Summary
본 프로토콜은 새로운 자가핵형성 억제 메커니즘 기반 금 나노입자 합성 기술을 사용하여 세포에서 메탈로티오네인 태그가 부착된 단백질을 검출하기 위한 클로너블 전자 현미경 표지 기술을 설명합니다.
Abstract
미세 구조적 분해능으로 세포에서 단백질 분자의 정확한 국소화를 분석하는 것은 모든 살아있는 유기체의 다양한 생리학적 또는 병리학적 과정을 연구하는 데 매우 중요합니다. 따라서 전자 현미경 프로브로 사용할 수 있는 복제 가능한 태그의 개발은 형광 단백질이 광학 이미징 분야에서 중요한 역할을 한 것처럼 큰 가치가 있습니다. 자가핵형성 억제 메커니즘(ANSM)이 최근 밝혀졌으며, 이는 메탈로티오네인(MT) 및 부동액 단백질(AFP)과 같은 시스테인이 풍부한 태그에서 금 나노입자(AuNP)의 특이적 합성을 가능하게 합니다.
ANSM을 기반으로 전자 현미경 표지 기술이 개발되어 전례 없는 표지 효율로 원핵 및 진핵 세포에서 태그가 부착된 단백질을 특이적으로 검출할 수 있습니다. 이 연구는 미세 구조가 잘 보존된 포유류 세포에서 MTn(알데히드 반응성 잔기가 없는 조작된 MT 변이체) 융합 단백질을 검출하기 위한 프로토콜을 보여줍니다. 이 프로토콜에서, 고압 동결 및 동결 치환 고정은 비-알데히드 고정제(예: 탄닌산, 우라닐 아세테이트)를 사용하여 수행되었으며, 이는 거의 천연 미세 구조를 보존하고 알데히드 가교결합으로 인한 태그 활성의 손상을 방지하였다.
ANSM계 AuNP 합성 전에 간단한 1단계 재수화를 사용하였다. 그 결과 태그된 단백질이 소포체(ER)의 막과 내강을 포함한 다양한 세포 소기관을 표적으로 삼고 미토콘드리아 매트릭스가 높은 효율과 특이성으로 검출되는 것으로 나타났습니다. 이 연구는 생물학자들에게 세포 미세 구조적 맥락에서 단일 분자 수준에서 방대한 범위의 생물학적 문제를 해결할 수 있는 강력한 프로토콜을 제공합니다.
Introduction
포스트 게놈 시대에 광학 현미경을 위한 단일 분자 리포터로서 녹색 형광 단백질(GFP)의 개발은 현대 생명 과학 연구 분야에 혁명을 일으켰습니다 1,2. 수십 년 동안 전자 현미경(EM)은 나노 해상도3으로 세포 미세 구조를 직관적으로 관찰할 수 있는 강력한 도구였습니다. 그러나 단백질 분자의 정확한 식별과 국소화는 여전히 어려운 과제입니다.
가장 일반적으로 사용되는 EM 표지 기술은 항원-항체 반응을 기반으로 하는 면역전자 현미경(IEM) 표지 기술입니다. 그러나 IEM 사전 임베딩 및 IEM 사후 임베딩(수지 절편 또는 수화 극저온 절편)을 포함하여 IEM 라벨링 분야에서 많은 기술이 개발되었지만 여전히 낮은 라벨링 효율(<10%)4,5, 이는 샘플 준비 및 항체 품질과 관련이 있습니다. 이러한 한계를 극복하기 위해 유전적으로 암호화된 태그를 개발하는 것은 큰 응용 가능성을 가지고 있습니다.
최근 몇 년 동안 두 가지 주요 유형의 EM 태그가 철저히 조사되었습니다. 한 가지 유형은 EM 시각화6,7,8,9,10,11,12를 위해 APEX2와 같은 태그를 사용하여 3,3'-디아미노벤지딘(DAB)을 삼온성 폴리머로 산화시키는 DAB 염색 방법입니다. 세포 내 영역에서 고농도 단백질의 표지를 가능하게 하지만 단일 분자 계수에는 적합하지 않습니다. 다른 유형은 페리틴 13 및 메탈로티오네인(MT)14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26과 같은 금속 결합 단백질을 사용하여 전자 밀도가 높은 금속 침전물을 생성합니다 . EM 시각화를 위한 현장. 후자만이 단일 분자 시각화 및 계수에 대한 실질적인 잠재력을 가지고 있습니다. 페리틴의 분자 크기가 너무 커서 유망한 태그로 사용할 수 없는 반면, MT의 작은 크기(~5kD)와 20개의 시스테인을 통해 다양한 이온을 결합하는 능력은 큰 관심을 끌었습니다. 여러 실험실에서 Au+로 직접 배양하여 정제된 MT 융합 단백질 또는 MT 발현 세포에 라벨을 붙이려고 시도했습니다. 이러한 시도는 초기에 MT 태그가 금 이온과 결합하여 고대비 신호를 형성할 수 있다는 것을 증명했지만, 실제로 세포에서 개별 단백질의 효과적인 식별을 달성한 것은 없으며 널리 적용되지 않습니다 14,15,16,17,18,19,20,21,22,23.
EM 시각화를 위한 전자 밀도 라벨로 시스테인이 풍부한 태그(예: MT, MT 변이체 MTn 및 MTα, AFP)에서 직접 2-6nm 크기의 AuNP를 합성하는 ANSM 기반 AuNP 합성 기술은 세포에서 단백질 라벨링 및 단일 분자 검출을 위한 최초의 신뢰할 수 있고 적용 가능한 접근 방식입니다24,25,26. 분리된 태그 융합 단백질에서 AuNP의 특이적 합성을 가능하게 하고 비고정 또는 화학적으로 고정된 원핵생물(E. coli) 및 진핵생물(S. pombe) 세포에서 전례 없는 표지 효율을 달성했습니다. 그러나 포유류 세포 또는 조직과 같은 고급 시스템에서 동일한 프로토콜을 구현하려면 더 복잡한 세포 내 산화 환원 항상성 및 더 취약한 세포 구조와 같은 추가적인 문제가 필요합니다.
이 연구는 유전적으로 암호화된 시스테인이 풍부한 태그(MT)를 라벨링하기 위한 새로운 ANSM 기반 AuNP 합성 기술과 HPF/FSF-재수화-HPF/FSF 샘플 준비 방법을 결합한 클로닝 가능한 EM 라벨링 기술을 제시하여 HeLa 세포의 ER 막, ER 내강 및 미토콘드리아 매트릭스에서 태그가 지정된 단백질의 명확한 단일 분자 식별을 가능하게 합니다. 현재의 방법은 높은 표지 효율, 높은 신호 대 잡음비, 단일 분자 표지 및 강력한 보편성의 특성을 결합하고 있으며, 이 방법은 생명 과학 연구에서 광범위한 응용 전망을 가지고 있습니다.
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Protocol
이 실험에 사용된 모든 소모품은 재료 표에 나열되어 있습니다. 현재 프로토콜의 단계별 워크플로는 그림 1에 나와 있습니다.
1. 사파이어 디스크에서의 세포 배양
- 3mm x 0.16mm 사파이어 디스크를 에탄올 1mL가 들어있는 2mL 원심 분리기 튜브로 옮기고 초음파 세척기에서 10 분 동안 초음파 처리합니다.
- 표면에 눈에 띄는 침전물이 없을 때까지 각 사파이어 디스크를 알코올 램프 불꽃에 태우십시오.
알림: 위의 방법을 통해 사파이어 디스크를 여러 번 재활용할 수 있습니다. - 내용제성 펜을 사용하여 각 사파이어 디스크의 한 면에 숫자를 표시합니다(그림 1A).
알림: 사용된 마커 펜은 마크 손실을 방지하기 위해 사전에 아세톤 및 메탄올 용매에 내성이 있는지 여부를 테스트해야 합니다. - 라벨이 붙은 면이 위를 향하도록 하여 라벨이 붙은 사파이어 디스크를 35mm 배양 접시의 바닥에 놓습니다.
- 세포 배양 접시를 자외선 하에서 사파이어 디스크로 30분 동안 소독합니다.
- 핀셋으로 사파이어 디스크를 뒤집고(라벨이 붙은 면이 아래를 향함) 자외선 아래에서 추가로 30분 동안 살균합니다. 이제 사파이어 디스크가 들어 있는 배양 접시가 세포 배양을 위한 준비가 되었습니다.
알림: 사파이어 디스크는 오토클레이빙으로도 멸균할 수 있습니다. - 세포를 위에서 제조된 사파이어 디스크 상에 시딩하고, 37°C, 95% 습도 및 5%CO2 에서 세포 인큐베이터에서 80%-90% 컨플루언시로 성장시킨다(도 1B).
참고: MTn 태그를 발현하는 안정한 HeLa 세포주는 Jiang et al.26에 기재된 바와 같이 생성되었다.
2. 고압 냉동(HPF)
주의: 이 실험에는 액체 질소가 사용됩니다. 액체 질소로 작업 할 때는 동상 및 질식을 방지하기 위해 적절한 안전 절차와 개인 보호 장비를 사용하십시오.
- 제조업체의 지침에 따라 실험 최소 2시간 전에 고압 냉동 기계를 준비하십시오.
- A형 HPF 알루미늄 담체(홈: 0.025/0.275mm)를 에탄올 1mL가 들어 있는 2mL 원심분리기 튜브에 옮기고 초음파 세척기에서 10분 동안 초음파 처리합니다.
- 질적 여과지로 덮인 페트리 접시에서 캐리어를 건조시킵니다 (중간 속도).
- 사전 세척된 캐리어를 1-헥사데센에 담그십시오.
참고: BSA는 후속 금 나노입자 합성을 방해할 수 있으므로 현재 실험에서 동결 방지제로 권장되지 않습니다. - 미세 핀셋을 사용하여 배양 접시에서 세포가 있는 사파이어 디스크를 집어 올리십시오. 정성적 여과지(중간 속도)로 라벨이 붙은 표면을 터치하여 초과 매체를 제거합니다.
알림: 물의 열전도율은 매우 낮고 잔여 물이 너무 많으면 동결 효과에 영향을 미칩니다. 세포가 마르지 않도록 최소한의 물을 유지하십시오. - 사파이어 디스크를 HPF 시편 홀더에 장착하고 1-헥사데센이 포함된 0.025mm 깊이의 알루미늄 캐리어로 디스크를 빠르게 덮습니다(그림 1C).
- 정성적 여과지(중간 속도)로 과잉 용액을 흡인합니다.
- 고압 동결을 위해 시편 홀더를 로드합니다(그림 1D).
참고: 시편 로딩 과정은 온도, 습도, pH 및 산소 함량의 변화로 인한 생리학적 변화를 최소화하기 위해 가능한 한 빠르게(1분 이내) 진행되어야 합니다. - 액체 질소 하의 사파이어 디스크 캐리어 어셈블리를 폼 크라이오박스에 넣고 사용하기 전에 액체 질소의 극저온에 어셈블리를 보관하십시오.
참고: 여기서 프로토콜이 일시 중지될 수 있습니다. 극저온 생물의 표본은 액체 질소 듀어에 수년간 보관할 수 있습니다.
3. 동결 치환 고정(FSF) 및 재수화(그림 1E)
- 자동 동결 대체 기계(AFS)에 액체 질소를 채우고 챔버를 -90°C로 냉각합니다.
주의: 이 실험에는 액체 질소가 사용됩니다. 액체 질소로 작업 할 때는 동상 및 질식을 방지하기 위해 적절한 안전 절차와 개인 보호 장비를 사용하십시오. - 흄 후드의 20mm 원형 폴리프로필렌 용기(그림 1E)에 아세톤(FSF 용액 1)에 2mL의 0.01% 탄닌산(w/v)을 준비하고 액체 질소로 동결합니다.
- 한 쌍의 사전 냉각 핀셋을 사용하여 LN2에서 동결된 FSF 용액 1과 함께 시편(사파이어 디스크 캐리어 어셈블리)을 용기에 넣습니다.
- -90°C에서 FSF 처리를 위해 용기를 예냉된 AFS 챔버로 옮깁니다.
- 시편을 -90°C에서 1시간 동안 유지합니다. 그런 다음 미리 냉각된 핀셋을 사용하여 캐리어에서 사파이어 디스크를 분리하고 사파이어 디스크의 표시된 면이 아래를 향하도록 합니다.
알림: 핀셋은 온도 변화를 방지하기 위해 충분히 미리 냉각되어야 합니다. 사파이어 디스크는 쉽게 분리되어야 합니다. - -90 ° C에서 8-10 시간 더 유지하십시오. 그런 다음 3시간 이내에 -60°C로 예열합니다.
- 용기의 FSF 용액 1을 예냉된 아세톤으로 교체하고 1시간 동안 배양합니다. 이 아세톤 세척을 2회 반복합니다.
- 3시간 이내에 -30°C로 예열합니다. 이 기간 동안 2mL 원심분리기 튜브에서 아세톤 중 0.01% 우라닐 아세테이트 2mL(메탄올 중 10% 우라닐 아세테이트에서 희석된 FSF 용액 2)를 준비하고 예냉각합니다.
주의 : 현재 실험에 사용 된 우라닐 아세테이트는 방사성이며 독성이 강합니다. 적절한 안전 절차에 따라 처리해야 하며 유해 화학 폐기물로 처리해야 합니다. - 아세톤을 FSF 용액 2로 교체하고 -30°C에서 3시간 동안 인큐베이션합니다.
- 용기 내의 FSF 용액 2를 예냉된 아세톤으로 교체하고, -30°C에서 30분 동안 인큐베이션한다. 이 아세톤 세척을 2회 반복합니다.
- 2시간 이내에 -30°C에서 4°C까지 따뜻하게 합니다.
- 아세톤을 pH 5.5에서 1mM CaCl2 및 1mMMgCl2를 함유하는 0.2M HEPES 완충액 2mL로 교체합니다.
- 완충액을 한 번 교체하고 실온에서 1시간 동안 또는 4°C에서 밤새 배양합니다.
참고: 프로토콜은 여기에서 하룻밤 동안 일시 중지되거나 5단계에서 표본이 다시 동결될 때까지 최소 6시간 동안 계속될 수 있습니다.
4. 포유류 세포에 대한 ANSM 기반 AuNP 합성 (그림 1F)
- PBS-A 버퍼로 매번 5분 동안 3회 세척합니다.
- 실온에서 1mL의 PBS-A 완충액이 들어 있는 35mm 배양 접시에 사파이어 디스크를 옮깁니다.
알림: 항상 사파이어 디스크의 표시된 면이 아래를 향하도록 하고 사파이어 디스크가 겹치거나 셀을 문지르지 않도록 하십시오. - 4.28μL의 2-메르캅토에탄올을 1mL의 PBS-A 완충액이 들어 있는 2mL 원심분리기 튜브에 넣고 흄 후드에서 잘 혼합하여 환원 용액을 준비합니다.
주의 : 2- 메르 캅토 에탄올은 독성이 있으며 매운 냄새가납니다. 적절한 안전 절차에 따라 취급해야 합니다. - 배양 접시의 PBS-A 완충액을 환원액 1mL로 교체하고 실온에서 1시간 동안 배양합니다.
- 사용하기 전에 금 전구체를 준비하십시오.
- ddH2O중의 10 mM HAuCl4 80 μL를 1 mL의 환원 용액이 들어 있는 2 mL 원심분리 튜브에 넣고, 즉시 와동시킨다.
알림: 용액이 흐려질 수 있습니다. - ddH2O에 500mM D-페니실라민 80μL를 위 용액에 넣고 즉시 소용돌이칩니다.
알림: 솔루션이 다시 명확해질 수 있습니다.
- ddH2O중의 10 mM HAuCl4 80 μL를 1 mL의 환원 용액이 들어 있는 2 mL 원심분리 튜브에 넣고, 즉시 와동시킨다.
- 배양 접시의 용액을 단계 4.5에서 제조된 금 전구체 용액 1 mL로 교체하고, 4°C에서 2시간 동안 배양한다.
참고: 1밀리리터의 금 전구체는 약 1 × 106 세포(35mm 접시에서 합류)와 반응하기에 충분합니다. AuNP가 현저히 작아지면 더 많은 양의 전구체가 필요합니다. - 0.0038 g의 NaBH4를 1.5 mL 원심분리기 튜브에 넣고, 1 mL의 얼음처럼 차가운ddH2O를 첨가하고, 사용 직전에 신선한 100 mMNaBH4를 만들기 위해 와동시킨다.
- 4.6 단계의 용액에 20-100 μL의 100 mMNaBH4 를 첨가하고, 즉시 잘 섞이도록 흔들어 준 후, 실온에서 5분 동안 배양한다.
알림: 즉시 사용할 수 있도록 100mM NaBH4 를 새로 준비하십시오. NaBH4를 첨가하면 용액의 색이 점차 붉어졌다가 짙어집니다. 색상 변화가 관찰되지 않으면 대체로 실험이 실패했음을 나타냅니다. - 용액을 2mL의 PBS-A 완충액으로 교체하여 반응을 중지합니다.
알림: 장기간 반응하면 AuNP가 점차 분해되므로 30분 이내에 반응을 중지하는 것이 중요합니다.
5. 고압 동결 및 동결 치환 고정(그림 1C-F)
참고: 표본은 다시 HPF와 FSF이며 절차는 이전에 섹션 2 및 섹션 3에서 설명한 것과 거의 동일하지만 약간의 수정이 있습니다.
- 아세톤에 1 % 사산화 오스뮴과 0.1 % 우라닐 아세테이트를 준비합니다 (FSF 용액 3, 아세톤의 4 % 사산화 오스뮴 및 메탄올의 10 % 우라닐 아세테이트에서 희석).
주의 : 사산화 오스뮴과 우라닐 아세테이트는 독성이 강한 화학 물질입니다. 적절한 안전 절차에 따라 처리해야 하며 유해 화학 폐기물로 처리해야 합니다. - 한 쌍의 사전 냉각 핀셋을 사용하여 LN2 하에서 동결된 FSF 용액 3과 함께 시편(사파이어 디스크 캐리어 어셈블리)을 용기에 넣습니다.
- -90 °C에서 FSF 처리를 위해 컨테이너를 사전 냉각 AFS 챔버로 옮기고 다음과 같이 FSF 프로그램을 실행하십시오 : -90 °C에서 8-10 시간 동안 유지하십시오. 그런 다음 3시간 이내에 -60°C로 예열합니다. -60 ° C에서 3 시간 동안 유지하십시오. 그런 다음 3시간 이내에 -30°C로 예열합니다. -30 °C에서 3시간 동안 유지하십시오. 그런 다음 2시간 이내에 4°C로 예열합니다.
- 온도가 4°C에 도달하면 시편을 흄 후드로 옮기고 실온에서 15분 동안 유지합니다.
- 매번 아세톤으로 3 분 동안 15 번 씻으십시오.
- 실온에서 아세톤에서 최소 2시간 동안 유지하십시오.
6. 수지 침투, 임베딩 및 중합
- 사용하기 전에 제조업체의 지침에 따라 에폭시 수지 혼합물을 준비하십시오.
주의 : 현재 실험에 사용 된 에폭시 수지는 중합 전에 독성이 있습니다. 적절한 안전 절차에 따라 취급해야 합니다. 중합되지 않은 수지는 폐기 전에 유해 화학 폐기물로 처리하거나 중합해야 합니다. - 사파이어 디스크를 평평한 바닥 임베딩 캡슐로 옮기고 실온에서 최소 30분 동안 수지에 침투시킵니다.
알림: 사파이어 디스크의 표시된 면이 아래를 향하도록 합니다. - 시편을 60°C의 오븐에서 최소 18시간 동안 중합합니다.
참고: 프로토콜은 중합 후 여기에서 일시 중지할 수 있습니다. 중합된 시편 블록은 건조 용기에 수년간 보관할 수 있습니다.
7. 초박형 절편
- 면도기를 사용하여 중합된 시편 블록을 조심스럽게 다듬어 사파이어 디스크를 노출시킵니다.
- 사파이어 디스크로 블록 팁을 액체 질소에 몇 초 동안 담그고 실온에서 해동합니다. 동결-해동 작업을 여러 번 반복하여 블록에서 디스크를 분리합니다.
알림: 시편 블록에 균열이 생길 수 있으므로 장기간 동결을 피하십시오. 샘플을 손상시킬 수 있는 과도한 힘을 피하면서 블레이드로 사파이어 디스크를 부드럽게 분리합니다. - 초박형 절편을 위해 블록 면을 사다리꼴 모양으로 자릅니다(그림 1G).
- 울트라마이크로톰으로 70-100nm 초박형 섹션을 얻습니다(그림 1H).
- 200메쉬 육각형 구리 그리드에서 섹션을 선택합니다.
참고: 프로토콜은 단면화 후 여기에서 일시 중지할 수 있습니다. 거드의 섹션은 수년간 건조한 용기에 보관할 수 있습니다. 원하는 경우 그리드의 섹션을 2% 우라닐 아세톤으로 염색하여 더 나은 막 대비를 얻을 수 있습니다. 납 염색은 나노골드 입자 신호를 가리기 때문에 피해야 합니다.
8. TEM 이미징(그림 1I)
- 투과 전자 현미경을 사용하여 구리 그리드의 초박형 부분을 검사합니다. 일반적으로 11kX에서 30kX까지의 배율 범위는 세포에서 AuNP를 시각화하는 데 적합하며 2-3nm AuNP를 보려면 적절한 디포커스 값이 필요합니다.
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Representative Results
ANSM 기반 AuNP 합성 기술은 TEM26으로 MT 태그가 부착된 단백질을 표지하고 검출하는 데 매우 유용한 도구입니다. 포유류 세포에서 그 견고성을 검증하기 위해 Hela 세포에서 EGFP-MTn-KDEL, Ost4-EGFP-MTn 또는 Mito-acGFP-MTn을 발현하는 3개의 안정적인 세포주를 생성했습니다. KDEL은 표준 C-말단 소포체(ER) 유지/회수 서열로, 융합 단백질 EGFP-MTn-KDEL을 ER 내강 또는 핵외피(NE)의 핵주위 공간 내에 유지합니다. Ost4는 올리고사카릴트랜스퍼라제 복합체의 서브유닛으로, 초기 폴리펩타이드의 N-글리코실화를 촉매하는 ER 및 NE에 국한된 막 단백질 복합체입니다. Ost4 융합 단백질 Ost4-EGFP-MTn의 C 말단은 세포질과 마주보고 있습니다. 미토는 미토콘드리아 기질에서 융합 단백질 Mito-acGFP-MTn을 표적으로 하는 미토콘드리아 표적화 서열이다.
알데히드 고정제 대신 탄닌산과 우라닐 아세테이트를 사용한 HPF/FSF 시료 전처리는 우수한 멤브레인 대비와 함께 우수한 미세 구조를 보존했습니다(그림 2, 그림 3 및 그림 4). 샘플의 전체 구조는 명백한 세포질 및 지질 추출 없이 밀도가 높았습니다. 막 구조는 뚜렷한 변형 없이 매끄럽고 인지질 이중층 구조가 명확하게 드러났습니다.
잘 보존된 미세 구조 외에도 뚜렷한 세포 소기관 특이성을 나타내는 세 가지 경우 모두에서 효율적인 라벨링이 관찰되었습니다. EGFP-MTn-KDEL 단백질은 말초 ER 루멘과 NE의 핵주위 공간에 독점적으로 분포된 2-5nm 크기의 금 나노입자로 나타났습니다(그림 2A-C). 잘 보존된 미세 구조는 태그가 부착된 단백질의 단일 분자 식별을 가능하게 했을 뿐만 아니라 ER-미토콘드리아 상호 작용과 같은 세포 기관 상호 작용의 분석을 용이하게 했습니다(그림 2D, E). Ost4-EGFP-MTn 단백질의 나노 입자는 ER 막 (그림 3A-D)과 NE의 외막 (그림 3E)을 묘사했습니다. 나노 입자는 NE의 내막에도 분포되어 있었지만, 나노 입자의 수는 외막보다 적어 내막과 외막의 단백질 조성이 다르다는 것을 나타냅니다 (그림 3E). 마찬가지로, Mito-acGFP-MTn 발현 세포는 미토콘드리아 기질에서 특이적 표지를 나타냈다(도 4A-E). 소포 또는 ER에서 입자가 관찰되지 않았으며(그림 4A-D), MVB에서 입자가 거의 나타나지 않았습니다(그림 4D).
그림 1: 복제 가능한 전자 현미경 라벨링 기술의 작업 흐름에 대한 계획 . (A) 사파이어 디스크는 세포 배양을 위해 라벨이 부착되고 멸균됩니다. (B) 세포는 35mm 배양 접시의 사파이어 디스크에서 성장합니다. (C) 셀이 있는 사파이어 디스크는 고압 동결을 위해 0.025mm 깊이의 알루미늄 캐리어로 캡을 씌우고 추가 공간은 1-헥사데센으로 채워집니다. (D) 세포는 HPF에 의해 냉동 고정됩니다. (E) 동결-치환 고정. (f) ANSM계 AuNP 합성의 모식도. (G) 세포가 있는 사파이어 디스크는 평평한 바닥 매립 캡슐에 내장되어 있습니다. 수지 블록은 초박형 절단을 위해 트리밍됩니다. (H) 트리밍된 수지 블록은 울트라마이크로톰으로 절단됩니다. (I) 초박형 섹션은 TEM으로 이미지화됩니다. 약어: ANSM = 자가핵형성 억제 메커니즘; AuNP = 금 나노입자; HPF = 고압 동결; FSF = 동결-치환 고정; TEM = 투과 전자 현미경. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: HeLa 세포에서 발현된 EGFP-MTn-KDEL에 대한 ANSM 기반 AuNP 합성. (A,D) EGFP-MTn-KDEL을 발현하는 HeLa 세포의 90nm 두께 부분의 EM 이미지는 소포체의 내강과 핵막의 핵주위 공간에 특이적으로 축적된 AuNP를 보여줍니다. 미토콘드리아, 리소좀, 핵 또는 세포질에서 관찰되는 입자는 거의 없습니다. (나,씨) (A)에서 각각 빨간색과 노란색 사각형 영역의 확대 이미지입니다. (E) (D)에 있는 녹색 직사각형 영역의 확대 이미지. 이 수치는 Jiang et al.26에서 수정되었습니다. 스케일 바 = (B, C, E) 200 nm; (A,D) 500 나노미터. 약어: ANSM = 자가핵형성 억제 메커니즘; AuNP = 금 나노입자; EGFP = 강화된 녹색 형광 단백질; ER = 소포체; NE = 핵 외피; M = 미토콘드리아; 리소=리소좀; N = 핵. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: HeLa 세포에서 발현된 Ost4-EGFP-MTn에 대한 ANSM 기반 AuNP 합성. (A-D) Ost4-EGFP-MTn을 발현하는 HeLa 세포의 90nm 두께 부분의 EM 이미지는 소포체의 막에 특이적으로 축적된 AuNP를 보여줍니다. (E) Ost4-EGFP-MTn을 발현하는 HeLa 세포의 90nm 두께 부분의 EM 이미지는 NE(핵 외피)의 막에 특이적으로 축적된 AuNP를 보여줍니다. 미토콘드리아, 리소좀, 핵 또는 세포질에서 관찰되는 입자는 거의 없습니다. (C) (A)에 있는 빨간색 직사각형 영역의 확대 이미지. 이 수치는 Jiang et al.26에서 수정되었습니다. 스케일 바 = (B-E) 200 nm; (A) 500 nm. 약어: ANSM = 자가핵형성 억제 메커니즘; AuNP = 금 나노입자; EGFP = 강화된 녹색 형광 단백질; ER = 소포체; NE = 핵 포위; M = 미토콘드리아; 리소=리소좀; N = 핵; EM = 전자 현미경. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: HeLa 세포에서 발현된 Mito-acGFP-MTn에 대한 ANSM 기반 AuNP 합성. (A,D,E) Mito-acGFP-MTn을 발현하는 HeLa 세포의 90nm 두께 부분의 EM 이미지는 미토콘드리아(M)의 매트릭스에 특이적으로 축적된 AuNP를 보여줍니다. 소포체, 핵, 소포체, 다소포체 또는 세포질에서 관찰되는 입자는 거의 없습니다. (나,씨) (A)에서 각각 빨간색과 노란색 사각형 영역의 확대 이미지입니다. 이 수치는 Jiang et al.26에서 수정되었습니다. 스케일 바 = (D,E) 200 nm; (B,C) 500 나노미터; (A) 1 μm. 약어: ANSM = 자가핵형성 억제 메커니즘; AuNP = 금 나노입자; EGFP = 강화된 녹색 형광 단백질; ER = 소포체; NE = 핵 외피; M = 미토콘드리아; 리소=리소좀; N = 핵; V= 소포; MVB = 다발성체. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
이 연구는 여기에서 미세 구조 분해능으로 세포 환경 내에서 단백질 분자의 단일 분자 시각화를 위한 강력한 복제 가능한 EM 라벨링 기술을 제시합니다. 유전적으로 암호화된 시스테인이 풍부한 태그에서 직접 합성된 AuNP는 표적 단백질의 명확하고 정확한 국소화를 제공합니다. 고압 동결 및 동결 대체 기술은 생물학적 시료의 미세 구조를 우수하게 보존합니다. 종합하면, 여기에 제시된 클로닝 가능한 전자 현미경 라벨링 기술은 EM을 사용한 세포 미세 구조 맥락에서 단일 분자의 효율적인 위치 파악 및 인식을 위한 강력한 도구를 제공합니다.
ANSM 메커니즘은 티올레이트-Au(I) 중합체26의 자가핵형성 과정을 억제하며, 이는 티올레이트 캡핑된 금 나노클러스터를 합성하는 데 널리 사용되는 고전적인 Brust-Schiffrin 방법(BSM)27 의 전형적인 반응입니다. 따라서 ANSM 기반 AuNP 합성 기술은 높은 신호 대 잡음비와 높은 효율로 EM 시각화를 위한 전자 밀도 라벨로 시스테인이 풍부한 태그에 직접 2-6nm 크기의 AuNP를 특이적으로 합성할 수 있습니다. 셀 수 없고 세포질의 가용성 단백질에 적합하지 않은 DAB 폴리머 증착에 의존하는 APEX2 또는 HPR 표지 기술과 달리 ANSM 기반 AuNP 합성 기술은 지금까지 단일 분자 검출을 가능하게 하는 유일한 기술입니다.
클로너블 전자 현미경 표지 기술의 단점은 ANSM 기반 AuNP 합성 기술이 알데히드 고정제에 민감한 시스테인의 티올 그룹의 활성에 의존한다는 것입니다. 3,3'-디티오디프로피온산(DTDPA)에 의한 티올의 산화적 보호는 대장균과 핵분열 효모 S. pombe에서 알데히드 고정 전에 도입되어 우수한 형태와 우수한 표지 효율을 제공합니다24,25,26. 이 연구에서 산화/고정 방법은 ER 루멘 및 미토콘드리아 매트릭스(EGFP-MTn-KDEL 및 Mito-acGFP-MTn 세포)와 같은 비교적 산화적인 구획에서 발현되는 태그에 대해 적절하게 작동했습니다. 그러나 포유류 세포에서 세포질 태그(Ost4-GFP-MTn)에 대해서는 차선책이었습니다. 그 이유는 환원 구획의 태그가 잘 접히지 않고 세포질에 풍부하게 존재하는 GSH와 같은 환원 물질이 산화에 저항 할 수 있기 때문일 수 있습니다.
HPF-FSF 기술은 전자 현미경 검사를 위한 생물학적 표본의 미세 구조 보존의 황금 표준입니다. 본 연구에서는 기존의 화학적 고정 및 투과화를 완전히 피한 HPF/FSF-재수화-HPF/FSF의 방법으로 Ost4-GFP-MTn으로 효율적인 표지를 달성하고 우수한 세포 구조를 산출했습니다. 그러나 이 방법에는 여전히 특정 제한 사항이 있습니다. 첫째, 두 번째 HPF는 심각한 얼음 결정 손상을 초래할 수 있습니다. 둘째, 우라닐 아세테이트의 다른 배치는 일관성 없는 품질과 용해도의 문제가 있습니다. 침상 침전물은 전자 현미경으로 시각화할 때 재수화된 샘플에 때때로 나타났습니다. pH 5.5에서 hepes 완충액으로 세척하면 이 문제를 완화할 수 있습니다. 셋째, 조직 샘플에 대한 샘플 준비는 추가 최적화가 필요합니다.
결론적으로, ANSM 기반 AuNP 합성 기술과 HPF/FSF-재수화-HPF/FSF의 샘플 전처리 방법을 결합한 클로너블 EM 라벨링 기술은 전자 현미경으로 세포에서 유전적으로 태그된 단백질의 명확한 단일 분자 식별을 가능하게 합니다. 현재의 프로토콜은 엄청난 범위의 생물학적 질문을 다룰 수 있도록 허용해야 합니다.
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Disclosures
저자는 이해 상충을 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
여기에 설명된 프로토콜은 Jiang et al. (2020). 이 작업은 MOST(973 프로그램 번호 2011CB812502 및 2014CB849902)의 보조금과 베이징 시 정부의 자금 지원으로 지원되었습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.025 mm/0.275 mm Aluminum carrier | Beijing Wulundes Biotech Ltd., or Engineering Office of M. Wohlwend | ||
| 0.2 M HEPES buffer | Dissolve HEPES (0.2 M) in 980 mL of ddH2O, then add 10 mL of 100 mM MgCl2 and 10 mL of 100 mM CaCl2 (final concentration 1 mM), respectively, adjust pH to 5.5 | ||
| 1.5 mL MaxyClear snaplock microtube | Axygen Scientific | MCT150C | |
| 2 mL polypropylene screw cap microtubes | Biologix | 81-0204 | |
| 200 mesh hexagonal copper grid | Tedpella inc | G200HEX | |
| 2-mercaptoethanol | Amresco | 0482-250ML | |
| 35 mm cell culture dishes | Corning | 430165 | |
| 50 mL polypropylene centrifuge tubes | Corning | 430928 | |
| Acetone | Beiijng Tong Guang Fine Chemicals Company | 31025 | |
| Automated freeze substitution machine | Leica | AFS2 | |
| Customized 3.05 mm x 0.66 mm specimen holders for HPF | Beijing Wulundes Biotech Ltd. | ||
| D-penicillamine | TCI | P0147 | |
| Dulbecco’s modified Eagle medium | GBICO | C11965500BT | |
| Fetal bovine serum | GBICO | 10099-141C | |
| Flat bottom embedding capsule | Tedpella inc | ||
| Foam cryobox | |||
| Formvar 15/95 resin | Electron Microscopy Sciences | 15800 | |
| HAuCl4 | Sigma | 4022-1G | |
| HEPES | sigma | H3375-500G | |
| HPF machine | Wohlwend | HPF compact01 | |
| Methonal | Beiijng Tong Guang Fine Chemicals Company | 12397 | |
| NaBH4 | Sigma | 480886-25G | |
| OsO4 | Electron Microscopy Sciences | 19110 | |
| PBS-A buffer | Dissolve NaH2PO4 (1.125 mM), Na2HPO4 (3.867 mM), NaCl (100 mM) in 1 L of ddH2O, adjust to pH 7.4 | ||
| Qualitative filter paper (medium speed) | Beyotime Biotechnology | FFT08 | |
| Sapphire discs | Beijing Wulundes Biotech Ltd., or Engineering Office of M. Wohlwend | ||
| Solvent resistant pen | Electron Microscopy Sciences | 62053-B | |
| SPI-Pon 812 resin | SPI Inc | 02659-AB | |
| Transmission electron microscopy | FEI | Tecnai G2 spirit | |
| Trypsin-EDTA | GBICO | C25200-056 | |
| Tweezers | Dumont | ||
| Ultramictotome | Leica | FC7 | |
| Uranyl acetate | Electron Microscopy Sciences | 22400 |
References
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