत्र; एयूएनपी = गोल्ड नैनोपार्टिकल; ईजीएफपी = बढ़ा हुआ हरा फ्लोरोसेंट प्रोटीन; ईआर = एंडोप्लाज्मिक रेटिकुलम; एनई = परमाणु लिफाफा; एम = माइटोकॉन्ड्रिया; लाइसो = लाइसोसोम; एन = नाभिक। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 3: ओएसटी 4-ईजीएफपी-एमटीएन पर एएनएसएम-आधारित एयूएनपी संश्लेषण हेला कोशिकाओं में व्यक्त किया गया है। (ए-डी) ओस्ट 4-ईजीएफपी-एमटीएन को व्यक्त करने वाले हेला कोशिकाओं के 90 एनएम मोटे खंड की ईएम छवियां विशेष रूप से एंडोप्लाज्मिक रेटिकुलम की झिल्ली पर जमा एयूएनपी दिखाती हैं। (ई) ओस्ट4-ईजीएफपी-एमटीएन को व्यक्त करने वाले हेला कोशिकाओं के 90 एनएम मोटे खंड की एक ईएम छवि विशेष रूप से एनई (परमाणु लिफाफे) की झिल्ली पर जमा एयूएनपी को दर्शाती है। माइटोकॉन्ड्रिया, लाइसोसोम, नाभिक या साइटोसोल में कुछ कण देखे जाते हैं। (C) (A) में लाल आयत क्षेत्र की ज़ूम-इन छवि। इस आंकड़े को जियांग एट अल.26 से संशोधित किया गया है। स्केल बार = (बी-ई) 200 एनएम; (ए) 500 एनएम। संक्षेप: एएनएसएम = ऑटोन्यूक्लियेशन दमन तंत्र; एयूएनपी = गोल्ड नैनोपार्टिकल; ईजीएफपी = बढ़ा हुआ हरा फ्लोरोसेंट प्रोटीन; ईआर = एंडोप्लाज्मिक रेटिकुलम; एनई = परमाणु आवरण; एम = माइटोकॉन्ड्रिया; लाइसो = लाइसोसोम; एन = नाभिक; ईएम = इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 4: हेला कोशिकाओं में व्यक्त माइटो-एसीजीएफपी-एमटीएन पर एएनएसएम-आधारित एयूएनपी संश्लेषण। (ए, डी, ई) हेला कोशिकाओं के 90 एनएम मोटे खंड की ईएम छवियां मिटो-एसीजीएफपी-एमटीएन को व्यक्त करती हैं जो विशेष रूप से माइटोकॉन्ड्रिया (एम) के मैट्रिक्स में संचित एयूएनपी दिखाती हैं। एंडोप्लाज्मिक रेटिकुलम, न्यूक्लियस, पुटिका, बहु-वेसिकुलर शरीर या साइटोसोल में कुछ कण देखे जाते हैं। (बी, सी) (ए) में क्रमशः लाल और पीले आयत क्षेत्रों की ज़ूम-इन छवि। इस आंकड़े को जियांग एट अल.26 से संशोधित किया गया है। स्केल बार = (डी, ई) 200 एनएम; (बी, सी) 500 एनएम; (ए) 1 μm। संक्षेप: एएनएसएम = ऑटोन्यूक्लियेशन दमन तंत्र; एयूएनपी = गोल्ड नैनोपार्टिकल; ईजीएफपी = बढ़ा हुआ हरा फ्लोरोसेंट प्रोटीन; ईआर = एंडोप्लाज्मिक रेटिकुलम; एनई = परमाणु लिफाफा; एम = माइटोकॉन्ड्रिया; लाइसो = लाइसोसोम; एन = नाभिक; वी = पुटिका; एमवीबी = बहु-वेसिकुलर शरीर। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
अध्ययन यहां अल्ट्रास्ट्रक्चरल रिज़ॉल्यूशन के साथ सेलुलर वातावरण के भीतर प्रोटीन अणुओं के एकल-अणु विज़ुअलाइज़ेशन के लिए एक मजबूत क्लोनेबल ईएम लेबलिंग तकनीक प्रस्तुत करता है। आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड सिस्टीन-समृद्ध टैग पर सीधे संश्लेषित एयूएनपी लक्ष्य प्रोटीन का स्पष्ट और सटीक स्थानीयकरण प्रदान करते हैं। उच्च दबाव ठंड और फ्रीज-प्रतिस्थापन तकनीक उत्कृष्ट रूप से जैविक नमूनों की अल्ट्रास्ट्रक्चर को संरक्षित करती है। एक साथ लिया गया, यहां प्रस्तुत क्लोनेबल इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी लेबलिंग तकनीक ईएम के साथ सीटू में सेलुलर अल्ट्रास्ट्रक्चरल संदर्भों में एक अणु के कुशल स्थानीयकरण और मान्यता के लिए एक शक्तिशाली उपकरण प्रदान करती है।
एएनएसएम तंत्र थियोलेट-एयू (आई) पॉलिमर26 की ऑटोन्यूक्लियेशन प्रक्रिया को दबा देता है, जो क्लासिक ब्रस्ट-शिफरिन विधि (बीएसएम) 27 में एक विशिष्ट प्रतिक्रिया है जिसका व्यापक रूप से थियोलेट-कैप्ड गोल्ड नैनोक्लस्टर्स को संश्लेषित करने के लिए उपयोग किया जाता है। इसलिए, एएनएसएम-आधारित एयूएनपी संश्लेषण तकनीक विशेष रूप से उच्च सिग्नल-टू-शोर अनुपात और उच्च दक्षता के साथ ईएम विज़ुअलाइज़ेशन के लिए इलेक्ट्रॉन-घने लेबल के रूप में सीधे सिस्टीन-समृद्ध टैग पर 2-6 एनएम-आकार के एयूएनपी को संश्लेषित कर सकती है। एपेक्स 2 या एचपीआर लेबलिंग तकनीकों के विपरीत जो डीएबी बहुलक जमाव पर निर्भर करते हैं, जो बेशुमार है और साइटोसोल में घुलनशील प्रोटीन के लिए उपयुक्त नहीं है, एएनएसएम-आधारित एयूएनपी संश्लेषण तकनीक एकमात्र तकनीक है जो अब तक एकल-अणु का पता लगाने में सक्षम बनाती है।
क्लोनेबल इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी लेबलिंग तकनीक का दोष यह है कि एएनएसएम-आधारित एयूएनपी संश्लेषण तकनीक सिस्टीन के थिओल समूह की गतिविधि पर निर्भर करती है, जो एल्डिहाइड फिक्सेटिव के प्रति संवेदनशील है। ई कोलाई और विखंडन खमीर एस पोम्बे में एल्डिहाइड निर्धारण से पहले 3,3'-डिथियोडिप्रोपियोनिक एसिड (डीटीडीपीए) द्वारा थिओल की ऑक्सीडेटिव सुरक्षा शुरू की गई है, जिसके परिणामस्वरूप अच्छी आकृति विज्ञान और उत्कृष्ट लेबलिंग दक्षता 24,25,26 है। इस काम में, ऑक्सीकरण / निर्धारण विधि ने अपेक्षाकृत ऑक्सीडेटिव डिब्बे में व्यक्त उन टैग के लिए ठीक से काम किया, जैसे ईआर लुमेन और माइटोकॉन्ड्रिया मैट्रिक्स (ईजीएफपी-एमटीएन-केडीईएल और मिटो-एसीजीएफपी-एमटीएन कोशिकाओं में)। हालांकि, यह स्तनधारी कोशिकाओं में साइटोसोलिक टैग (ओएसटी 4-जीएफपी-एमटीएन) के लिए उप-मानक था। कारण यह हो सकता है कि कम करने वाले डिब्बों में टैग अच्छी तरह से मुड़े हुए नहीं हैं, और जीएसएच जैसे कम करने वाले पदार्थ जो साइटोप्लाज्म में बहुतायत में मौजूद हैं, ऑक्सीकरण का विरोध कर सकते हैं।
एचपीएफ-एफएसएफ तकनीक इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के लिए जैविक नमूनों के अल्ट्रास्ट्रक्चरल संरक्षण में स्वर्ण मानक है। इस काम में, एचपीएफ / एफएसएफ-पुनर्जलीकरण-एचपीएफ / एफएसएफ की विधि, जो पारंपरिक रासायनिक निर्धारण और परमेबिलाइजेशन से पूरी तरह से बचती है, ने ओएसटी 4-जीएफपी-एमटीएन के साथ कुशल लेबलिंग हासिल की और उत्कृष्ट सेल संरचना प्राप्त की। हालांकि, इस विधि में अभी भी कुछ सीमाएं हैं। सबसे पहले, एक दूसरे एचपीएफ से महत्वपूर्ण बर्फ क्रिस्टल क्षति हो सकती है। दूसरा, यूरिनल एसीटेट के विभिन्न बैचों में असंगत गुणवत्ता और घुलनशीलता की समस्याएं हैं। इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी द्वारा कल्पना किए जाने पर एसीकुलर अवक्षेप कभी-कभी पुनर्जलीकृत नमूनों में दिखाई देते हैं। पीएच 5.5 पर एचईपीईएस बफर के साथ धोने से यह समस्या कम हो सकती है। तीसरा, ऊतक के नमूनों के लिए नमूना तैयारी को और अनुकूलन की आवश्यकता है।
निष्कर्ष में, क्लोनेबल ईएम लेबलिंग तकनीक, एएनएसएम-आधारित एयूएनपी संश्लेषण तकनीक को एचपीएफ / एफएसएफ-पुनर्जलीकरण-एचपीएफ / एफएसएफ की नमूना तैयारी विधि के साथ जोड़ती है, इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी द्वारा कोशिकाओं में आनुवंशिक रूप से टैग किए गए प्रोटीन की स्पष्ट एकल-अणु पहचान को सक्षम बनाती है। वर्तमान प्रोटोकॉल को जैविक प्रश्नों की एक विशाल श्रृंखला को संबोधित करने की अनुमति देनी चाहिए।
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
लेखक ने हितों के टकराव की घोषणा नहीं की है।
Acknowledgments
यहां वर्णित प्रोटोकॉल जियांग एट अल (2020) द्वारा प्रकाशित लेख से लिया गया था। इस काम को MOST (973 कार्यक्रम संख्या 2011CB812502 और 2014CB849902) से अनुदान और बीजिंग नगरपालिका सरकार से वित्त पोषण सहायता द्वारा समर्थित किया गया था।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.025 mm/0.275 mm Aluminum carrier | Beijing Wulundes Biotech Ltd., or Engineering Office of M. Wohlwend | ||
| 0.2 M HEPES buffer | Dissolve HEPES (0.2 M) in 980 mL of ddH2O, then add 10 mL of 100 mM MgCl2 and 10 mL of 100 mM CaCl2 (final concentration 1 mM), respectively, adjust pH to 5.5 | ||
| 1.5 mL MaxyClear snaplock microtube | Axygen Scientific | MCT150C | |
| 2 mL polypropylene screw cap microtubes | Biologix | 81-0204 | |
| 200 mesh hexagonal copper grid | Tedpella inc | G200HEX | |
| 2-mercaptoethanol | Amresco | 0482-250ML | |
| 35 mm cell culture dishes | Corning | 430165 | |
| 50 mL polypropylene centrifuge tubes | Corning | 430928 | |
| Acetone | Beiijng Tong Guang Fine Chemicals Company | 31025 | |
| Automated freeze substitution machine | Leica | AFS2 | |
| Customized 3.05 mm x 0.66 mm specimen holders for HPF | Beijing Wulundes Biotech Ltd. | ||
| D-penicillamine | TCI | P0147 | |
| Dulbecco’s modified Eagle medium | GBICO | C11965500BT | |
| Fetal bovine serum | GBICO | 10099-141C | |
| Flat bottom embedding capsule | Tedpella inc | ||
| Foam cryobox | |||
| Formvar 15/95 resin | Electron Microscopy Sciences | 15800 | |
| HAuCl4 | Sigma | 4022-1G | |
| HEPES | sigma | H3375-500G | |
| HPF machine | Wohlwend | HPF compact01 | |
| Methonal | Beiijng Tong Guang Fine Chemicals Company | 12397 | |
| NaBH4 | Sigma | 480886-25G | |
| OsO4 | Electron Microscopy Sciences | 19110 | |
| PBS-A buffer | Dissolve NaH2PO4 (1.125 mM), Na2HPO4 (3.867 mM), NaCl (100 mM) in 1 L of ddH2O, adjust to pH 7.4 | ||
| Qualitative filter paper (medium speed) | Beyotime Biotechnology | FFT08 | |
| Sapphire discs | Beijing Wulundes Biotech Ltd., or Engineering Office of M. Wohlwend | ||
| Solvent resistant pen | Electron Microscopy Sciences | 62053-B | |
| SPI-Pon 812 resin | SPI Inc | 02659-AB | |
| Transmission electron microscopy | FEI | Tecnai G2 spirit | |
| Trypsin-EDTA | GBICO | C25200-056 | |
| Tweezers | Dumont | ||
| Ultramictotome | Leica | FC7 | |
| Uranyl acetate | Electron Microscopy Sciences | 22400 |
References
- Tsien, R. Y.
- Shaner, N. C., Patterson, G. H., Davidson, M. W.
- Masters, B. R. History of the electron microscope in cell biology. Encylopedia of Life Sciences. , (2009).
- Griffiths, G., Hoppeler, H. Quantitation in immunocytochemistry: Correlation of immunogold labeling to absolute number of membrane antigens. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 34 (11), 1389-1398 (1986).
- Tokuyasu, K. T. A technique for ultracryotomy of cell suspensions and tissues. Journal of Cell Biology. 57 (2), 551-565 (1973).
- Connolly, C. N., Futter, C. E., Gibson, A., Hopkins, C. R., Cutler, D. F. Transport into and out of the Golgi complex studied by transfecting cells with cDNAs encoding horseradish peroxidase. Journal of Cell Biology. 127 (3), 641-652 (1994).
- Grabenbauer, M., et al. Correlative microscopy and electron tomography of GFP through photooxidation. Nature Methods. 2 (11), 857-862 (2005).
- Gaietta, G., et al. Multicolor and electron microscopic imaging of connexin trafficking. Science. 296 (5567), 503-507 (2002).
- Shu, X., et al. A genetically encoded tag for correlated light and electron microscopy of intact cells, tissues, and organisms. PLoS Biology. 9 (4), e1001041 (2011).
- Martell, J. D., et al. Engineered ascorbate peroxidase as a genetically encoded reporter for electron microscopy. Nature Biotechnology. 30 (11), 1143-1148 (2012).
- Lam, S. S., et al. Directed evolution of APEX2 for electron microscopy and proximity labeling. Nature Methods. 12 (1), 51-54 (2015).
- Mavlyutov, T. A., et al. APEX2-enhanced electron microscopy distinguishes sigma-1 receptor localization in the nucleoplasmic reticulum. Oncotarget. 8 (31), 51317-51330 (2017).
- Wang, Q., Mercogliano, C. P., Lowe, J. A ferritin-based label for cellular electron cryotomography. Structure. 19 (2), 147-154 (2011).
- Sano, T., Glazer, A. N., Cantor, C. R. A streptavidin-metallothionein chimera that allows specific labeling of biological materials with many different heavy metal ions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 89 (5), 1534-1538 (1992).
- Mercogliano, C. P., DeRosier, D. J. Gold nanocluster formation using metallothionein: Mass spectrometry and electron microscopy. Journal of Molecular Biology. 355 (2), 211-223 (2006).
- Mercogliano, C. P., DeRosier, D. J. Concatenated metallothionein as a clonable gold label for electron microscopy. Journal of Structural Biology. 160 (1), 70-82 (2007).
- Morphew, M. K., et al. Metallothionein as a clonable tag for protein localization by electron microscopy of cells. Journal of Microscopy. 260 (1), 20-29 (2015).
- Nishino, Y., Yasunaga, T., Miyazawa, A. A genetically encoded metallothionein tag enabling efficient protein detection by electron microscopy. Journal of Electron Microscopy. 56 (3), 93-101 (2007).
- Bouchet-Marquis, C., Pagratis, M., Kirmse, R., Hoenger, A. Metallothionein as a clonable high-density marker for cryo-electron microscopy. Journal of Structural Biology. 177 (1), 119-127 (2012).
- Fukunaga, Y., et al. Electron microscopic analysis of a fusion protein of postsynaptic density-95 and metallothionein in cultured hippocampal neurons. Journal of Electron Microscopy. 56 (4), 119-129 (2007).
- Diestra, E., Fontana, J., Guichard, P., Marco, S., Risco, C. Visualization of proteins in intact cells with a clonable tag for electron microscopy. Journal of Structural Biology. 165 (3), 157-168 (2009).
- Risco, C., et al. sensitive, high-resolution detection of protein molecules in eukaryotic cells using metal-tagging transmission electron microscopy. Structure. 20 (5), 759-766 (2012).
- Ding, S. -W., et al. Noncanonical role for the host Vps4 AAA+ ATPase ESCRT protein in the formation of tomato bushy stunt virus replicase. PLoS Pathogens. 10 (4), e1004087 (2014).
- Jiang, Z., et al. Direct synthesis of gold nanoparticles on cysteine-rich tags in yeast cells. Protocol Exchange. , (2020).
- Jiang, Z., et al. Direct synthesis of gold nanoparticles on cysteine-rich tags in mammalian cells. Protocol Exchange. , (2020).
- Jiang, Z., et al. Genetically encoded tags for direct synthesis of EM-visible gold nanoparticles in cells. Nature Methods. 17 (9), 937-946 (2020).
- Brust, M., Walker, M., Bethell, D., Schiffrin, D. J., Whyman, R. Synthesis of thiol-derivatised gold nanoparticles in a two-phase liquid-liquid system. Journal of the Chemical Society, Chemical Communications. 7, 801-802 (1994).
