Summary
Laboratorieanalyser kan udnytte prognostisk værdi fra den langsgående optiske kohærenstomografi (OCT) -baserede multimodale billeddannelse af aldersrelateret makuladegeneration (AMD). Menneskelige donorøjne med og uden AMD er afbildet ved hjælp af OCT, farve, nær-infrarød reflektansscanning, laseroftalmoskopi og autofluorescens ved to excitationsbølgelængder før vævssektionering.
Abstract
En progressionssekvens for aldersrelateret makuladegeneration (AMD) lært af optisk kohærenstomografi (OCT) -baseret multimodal (MMI) klinisk billeddannelse kunne tilføje prognostisk værdi til laboratoriefund. I dette arbejde blev ex vivo OCT og MMI anvendt på humane donorøjne før retinal vævssektionering. Øjnene blev genvundet fra ikke-diabetiske hvide donorer i alderen ≥80 år med en død-til-bevaringstid (DtoP) på ≤6 timer. Globerne blev genfundet på stedet, scoret med en 18 mm trephin for at lette hornhindefjernelsen og nedsænket i bufret 4% paraformaldehyd. Farvefundusbilleder blev erhvervet efter fjernelse af forreste segment med et dissekeromfang og et spejlreflekskamera ved hjælp af trans-, epi- og flashbelysning ved tre forstørrelser. Globerne blev placeret i en buffer i et specialdesignet kammer med en 60 dioptrilinse. De blev afbildet med spektraldomæne OCT (30 ° makulaterning, 30 μm afstand, gennemsnit = 25), nær-infrarød reflektans, 488 nm autofluorescens og 787 nm autofluorescens. AMD-øjnene viste en ændring i retinale pigmentepitel (RPE) med drusen eller subretinale drusenoidaflejringer (SDD'er), med eller uden neovaskularisering og uden tegn på andre årsager. Mellem juni 2016 og september 2017 blev 94 højre øjne og 90 venstre øjne genoprettet (DtoP: 3,9 ± 1,0 timer). Af de 184 øjne havde 40,2% AMD, herunder tidlig mellemliggende (22,8%), atrofisk (7,6%) og neovaskulær (9,8%) AMD, og 39,7% havde unremarkable makulaer. Drusen, SDD'er, hyperreflekterende foci, atrofi og fibrovaskulære ar blev identificeret ved hjælp af OCT. Artefakter omfattede vævsopacificering, løsrivelser (bacillær, retinal, RPE, choroidal), foveal cystisk forandring, en bølgende RPE og mekanisk skade. For at styre kryo-sektioneringen blev OCT-volumener brugt til at finde fovea og optisk nervehoved landemærker og specifikke patologier. Ex vivo-mængderne blev registreret med in vivo-volumenerne ved at vælge referencefunktionen til øjensporing. Ex vivo-synligheden af den patologi, der ses in vivo , afhænger af bevaringskvaliteten. Inden for 16 måneder blev 75 hurtige DtoP-donorøjne på alle stadier af AMD genoprettet og iscenesat ved hjælp af kliniske MMI-metoder.
Introduction
Femten års styring af neovaskulær aldersrelateret makuladegeneration (AMD) med anti-VEGF-terapi under vejledning af optisk kohærenstomografi (OCT) har givet ny indsigt i progressionssekvensen og mikroarkitekturen af denne udbredte årsag til synstab. En vigtig anerkendelse er, at AMD er en tredimensionel sygdom, der involverer neurosensorisk nethinden, retinal pigmentepitel (RPE) og choroid. Som et resultat af OCT-billeddannelse af forsøgspatienter og medøjne hos behandlede klinikpatienter anerkendes patologiens træk ud over dem, der ses af farvefundusfotografering, en klinisk standard i årtier, nu. Disse omfatter intraretinal neovaskularisering (type 3 makula neovaskularisering1, tidligere angiomatøs proliferation), subretinale drusenoidaflejringer (SDD'er, også kaldet retikulær pseudodrusen)2, flere veje til RPE-skæbne3,4 og intenst gliotiske Müller-celler i atrofi 5,6.
Modelsystemer, der mangler makulaer (celler og dyr), genskaber nogle skiver af denne komplekse sygdom 7,8,9. Yderligere succes med at forbedre AMD-byrden kunne komme fra opdagelsen og udforskningen af primær patologi i menneskelige øjne, forståelse af makulaens unikke cellulære sammensætning efterfulgt af oversættelse til modelsystemer. Denne rapport skildrer et tre årtiers samarbejde mellem et akademisk forskningslaboratorium og en øjenbank. Målet med vævskarakteriseringsmetoderne beskrevet heri er todelt: 1) at informere udviklende diagnostisk teknologi ved at demonstrere grundlaget for fundusudseende og billeddannende signalkilder med mikroskopi og 2) at klassificere AMD-prøver til målrettede (immunhistokemiske) og ikke-målrettede molekylære opdagelsesteknikker (billeddannelsesmassespektrometri, IMS og rumlig transkriptomik), der bevarer fovea kun kegle og stavrig para- og perifovea. Sådanne undersøgelser kunne fremskynde oversættelsen til klinisk OLT, for hvilken en progressionssekvens og langsgående opfølgning er mulig gennem øjensporing. Denne teknologi, der er designet til at overvåge behandlingseffekter, registrerer scanninger fra et klinikbesøg til det næste ved hjælp af retinale kar. Sammenkædning af øjensporet OLT med laboratorieresultater opnået med destruktive teknikker kunne give et nyt niveau af prognostisk værdi til molekylære fund.
I 1993 fangede forskningslaboratoriet farvefotografier af postmortem fundus på film10. Denne indsats blev inspireret af den fantastiske fotomikroskopi og histologi af den menneskelige perifere nethinde af Foos og kolleger 11,12,13 og de omfattende AMD kliniske korrelationer af Sarks et al.14,15. Fra 2009 blev ex vivo multimodal imaging (MMI) forankret på spektraldomæne OCT vedtaget. Denne overgang var inspireret af andres lignende indsats 16,17 og især af erkendelsen af, at så meget af den ultrastruktur, der blev beskrevet af Sarks, var tilgængelig i tre dimensioner over tid i klinikken 18,19. Målet var at erhverve øjne med vedhæftede makulaer inden for en rimelig tidsramme for veldrevne undersøgelser af fænotyper på celleniveau i nethinden, RPE og choroid. Hensigten var at bevæge sig ud over "per øje" statistik til "per læsionstype", en standard påvirket af de "sårbare plaque" -begreber fra hjerte-kar-sygdom20,21.
Protokollen i denne rapport afspejler erfaringer med næsten 400 par donorøjne, der er tiltrådt i flere strømme. I 2011-2014 blev Project MACULA-webstedet for AMD-histopatologi oprettet, som omfatter lagtykkelser og kommentarer fra 142 arkiverede prøver. Disse øjne blev bevaret fra 1996-2012 i et glutaraldehyd-paraformaldehydfikseringsmiddel til epoxyharpikshistologi med høj opløsning og elektronmikroskopi. Alle fundi var blevet fotograferet i farver, da de blev modtaget og blev genafbildet af OCT lige før histologi. En øjenholder oprindeligt designet til synsnerveundersøgelser22 blev brugt til at rumme en 8 mm diameter fuld tykkelse vævsstans centreret på fovea. OCT B-scanninger gennem fovealcentret og et sted 2 mm overlegent, svarende til histologi på samme niveauer, blev uploadet til hjemmesiden plus et farvefundusfotografi. Valget af OLT-flyene blev dikteret af AMD-patologiens fremtrædende plads under fovea23 og fremtrædende SDD'er i stangrige områder, der var bedre end fovea24,25.
Fra 2013 var øjne afbildet med OCT-forankret MMI i løbet af livet tilgængelige for direkte kliniskopatologiske korrelationer. De fleste (7 ud af 10 donorer) involverede patienter i en nethinden henvisningspraksis (forfatter: K.B.F.), som tilbød et avanceret direktivregister for patienter, der var interesserede i at donere deres øjne efter døden til forskningsformål. Øjnene blev genfundet og konserveret af den lokale øjenbank, overført til laboratoriet og forberedt på samme måde som Project MACULA øjnene. Pre-mortem kliniske OCT-volumener blev problemfrit aflæst i laboratoriet, hvilket tilpassede de patologiske træk, der blev set i løbet af livet, med de funktioner, der ses under mikroskopet26.
Fra 2014 begyndte prospektiv øjenindsamling med screening for AMD i donorøjne uden klinisk historie, men bevaret inden for en defineret tidsgrænse (6 timer). Til dette formål blev øjenholderen modificeret til at rumme en hel klode. Dette reducerede risikoen for løsrivelse omkring de afskårne kanter på den tidligere anvendte 8 mm stans. Øjnene blev bevaret i 4% bufret paraformaldehyd til immunhistokemi og overført til 1% den næste dag til langtidsopbevaring. I 2016-2017 (før pandemien) blev 184 øjne fra 90 donorer genoprettet. Statistikken og billederne i denne rapport er genereret fra denne serie. Under pandemitiden (lockdowns og eftervirkninger i 2020) fortsatte potentielle samlinger til transkriptomik og IMS-samarbejde i et reduceret tempo, hovedsageligt ved hjælp af 2014-metoderne.
Andre metoder til donor øjenvurdering er tilgængelige. Minnesota Grading System (MGS)27,28 er baseret på AREDS kliniske system til farvefundusfotografering 29. Begrænsningerne ved denne metode indbefatter kombinationen af atrofisk og neovaskulær AMD i et trin af "sen AMD". Endvidere indebærer MGS fjernelse af den neurosensoriske nethinden før fotodokumentationen af RPE-choroid. Dette trin løsner SDD'er i varierende grad30,31 og fjerner den rumlige korrespondance mellem den ydre nethinden og dens støttesystem. Således kan bestræbelser på at forbinde metabolisk efterspørgsel og signalering fra nethinden til patologi i RPE-choroid hæmmes. Utah-systemet implementerede MMI ved hjælp af ex vivo farvefotografering og OCT til at kategorisere øjne bestemt til dissektion i regioner til RNA- og proteinekstraktioner32. Selvom det foretrækkes frem for hele øjenkopekstraktioner, repræsenterer området med en diameter på 3 mm med den højeste risiko for AMD-progression33,34 kun 25% af et fovea-centreret slag med en diameter på 6 mm. Således er teknikker, der kan lokalisere fund i forhold til fovea, såsom seriel sektionering for immunhistokemi, fordelagtige.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Det institutionelle bedømmelsesudvalg ved University of Alabama i Birmingham godkendte laboratorieundersøgelserne, som overholdt god laboratoriepraksis og biosikkerhedsniveau 2/2+. Alle amerikanske øjenbanker overholder 2006 Uniform Anatomical Gifts Act og US Food and Drug Administration. De fleste amerikanske øjenbanker, herunder Advancing Sight Network, overholder de medicinske standarder fra Eye Bank Association of America.
Materialetabellen viser forsyninger og udstyr. Supplerende materiale 1 giver et overblik over dissektionen, farvefundusfotografering og OCT-baseret MMI. Supplerende materiale 2 indeholder oplysninger om det OCT-baserede MMI.
1. Kriterier for vævsindsamling
- For at maksimere udbyttet af AMD-øjne på en skærm med udokumenterede donorer skal du indstille følgende kriterier for acceptable donorer: alder ≥80 år, hvid, ikke-diabetiker og ≤6 timers død til bevarelse (DtoP).
BEMÆRK: DtoP defineres som tiden mellem døden, og når øjet placeres i et givet konserveringsmiddel, enten på hospitalet eller i laboratoriet.
2. Konserveringsmedium og andet præparat (laboratorium)
- Lav 4% fosfatbufret paraformaldehyd fra 20% lager (købt). Forbered 1 liter ved at tilsætte 200 ml 20% paraformaldehyd (fortyndingsfaktor på 5) til 800 ml 0,1 M Sorensons fosfatbuffer. Test og juster om nødvendigt for at sikre, at pH-værdien er 7,2. Opbevares ved 4 °C.
- Dispenser 30 ml 4% fosfatbufret paraformaldehyd i 40 ml krukker.
- Lager mærket 40 ml beholdere med konserveringsmiddel ved øjenbanken, så vævet kan genvindes når som helst og på en hvilken som helst dag.
- Til opbevaring af konserverede øjne fremstilles 1% paraformaldehyd fra 4% opløsningen. Forbered 1 liter ved at tilsætte 250 ml 4% paraformaldehyd (fortyndingsfaktor på 4) til 750 ml 0,1 M Sorensons fosfatbuffer. Test og juster pH-værdien om nødvendigt. Opbevares ved 4 °C.
- Forbered 1 liter af en 0,1 M opløsning fra 0,2 M opløsningen af Sorensons fosfatbuffer, pH 7,2, ved at kombinere 500 ml destilleret vand og 500 ml Sorensons buffer.
- pH-værdien justeres dråbe for dråbe med 1 N saltsyre eller 1 N natriumhydroxid. Opbevares ved 4 °C.
- Opret en holder for at stabilisere øjnene under dissektion. Fyld en petriskål med tandvoks opvarmet til væske. Når det er lidt køligt, skal du lave et halvkugleformet indtryk i det med et stort kugleleje og derefter fryse skålen for at lette fjernelsen af kuglelejet.
3. Øjenbank metoder
- For at sikre hurtig genopretning af forskningsvæv skal alle væv hurtigt genvindes, herunder dem, der er beregnet til transplantation.
- Modtag dødshenvisninger, som krævet ved lov, inden for 1 time efter døden, og spor hver donor med et henvisningssekvensnummer, der følger vævet.
- For at finde cases med potentiel klinisk dokumentation skal du stille AMD- og øjensygdomsspecifikke spørgsmål i forskningsdonorrisikovurderingsinterviewet.
- For at minimere rejsetiden skal du genvinde hele kloder (til forskel fra kun hornhinder til transplantation) inden for et kompakt område (dvs. by og tilstødende forstæder amt).
- Bring to krukker konserveringsmiddel (bufret 4% paraformaldehyd) til afdødes hospitalsrum til vævsgendannelse (i modsætning til at vente på, at kroppen flyttes til et lighus).
- Før og under genopretning skal du kommunikere med efterforskerne for at bekræfte levering og timing.
- Genvind kloderne på hospitalet, åbn dem ved hjælp af konsekvente håndteringsmetoder, og nedsænk det åbne øje i konserveringsmiddel (figur 1).
- Hold det udskårne donorøje på plads ved hjælp af en kappe af gaze stabiliseret af en hæmostat.
- For at lette fjernelsen af hornhinden med en 2 mm bred kant af sclera, brug en 18 mm diameter trephine til at score kloden.
- For at frigøre hornhinden med en ledsagende kant af sclera, skal du klippe langs den scorede cirkel ved hjælp af fjederbelastet saks med buede spidser, mens du stabiliserer kloden med den hæmostatklippede gaze.
- Løft hornhinden af scleraen, udsæt iris og ciliary krop.
- For at lette konserveringsmidlets indtrængning i glaskammeret laves en 2 mm lang slids i iris vinkelret på pupilmargenen. Anbring øjnene i prøveglas med 30 ml konserveringsmiddel ved 4 °C, og overfør dem til laboratoriet på våd is.
- Overfør afidentificerede donoroplysninger elektronisk fra øjenbanken til forskningslaboratoriedatabasen.
BEMÆRK: Databasen vedligeholder henvisningsnummeret, øjenbankens vævsnummer og laboratorie-id-nummeret til sporing samt andre relevante oplysninger.
4. Vævsforberedelse til ex vivo farve fundus fotografering
- Brug to stereomikroskoper, et til dissektion og et til fundusfotografering i farver.
BEMÆRK: For transillumination for at visualisere pigmentforandringer skal du bruge en base til mørkefeltmikroskopi. - Fjern resterne af det forreste segment (iris og linse). For at stabilisere øjet under dissektion skal du placere det i petriskålen fyldt med voks (supplerende materiale 1, dias 7-8). For at forhindre, at ciliarylegemet og den vedhæftede nethinden kollapser ind i glaslegemet, skal du minimere forstyrrelsen af ringen af tykt glaslegeme, der er fastgjort til ciliarylegemet (glaslegemet).
- Marker den overlegne stang for orientering. Placer kloden med den forreste side nedad i fadet. Find indsættelsessenerne i den overlegne rektus og overlegne skrå muskler. Brug en træapplikator til at påføre en markeringsblæk sparsomt i en 10 mm linje i en forreste til bageste retning (dvs. vinkelret på den tendinøse indsættelse af den overlegne rektusmuskel).
- Før fotografering skal du fylde fundus med kold Sørensens fosfatbuffer.
- Indsæt en 1 mm rubinperle i fundusen som en intern skalabjælke, der skal vises på hvert billede27.
- Få farvebilleder med et spejlreflekskamera monteret på et stereomikroskop udstyret med en ringblitz. Brug trans-, epi- og flashbelysning ved hver af tre standardforstørrelser til at tage billeder, der er beregnet til at fremhæve specifikke områder (supplerende materiale 1, dias 11): 1) fundus til ækvator, 2) den bageste pol (vaskulære arkader, optisk nervehoved, fovea) og 3) fovea inden for macula lutea (gul plet).
5. Forberedelse til ex vivo farve fundus fotografering
- Tænd kameraet og skærmen. Tilslut fjernlukkeren, og slip aktuatoren i HDMI-skærmen (high-definition multimedia interface) kamera/tv (TV) og skærmkablet.
- Indstil kameraindstillingerne til manuel ISO-funktion og spejlets låseposition (låst på plads for at reducere vibrationer).
BEMÆRK: Se producentens brugervejledning for indstillingerne på det anvendte kamera. Lær af kameraet, vis indstillingerne for over/undereksponering i forhold til histogrammet og eksponeringsaflæsningerne. - Der anbringes to lyskilder, hver med to fleksible lysledere placeret vinkelret på hinanden, til belysning i de fire kardinalretninger på mikroskopstadiet (supplerende materiale 1, side 10).
- Tænd epi-belysningslyskilderne til fuld effekt.
BEMÆRK: Det er nyttigt, men ikke nødvendigt at have et sort filthylster rundt på scenen for at begrænse lys / flashspredning for fotografen. - Ved dissekeringsmikroskopet skal du bruge tang til at indsætte den bageste pol i en 30 ml kvartsdigel fyldt med buffer. Lad vævet synke til bunden. Indsæt en afstivning, såsom en vævssvamp, mellem øjet og digelens væg for at forhindre bevægelse. Indsæt 1 mm rubinperlen i den bageste stang.
BEMÆRK: Perlen kan falde ned i synsnervekoppen. - Placer forsigtigt kloden i diglen på stereomikroskopets scene, og observer den indre okulære fundus gennem mikroskopets okularer. Brug den laveste forstørrelse til at orientere øjet ved at identificere vævsmærket ved klokken 12, synsnervehovedet (ONH) og fovea 5 ° under ONH. Drej øjet, så fovea falder 5° under en linje gennem ONH.
BEMÆRK: Hvis det er et højre øje, er ONH til højre for fovea, set gennem mikroskopets okular. Hvis det er et venstre øje, er ONH til venstre for fovea. - Tænd for fjernskærmens visning fra kameraet. Sørg for, at mikroskopets strålesplitterskyder er indstillet til at observere gennem fotoporten og ikke gennem porten til okularen. Afhængigt af lyset og spejlbanen skal du være forberedt på at rotere vævet 180 ° på scenen for korrekt orientering.
6. Billedoptagelse ved hjælp af ex vivo farve fundusfotografering
- Når epibelysningen er tændt, skal du indstille forstørrelsen, så hele 18 mm trephinsnittet optager hele synsfeltet. Forøg forstørrelsen, så det er muligt at fokusere på bunden af fovealgraven. Reducer forstørrelsen til den forrige indstilling.
- Juster ISO-indstillingerne i området 1.600-3.000, så eksponeringstiderne falder i midterområdet for måleren på kameraet.
- Tryk på fjernudløseren. Lyt efter, at spejlet låses i opadgående position. Tryk på udløseren igen for eksponering.
- Hold øje med billedet på skærmen, hvor de forudindstillede metadata viser rød, grøn, blå (RGB) og et farvehistogram for den korrekte eksponering. Hvis eksponeringen er acceptabel, fortsættes; Hvis ikke, skal du slette, revurdere parametrene og genafbilde.
- Sluk svanehalslamperne for epi-belysning for at fremhæve drusen, og tænd blitzen med en 1/4 s eksponering, en kameralukkertid på 1/250 s og en ISO på 100-320. Indstil flashhastigheden til standard, eller rediger den under den første opsætning af kameraet. Hent et billede, og kontroller histogrammet for korrekt eksponering.
- Sluk for blitzen, og tænd for transbelysningskilden. Nulstil ISO til over 5.000, og sørg for, at eksponeringstiden ikke går under 1/30 sek. på grund af potentielle vibrationer i det fotografiske system. Hent et billede, og kontroller histogrammet for korrekt eksponering.
- Forøg forstørrelsen for at få vist både ONH og fovea i synsfeltet. Tænd epi-belysningslamperne. Indstil ISO-området til 1.600-3.000. Sørg for, at eksponeringstiderne falder i kameraets midterområde.
- Sluk for epi-belysningslamperne, og tænd blitzen med en eksponering på 1/4 sek., den forudindstillede kameralukkertid indstillet til 1/250 sek. og ISO indstillet til 400-800. Hent et billede, og kontroller histogrammet for korrekt eksponering.
- Sluk for blitzen, og tænd for transbelysningen ved hjælp af mørkefeltbasen. Nulstil ISO til over 5.000. Sørg for, at eksponeringstiden ikke er langsommere end 1/30 sek. på grund af potentielle vibrationer i det fotografiske system. Få et billede, og kontroller for et korrekt histogram.
- Sluk for transilluminationen, og tænd epi-belysningslamperne igen.
- Forøg forstørrelsen til den, der blev brugt i trin 6.7. Fokuser igen, hvis det er nødvendigt.
- Forøg ISO inden for området 3.000-6.000, og juster eksponeringstiden, så den falder inden for kameraets korrekte eksponeringsområde. Få et billede.
BEMÆRK: Rubinperlen vises muligvis ikke længere i synsfeltet. Hvis det er tilfældet, skal du tage separate billeder af perlen ved denne forstørrelse som reference. - Sluk for epi-belysningslamperne. Tænd blitzen med en 1/4 s eksponering og med kameraets lukkertid til 1/250 sek. Indstil flashhastigheden til standard, eller skift den under den første opsætning af kameraet, og indstil ISO til 500-1.000. Hent billedet. Kontroller histogrammet for korrekt eksponering.
- Sluk for blitzen, og tænd transbelysningslamperne. Nulstil ISO til over 8.000 for at give en hurtigere eksponeringstid med en mere følsom billedsensor. Sørg for, at eksponeringstiden ikke går under 1/30 s på grund af potentielle vibrationer i det fotografiske system. Få et billede.
- Eksporter billederne fra kameraet til en computer. Gennemgå billederne, før du fjerner prøven fra mikroskopstadiet, hvis nogle skal tages igen.
7. Oversigt over billedoptagelse til ex vivo OCT og scanning laser oftalmoskopi (SLO)
- For spektraldomæne OCT placeres kloderne i fosfatbuffer i en brugerdefineret øjenholder med et kammer med en 60 dioptrilinse35. Monter øjenholderen på et beslag på en klinisk OCT-billeddannelsesenhed, og fastgør den til, hvor en patient vil hvile panden. OCT-enheden indsætter automatisk en skalabjælke i hvert billede.
- På samme tid, ved hjælp af den samme enhed og med øjet stadig i holderen, billede kloderne med et scanningslaseroftalmoskop (SLO) ved hjælp af nær-infrarød reflektans (NIR, brugt som lokaliseringsbillede af den indbyggede software), 488 nm excitation fundus autofluorescens (FAF) og rødfri (RF) reflektans.
BEMÆRK: 787 nm excitation FAF i denne enhed er kun lejlighedsvis egnet, fordi en strålesplitter reducerer lystransmissionen til SLO'en. Af denne grund anvendes en anden enhed til 787 nm FAF-billeder (se næste punkt). - Separat, men med øjet stadig i øjenholderen, skal du afbilde kloderne med 787 nm FAF til detektering af RPE-forstyrrelse36 ved hjælp af en separat enhed, der viser denne modalitet godt.
8. Protokol for billedoptagelse for ex vivo OCT/SLO (se dias i supplerende materiale 2)
- Angiv den overlegne rektusmuskel med vævsmarkeringsfarvestof. Tænd laseren (blå pil, supplerende materiale 2, side 1).
- Henvis til side 2 i supplerende materiale 2, anbring OLT-hovedet ved at flytte hele enheden i to akser i forhold til basen (grøn pil) og derefter hæve højden (y) ved at dreje joysticket med uret/mod uret (cw/ccw, blå pile). Fokuser billedet ved at dreje knappen (orange pil) med det sorte håndtag i position R (*). Lås enheden ved at fastgøre tommelfingerskruen (lilla pil).
- Sæt øjet ind i holderen, og stabiliser fra det bageste aspekt med afstandsstykker (supplerende materiale 1, side 13). Udøv så lidt pres som muligt for at undgå buler i scleraen. Orienter dig med vævsmærket for den overlegne rektusmuskel, der vender opad.
BEMÆRK: Den omtrentlige afstand fra forsiden af øjenholderen til OCT-enheden er 25 mm. - Åbn den proprietære visualiserings- og analysesoftware til OCT-enheden. En patientliste vises i venstre kolonne. Øjendonorerne indekseret med et internt kodenummer er "patienterne". Se brugervejledningen fra producenten.
- Vælg ikonet Ny patient . Udfyld oplysningerne om patientdata efter behov. Vælg OK. Brug et logisk ordnet nummereringssystem til individuelle øjne, såsom YYYYNNNL,R_agesex. For eksempel kan dette være 2017016R_97F.
- Når du har fortsat dataindtastningen i det følgende vindue, skal du trykke på OK. Vælg operatør og undersøgelse fra rullemenuen.
BEMÆRK: De indtastede oplysninger vises i de eksporterbare metadata. - Når du har set en tom skærm, skal du trykke på den gule knap for at starte billedoptagelsen.
- Tryk på IR + OCT (nær infrarød reflektans + OCT). Lad laseren få et live SLO-billede af fundus og OCT B-scanning.
- Afslut den korrekte anatomiske position baseret på ONH og fovea, og brug en træapplikator til at justere øjenpositionen i holderen. Drej den sorte runde knap på kontrolpanelet for at justere intensiteten.
- Tryk på den samme knap for at gennemsnit 9-100 billeder (røde pile; 9 er tilstrækkeligt, 100 ser cremet ud). Hvis enheden vender korrekt, skal fundusen være i fokus, og OCT B-scanningen skal vises i den øverste tredjedel af displayet (supplerende materiale 2, side 9, dobbelt rød pil).
- På fundusbilledet skal du bruge markøren til at flytte den blå linje for at centrere fovea (supplerende materiale 2, side 9, hvid pil). Tryk på Ansk.
BEMÆRK: Andre standardknapper er Retina, EDI (fra) og Line Scan.
- Tryk på RF + OCT for den næste erhvervelse. Kontroller positionen igen for at sikre, at billedet ikke er flyttet eller forringet. Tryk på den sorte knap for gennemsnit. Tryk på Ansk.
- Skift den interne terning til autofluorescensbilleddannelse til excitationsbølgelængderne 488 nm og 787 nm (supplerende materiale 2, side 10).
BEMÆRK: Kubepositionen efter kontakten vises. - Vælg Autofluorescenstilstand . Kontroller justeringen igen. Tryk på Ansk.
- Ved mistanke om RPE-forstyrrelser og atrofi skal du vælge ICGA (indocyaningrøn angiografi) for 787 nm autofluorescens. Kontroller øjenpositionen igen, og tryk derefter på Ansk.
BEMÆRK: Et fundusbillede vises ofte ikke i denne modalitet, fordi den interne terning dæmper strålen. - Skift den interne kube tilbage til R for IR og rød fri billeddannelse for volumenoptagelse.
BEMÆRK: Kubepositionen efter kontakten er vist på side 13 i supplerende materiale 2. - Hvis du vil hente OCT-diskenhederne, skal du vælge IR og lydstyrkeindstillingen. Match alle indstillingerne på side 14 i supplerende materiale 2 ved at skifte mellem de relevante knapper på kontrolmodulet (30° makulaterning, 30 μm afstand, gennemsnit afhængigt af forsøgskravene).
- Bemærk, at fundusvisningen for nær-infrarød reflektans er dækket af blå B-scanningslinjer. Kontroller OCT-positionen igen i den øverste tredjedel af højre vindue. Tryk på Hent på kontrolmodulet, og vent 5 minutter på, at diskenhedsscanningen er fuldført. Når anskaffelsen af billedbehandlingen er fuldført, skal du vælge AFSLUT. Billederne gemmes (rød pil).
BEMÆRK: De blå linjer afgrænser afstandene vist i den forrige visning i mikrometer. Scanningerne starter nummerering fra bunden (ringere) og fortsætter opad. Bemærk den røde linjes progression. - Lad computeren behandle de erhvervede billeder, som vises på skærmen (supplerende materiale 2, side 16).
- Når du tager billeder af en donors medøjne, må du ikke ændre placeringen af monteringsbeslaget mellem øjnene. Hvis venstre øje afbildes først, vises resultaterne i OD-kolonnen (højre øje). Højreklik for at markere alle billederne, og vælg derefter Exchange OS/OD. Billederne skifter til OS-kolonnen.
- Tryk på Vælg > vindue > database. Skærmen er som standard panel 6 med tilføjelsen af donorøjet afbildet i højre kolonne (supplerende materiale 2, side 18). Højreklik på patienten i rullemenuen, vælg Batch, og eksporter E2E-filen.
- Gå til den forudbestemte mappe, der er oprettet på skrivebordet til filoverførsler. Vælg OK. Mappen indeholder E2E-filerne, der skal kopieres til en ekstern harddisk og arkiveres.
- Før øjet i holderen til scanningslaseroftalmoskopet, som hovedsagelig anvendes til 787 nm autofluorescens.
BEMÆRK: Se producentens brugervejledning for erhvervelse og arkivering af billederne. - Tænd computeren og laseren.
- Vælg ikonet Ny patient . Udfyld patientdataene efter behov.
- Hvis du vil bevare det samme i øjedatabladet, skal du trykke på OK. Når C-kurven forbliver den samme, skal du trykke på Fortsæt.
- Vælg Studietilstand , og indtast adgangskoden, hvis det kræves. Hold C-kurven på 7,7 mm. Tryk på OK.
- Vælg Fortsæt for at bekræfte C-kurven. Vælg den gule indikator for at starte kameraet.
- Vælg R-positionen. Juster og orienter kloden. Vælg IR-tilstand for at fokusere og orientere som ovenfor.
- Vend kamerahovedet ved at bevæge hele enheden i to akser i forhold til basen (supplerende materiale 2, side 28, grøn pil) og derefter hæve enhedens højde (y) (blå pile). Fokuser billedet ved at dreje knappen (orange pil). Det sorte håndtag er i position R (*). Når dette hoved er på plads, låses enheden ved at dreje tommelskruen (lilla pil).
- Bemærk, at skærmbilledet fremstår som vist på side 29 i supplerende materiale 2.
- Flyt vælgerknappen fra R til A. Vælg ICGA (for at opnå 787 nm autofluorescens) i blåt, 100 % intensitet, et synsfelt på 30° og enfaset billeddannelse.
BEMÆRK: Ligesom farvestoffet indocyaningrøn er melanin ophidset af 787 nm bølgelængdelys. - Bemærk, at skærmbilledet vises som vist på side 31 i supplerende materiale 2. Tryk på den sorte disk for gennemsnittet, og vælg derefter Ansk.
- Vælg Vindue > database. Vælg Importer E2E-filer fra SLO-enheden; Disse filer gemmes på en ekstern harddisk og uploades til skrivebordet.
- Vælg Åbn. Kontroller, at mærkerne er standard, og vælg OK.
- Bemærk, at patienten nu har to faner: en, der viser billederne fra SLO'en (blå pil), og den anden fane, der viser billederne hentet fra OCT-enheden (rød pil) (supplerende materiale 2, side 34).
- Højreklik på 786 nm (ICGA) -billedet, og eksporter billedet til en fil mærket SLO 786 på skrivebordet.
- Hvis du vil gemme SLO-billedet på 786 nm autofluorescens, skal du markere patienten og højreklikke for at eksportere billeder som RAW-filer (for .vol-filer) til en mappe på skrivebordet.
- For at eksportere billeder fra OCT-enheden til overførsel til arkivcomputeren skal du kopiere/indsætte fra RAWEXPORT til en mappe mærket RAW.
9. Gennemgang af billedbehandling
- Saml billederne (farve, .vol-fil, SLO-billeder) i mapper for hver donor med undermapper til hvert øje, og indekser mapperne fortløbende efter laboratorie-id.
- Registrer vævsaftrykkene (kvalitet, patologi) i en database til en standardiseret rapport.
- Gennemgå de eksporterede OCT-diskenheder med et internt ImageJ-plugin.
- Find fovea-centret, som kan genkendes af midten af foveal dip, den indadgående stigning af de ydre retinale bånd eller det tyndeste punkt. I de fleste tilfælde vil disse falde sammen, men ikke altid, da dette afhænger af foveal bevarelse, individuel variabilitet og tilstedeværelsen af patologi.
- Find en standardscanning i den overlegne perifovea (2 mm/67 B-scanninger væk i overlegen retning; dvs. stigende scanningstal).
- Gem en .tif stak af hele diskenheden til hurtig reference i fremtiden.
- Rul gennem OCT-lydstyrken i sin helhed, startende fra scanning 1 (ringere), mens du registrerer scanningsnumrene, hvor funktioner genkendes.
- Kontroller det peripapillære område ud over makulaen.
BEMÆRK: Peripapillær chorioretinal atrofi i ældre øjne omfatter en karakteristisk basal laminær aflejring og neovaskularisering. Dette er et fælles område med pigmentændring i myopiske øjne og glaukom, såvel som i aldring og AMD37.
- Undersøg farvefotografierne, og link eventuelle fund til dem, der ses af OCT, hvis det er muligt.
BEMÆRK: Generelt er det lettere at se de fleste resultater efter OCT først. Farvefotografier giver et stort billede af området uden for området på SLO, choroidal pigmentering inklusive nevi, tilstedeværelsen af hæm og hårde ekssudater og sort pigment i neovaskulær AMD. Mørkt pigment i fovea kan repræsentere løse melanosomer fra det forreste segment og skal vaskes forsigtigt væk med buffer ved hjælp af en pipette. - Undersøg SLO-billederne, og link eventuelle resultater til dem, der ses af OCT, hvis det er muligt.
- Gem standard B-scanninger på fovea og perifovea, ekstra B-scanninger med bemærkelsesværdig patologi eller andre funktioner og SLO-billeder i en patologirapport.
- Kategoriser øjnene som følger: unremarkable, tvivlsomme, tidlige mellemliggende AMD, atrofisk AMD, neovaskulær AMD, andre, ukendte, ikke gradable, ikke registreret. "Tvivlsom" bruges, hvis det ikke er klart, om ændringer er alvorlige nok til en anden kategorisering. "Not Gradable" er forbeholdt øjne, der mangler nyttige OCT-scanninger, såsom dem med svært løsrevne nethinder. "Ikke optaget" er forbeholdt øjne, der behandles umiddelbart efter modtagelse uden fotografering.
- Brug disse kriterier for AMD: alvorlig RPE-ændring med enten drusen- eller subretinale drusenoidaflejringer, med eller uden tegn på neovaskularisering, såsom væske eller fibrose, og uden tegn på andre årsager (opdateret fra Curcio et al.10 for at imødekomme SDD'er).
BEMÆRK: Den endelige diagnose bekræftes ved histologisk analyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Tabel 1 viser, at i løbet af 2016-2017 blev 184 øjne fra 94 hvide ikke-diabetiske donorer >80 år fundet. Den gennemsnitlige tid til død til bevaring var 3,9 timer (interval: 2,0-6,4 timer). Af de 184 undersøgte øjne havde 75 (40,2%) visse AMD. Følgende kategorier blev identificeret: Unremarkable (39,7%), Questionable (11,4%), Early-Intermediate AMD (22,8%), Atrofisk (7,6%), Neovaskulær (9,8%), Andet (8,7%) og Ukendt/Ikke registreret/Ikke graduerbar (<1%). Figur 2, figur 3, figur 4 og figur 5 viser multiskala, multimodal ex vivo-billeddannelse af usædvanligt velbevarede øjne fra denne serie. Øjnene blev gennemgået i samarbejde med en øjenlæge med speciale i retinal sygdom (J.A.K.). Mens nogle øjne viste individuelle træk bedre end andre, blev disse sager valgt for allround høj kvalitet.
Som beskrevet38 adskiller ex vivo-farvefotografering sig fra den tilsvarende in vivo-fotografering . Nethindeødem og / eller løsrivelse kan reducere synligheden af det bageste pigmenterede væv. Observationer i friske øjne indikerer, at disse ændringer forekommer post mortem og ikke forværres markant med hurtig fiksering. Derudover tømmes koroidale kar efter døden. På grund af en bølgende baggrund af blege kar og mørkt interstitiel væv bør vurderingen af pigmentvariationer i RPE-planet understøttes af andre modaliteter end farve. I ex vivo OCT er der flere oplysninger tilgængelige end i farvefotografering. Ex vivo OLT adskiller sig også væsentligt fra in vivo OLT. De største forskelle omfatter den samlede øgede reflektivitet af væv, især i den indre nethinden, den konsekvente reflektivitet af nogle bånd (nervefiberlag, indre og ydre plexiformlag, RPE), den lavere synlighed af choroiddetaljerne, især under den edematøse nethinde, og synligheden af vævslagsafdelinger (se nedenfor). De ydre retinale hyperreflekterende bånd, der involverer fotoreceptorer og RPE (ellipsoid zone, EZ; interdigitation zone, IZ), er inkonsekvent synlige ex vivo og bruges ikke som vartegn i denne sammenhæng. Den kliniske konsensus for spektraldomæne OCT bruger udtrykket RPE-Bruchs membranbånd (BrM). Imidlertid foretrækkes udtrykket RPE-basal lamina (BL)-BrM-bånd, fordi det rummer udseendet af basale laminære aflejringer i AMD24.
Figur 2 viser en umærkelig macula og hyporeflekterende store koroidale kar med et reflekterende RPE-BL-BrM-bånd mellem de to. Et stort kar i den indre nethinden kaster en skygge på de bageste lag. IPL og OPL er moderat reflekterende. I NIR SLOO er både retinale og choroidale vaskulaturer synlige. Den rødfri reflektans SLO fungerer bedst for funktioner i den indre nethinden og vitreoretinale grænseflader som de bueformede fibre og det papillomakulære bundt af NFL. I normale øjne viser 488 nm autofluorescens SLO et område med samlet reduceret signal i den centrale macula på grund af fortykket parafovea og i nogle tilfælde absorption af det gule xanthophyll pigment samt hyperautofluorescensforing af de store retinale kar, hvilket tyder på bindevævskeder. Autofluorescensen ved 787 nm viser et lille område med øget signal i den centrale makula, et signal i choroidal stroma, og hypoautofluorescerende striber svarende til de choroidale kar.
Figur 3 viser en macula med tidlig mellemliggende AMD. De synlige træk omfatter en blød drusen (kuppelformet RPE-højde nær fovea), SDD'er (intermitterende reflektionsevne med et dentatudseende internt i RPE-BL-BrM-båndet), hyperreflekterende foci (HRF, reflekterende materiale med samme reflektionsevne som RPE i laget, placeret i nethinden) og vitelliform ændring (en indadgående udvidelse af RPE-organellerne, både intracellulære og ekstracellulære, i forbindelse med basale laminære aflejringer39). Farvefotografiet viser stærk pigmentering svarende til vitelliformlæsionen, omgivet af reduceret pigmentering. Hverken drusen eller SDD'erne er tydeligt synlige efter farve. NIR-reflektansen viser reflektionsevnen i fovea. Autofluorescensen ved 488 nm excitation viser et flettet signal i fovea. SDD'er vises lejlighedsvis på SLO-modaliteter; dette er mere sandsynligt, hvis SDD'erne er rigelige, og SDD'er ses lettest som et regelmæssigt fordelt punktmønster (se Spaide og Curcio19, figur 6). Mønsteret, der er bedre og tidsmæssigt i forhold til fovea i figur 3I , er ikke SDD, fordi det er uregelmæssigt og lokaliseret til et overfladisk brændplan. Alle ens face-modaliteter viser fine folder, der stråler ud fra fovea. I mindre velbevarede øjne kan lignende folder være store nok til at være synlige ved de laveste synsforstørrelser.
Figur 4 viser en macula med atrofisk AMD. Farvefundusfotograferingen viser cirkulære atrofiske områder, central hyperpigmentering og små hyperpigmenterede prikker i parafoveaen, der i OCT svarer til HRF på niveauet af Henle-fiberlag-ydre kernelag (HFL-ONL). Derudover kan en lav flad RPE-højde i OCT repræsentere en basal laminær aflejring, ikke-eksudativ type 1 neovaskularisering eller begge dele. Atrofi i den foveale B-scanning kan genkendes ved nedsynkning af HFL-ONL, et område med hypertransmission (lys, der skinner igennem til choroid), en vitelliform ændring med øget skygge i fovealcentret og HRF, der kaster skygger. I dette øje viser NIR-reflektansen hyperreflekterende pletter i fovea. Autofluorescensen ved 787 nm excitation viser effektivt et signal svarende til foveal hyperpigmentering og fraværet af et signal i de cirkulære atrofiske områder. Den rødfri og 488 nm autofluorescens viser de indre retinale funktioner.
Figur 5 viser en macula med makulaatrofi sekundært til neovaskulær AMD. Farvefundusfotograferingen viser sort pigmentering inden for det atrofiske område. OCT viser atrofi ved sænkning (nedsynkning) af HFL-ONL og øget hypertransmission. Den foveale B-scanning viser en høj af subfovealt hyperreflekterende materiale og intraretinale cyster. Den nær-infrarøde reflektans viser reflektionsevne i det atrofiske område på grund af tabet af RPE og koroidale kar. Et lille, intenst reflekterende område i fovea er ikke synligt på farve. Den rødfri refleksion viser retinale kar og inden for en ringformet zone koroidale kar. Autofluorescensen (488 nm) viser tydeligt en nogenlunde cirkulær atrofisk grænse og øer med begyndende atrofi. Et centralt område uden signal er omgivet af en annulus af moderat signal og synlige koroidale kar.
Figur 6 viser almindelige artefakter i ex vivo OCT-billeddannelse. Ødem kan være fremtrædende i den indre nethinde, hvilket skaber buler og folder gennem fovea (figur 6A, I). Mekanisk skade kan opstå med trækkraft på glaslegemet eller ved direkte kontakt mellem nethinden og dissekeringsværktøjerne, hvilket resulterer i forskydning af materiale og undertiden tab af dette materiale (figur 6F, G). Frigørelser kan forekomme langs flere vævsplaner og kan repræsentere relative trækkræfter mellem lagene, der også forekommer in vivo. Enhver løsrivelse kan udvides yderligere ved efterfølgende behandling. Den mest almindelige løsrivelse er retinal (dvs. mellem fotoreceptorens ydre segmenter og RPE's apikale processer) (figur 6B-D, F-I). De apikale processer kan enten løsne sig fra de ydre segmenter eller forblive hos RPE-cellelegemerne, som bestemt af histologi. Nethindeløsninger kan være store og bølgende (figur 6B, D, I) eller smalle og næppe mærkbare (figur 6C, F, G). Bacillær lagløsrivelse (BALAD40) blev først set i laboratoriet og derefter senere fundet i klinisk OCT. BALAD tilskrives en opdeling gennem myoiddelen af fotoreceptorens indre segmenter, hvilket efterlader den ellipsoide del af det indre segment og det ydre segment bundet til RPE (figur 6A, D, I). BALAD bør ikke forveksles med SDD i ex vivo OLT. Et tredje løsrivelsesplan er den indre begrænsende membran (ILM), og der er ofte resterende reflekterende væske mellem ILM og de resterende retinale lag (figur 6A, B, I). Den mindst almindelige løsrivelse er mellem choroid og sclera (figur 6C). Fovea udviser ofte cystoide rum, der ikke bør betragtes som patologiske uden understøttende beviser, såsom tegn på neovaskularisering (figur 6H). Ved enkelte B-scanninger kan bølgende RPE give indtryk af drusen. 3D-visningen af et OLT-volumen tydeliggør, at disse bevæger sig langs koroidalkarrene (figur 6E, J). Bølger kan skyldes differentielle volumenændringer mellem karrene og mellemliggende stroma efter døden og under fiksering.
For at kalibrere forventningerne til kvalitet og undersøge begrænsningerne ved ex vivo OCT sammenligner figur 7 in vivo-billeddannelse, ex vivo-billeddannelse og histologi for tre klinisk dokumenterede øjne med AMD. Disse tre øjne blev bevaret anderledes end dem i figur 2, figur 3, figur 4 og figur 5. For at bekræfte de strukturelle OCT-reflektionskilder, som er subcellulære41, blev øjnene i figur 7 bevaret i 2,5% glutaraldehyd og 1% glutaraldehyd for at muliggøre epoxyharpikshistologi med høj opløsning og korrelativ elektronmikroskopi. Glutaraldehyd tilføjer opacitet til disse prøver i forhold til dem i figur 2, figur 3, figur 4 og figur 5. Effekten af en kortere versus længere DtoP er tydelig (figur 7A-F, 2,1 timer vs. figur 7G-I, 8,9 timer). I øjet med en længere DtoP ændrede postmortem ødem retinal kontur, og ILM blev løsrevet. Patologien af interesse (ydre retinal tubulation) var subtil i ex vivo-billeddannelsen. Det blev fundet, fordi den øjesporede in vivo OCT lokaliserede den relevante B-scanning, og de koroidale kar kunne matches. I de to øjne med en kortere DtoP var nogle større patologier (type 3 makuladevaskularisering) umiddelbart tydelige (figur 7A-C). Andre blev fundet med hjælp fra øjensporing (figur 7D-F).
Figur 1: Hornhindeudskæring fra et menneskeligt donorøje til nedsænkningsfiksering af nethinden. Øverst til venstre holdes det udskårne donorøje på plads af en kappe af gasbind stabiliseret af en hæmostat; øverst til højre bruges en 18 mm trephine til at lave en cirkulær score inklusive hornhinden og en 2 mm bred rand af sclera; i midten afsluttes den scorede cirkel med et snit med fjederbelastet buet spidssaks, mens kloden stabiliseres; nederst til venstre løftes hornhinden og scleralranden og udsætter iris (blå) og ciliary krop (brunbrun); nederst i midten løftes hornhinden med fælgen helt af; Nederst til højre skæres iris vinkelret på pupilmargenen for at lette konserveringsmidlets indtrængning i glaskammeret. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Multimodal ex vivo-billeddannelse af en umærkelig makula. En macula fra en 82-årig kvindelig donor med et døds-til-konserveringsinterval på 1,97 timer. (A) Fundus på højre øje set med det forreste segment fjernet (epi-belysning). (B) Nærbillede af makulaen (epi-belysning). C) Nærbillede af fovea (epibelysning). De grønne linjer angiver placeringen af OCT B-scanningerne i panel D og E. (D,E) OCT B-scanninger gennem (D) overlegen perifovea (E) og fovea. Nethinden (R), choroid (C) med hyporeflekterende store kar og det mellemliggende hyperreflekterende RPE-BL-BrM-bånd er synlige. I dette usædvanligt velbevarede øje er den moderat reflekterende IPL og OPL også synlige. (D) Et stort kar i den indre nethinde kaster en skygge på de bageste lag. (E) Adskillelsen mellem nethinden og RPE i panel E (gul pilespids) er artefaktuel. (F) Den nær-infrarøde refleksion viser detaljerne i både retinale og choroidale vaskulaturer. (G) Den rødfri refleksion viser de bueformede fibre (venstre grøn buet pil) og det papillomakulære bundt (grøn pil) af nervefiberlaget. (H) 488 nm bølgelængde autofluorescens viser et område med samlet reduceret signal i den centrale macula på grund af en fortykket edematøs parafovea samt ringe og et punkt med lavt signal i fovealcentret og hyperautofluorescens, der forer de store retinale kar, hvilket tyder på bindevævskeder. (I) Autofluorescensen ved 787 nm viser et lille område med øget signal i den centrale makula, et signal i choroidal stroma, og hypoautofluorescerende striber svarende til choroidale kar. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3. Multimodal ex vivo-billeddannelse af et donorøje med tidlig mellemliggende AMD. Donorøje fra en 97-årig kvindelig donor med et døds-til-bevaringsinterval på 3,1 time. (A) Fundus på højre øje set med det forreste segment fjernet (epi-belysning). (B) Nærbillede af makulaen (epi-belysning). De grønne linjer angiver placeringen af OCT B-scanningerne i panelerne D, E og F. (C) Nærbillede af fovea, der viser hyperpigmentering (pil, flashbelysning). (D) En SDD i den overordnede perifovea (orange pile) ses på OCT. I Vitelliform ændring i RPE under fovea (hvide pile). (F) Ringere end fovea er en blød drusen med en hyporeflekterende linje ved bunden (gul pil) og et hyperreflekterende fokus over (lyseblå pil). (G-I) Scanningslaseroftalmoskopbillederne viser meget fine stjernefolder i fovea (ses også i C). (G) Den nær-infrarøde reflektans viser reflektionsmateriale i fovea, der delvis svarer til vitelliformmateriale. (H) Den rødfri refleksion viser nethindeoverfladen. (I) 488 nm bølgelængden autofluorescens viser et område med samlet reduceret signal i den centrale macula på grund af en let fortykket parafovea. SDD'er er ikke tydeligt synlige. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Multimodal ex vivo-billeddannelse af en komplet RPE og retinal atrofi i aldersrelateret makuladegeneration. Donorøje fra en 97-årig kvinde med et døds-til-konserveringsinterval på 2,33 timer. (A) Fundus af venstre øje set med transbelysning. (B) Nærbillede af makulaen (epi-belysning). De grønne linjer angiver placeringen af OCT B-scanningerne i panel D og E. (C) Nærbillede af fovea (epi-belysning), der viser central hyperpigmentering (grøn pilespids) og små hyperpigmenterede prikker (gule pilespidser). Den centrale prik er intens brun, fordi den overliggende nethinde er meget tynd. Prikkerne ser desaturerede ud, fordi den overliggende nethinde er tyk. Cirkulære atrofiske områder er angivet (hvide pilespidser). (D,E) OCT B-scanninger gennem (D) perifovea (E) og fovea. Nethinden (R) og tynd choroid (C) er synlige. (D) Hyperreflekterende foci (gule pilespidser) på niveauet af HFL-ONL svarer til de hyperpigmenterede prikker i C. Den lave flade RPE-højde under dem kan repræsentere en basal laminær aflejring, ikke-eksudativ type 1 neovaskularisering eller begge dele. (E) B-scanningen gennem fovea viser atrofi, der kan genkendes ved nedsynkning af HFL-ONL (rød pilespids), et område med hypertransmission, en vitelliform ændring med øget skygge i fovealcentret (grøn stjerne) og hyperreflekterende foci (blågrøn pilespids) med skygge. Det hyporeflekterende rum mellem nethinden og RPE-båndet kan repræsentere subretinal væske. (F) Den nær-infrarøde reflektans viser hyperreflekterende pletter i fovea. (G) Det rødfrie billede viser de bueformede fibre i NFL og reflekterende blomster på retinaloverfladen. (H) 488 nm autofluorescens fokuseret på nethinden viser et signal forbundet med retinale kar, intet signal forbundet med RPE og svage autofluorescerende pletter i det centrale makulaområde. (I) 787 nm autofluorescens viser et signal svarende til pigmentering i C. Cirkulære atrofiske områder er tydelige. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5: Multimodal ex vivo-billeddannelse af type 1 neovaskularisering og makulakatrofi i aldersrelateret makuladegeneration. Et donorøje fra en 86-årig kvindelig donor med et døds-til-bevaringsinterval på 3,5 timer. (A) Fundus på venstre øje set med det forreste segment fjernet (transbelysning). (B) Nærbillede af makulaen, der beskriver atrofiske grænser (gule pilespidser). De grønne linjer angiver placeringen af OCT B-scanningerne i panel D og E. (C) Nærbillede af fovea viser sort pigmentering (grønne pilespidser) inden for det atrofiske område. (D,E) OCT B-Scanninger gennem (D) perifovea (E) og fovea. Nethinden I og tynd choroid (C) er synlige. I dette usædvanligt velbevarede øje er den moderat reflekterende IPL og OPL også synlige. (D) Den perifoveale B-scanning græsser den overkant af det atrofiske område. Atrofi fremgår af sagging af HFL-ONL og øget hypertransmission (røde pilespidser). Mulige subretinale drusenoidaflejringer er angivet (fuchsia pilespidser). (E) Den foveale B-scanning viser en høj af subfovealt hyperreflekterende materiale og intraretinale cyster (stjerne). O = optisk nervehoved. (F) Den nær-infrarøde refleksion viser et reflekterende område af atrofi og koroidale kar (blågrønne pilespidser), herunder et lille intenst område i den centrale makula, (orange pilespids), der ikke er synlig ved farvebilleddannelse. (G) Den rødfri refleksion viser retinale kar og, inden for en ringformet zone, koroidale kar. (H) 488 nm autofluorescens viser en nogenlunde cirkulær atrofisk kant (gule pilespidser) og øer med begyndende atrofi. Et centralt område uden autofluorescens er omgivet af en annulus af moderat autofluorescens og synlige koroidale kar (hvide pilespidser). 787 nm autofluorescensen var ikke mulig i dette øje. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 6: Almindelige artefakter set i ex vivo OCT-billeddannelse af donorøjne. Disse øjne kommer fra 2016-2017 serien af øjne. De fleste nethinden er hyperreflekterende i forhold til nethinden afbildet in vivo, og de indre retinale lag er mere reflekterende end de ydre retinale lag. Bacillær løsrivelse (gule pilespidser i panelerne A, D, G og I) defineres som en opdeling på niveauet af fotoreceptorens indre segment myoid, hvilket skaber et karakteristisk intraretinalt hulrum40. Nethindeløsning (grønne pilespidser i panelerne B, C, D, F, G og I) beskriver en adskillelse af hele den neurosensoriske nethinden fra den underliggende RPE42. Løsrivelser af den indre begrænsende membran (ILM) adskiller ILM og nervefiberlaget (røde pilespidser i panelerne A, B og I). En choroidal løsrivelse (blå pilespids i panel C) er en adskillelse inden i choroid eller mellem choroid og sclera. Mekanisk skade (lilla pil i panelerne F og G) kan forekomme på ethvert niveau og med alle dimensioner, som det gælder manglende materiale (grøn pil i panel G) og forskudt materiale (gul pil i panel G). Nethindeødem (lilla stjerner i panelerne A og I) fremstår som en fortykkelse af nethindevævet med dårligt definerede grænser mellem de separate retinale lag. En bølgende RPE (blå pile i panelerne E og J) vises som et ujævnt, bølget RPE-lag. Cystoide læsioner (rød firkant i panel H) korrelerer med hyporeflekterende kammerlignende ændringer i nethindevævet, almindeligvis i fovea. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 7: Ex vivo synlighed af patologien set in vivo afhængig af bevaringskvaliteten. (En-Jeg) Paneler En, Bog CPaneler D, Eog Fog paneler G, Hog Jeg repræsenterer tre klinisk dokumenterede øjne fra to donorer, hver set ved eye-tracking in vivo (En1-En2,D1-D2,G1-G2) og ex vivo (B1-B2,E1-E2,H1-H2) billeddannelse efterfulgt af histologi (C,F,Jeg). De grønne linjer på den nær-infrarøde refleksion (NIR, En1,B1,D1,E1,G1,H1) repræsenterer niveauerne af optisk kohærenstomografi (OCT), B-scanninger og panoramisk histologi. Paneler En, Bog C og paneler D, Eog F, viser henholdsvis højre og venstre øje for en kvindelig donor i 90'erne. Paneler G, Hog Jeg vise højre øje på en anden kvindelig donor, også i 90'erne. (En-C) Velbevaret okulært væv (DtoP: 2,1 h) muliggør god synlighed af den vigtigste patologi. (En) En hyperreflekterende intraretinal makula neovaskularisering (type 3 MNV, grøn pilespids) er omgivet af intraretinal væske 17 måneder før døden (En2). RPE/Bruchs membrankompleks er opdelt af hyporeflekterende materiale og fremstår som et "dobbeltlagstegn" (En2). Til venstre er et andet dobbeltlagsskilt med stregkodehypertransmission ind i choroid (orange pilespids). På ex vivo OLT (B2), er type 3 MNV og stregkodehypertransmission tydeligt synlige og afgrænsede. Nethinden er kunstigt løsrevet, som vist af den hvide pilespids. Den panoramiske histologi viser en lodret orienteret type 3 MNV læsion (grøn pilespids, C1). Se tidligere forskning43,44 for nærmere oplysninger om den oprindelige sag. (D-F) Velbevaret okulært væv (DtoP: 2,1 h) kan resultere i gennemsigtighed, der er reduceret, men stadig tilstrækkelig til at detektere større patologi. OLT (D2) viser en stak intraretinale hyperreflekterende foci (HRF, fuchsia pilespids) i et øje efterfulgt af ekssudativ type 3 MNV. Ingen intraretinale cyster er synlige 11 måneder før døden. På ex vivo OLT (E2), er stakken af HRF komprimeret lodret (fuchsia pilespids), men klart afgrænset. På panoramisk histologi (F1), stiger et retinalt pigmentepiteltårn (fuchsia pilespids) opad fra en blød druk. (G-Jeg) Mindre velbevaret okulært væv (DtoP: 8,9 timer) resulterer i nedsat synlighed af større patologi. OCT indikerer en ydre retinal tubulation (ORT, gul pilespids) 48 måneder før døden (G2). På ex vivo OLT, fremstår ORT som en subtil forstyrrelse, og dette ville have været vanskeligt at skelne uden forudgående viden (H2). Den indre begrænsende membran er kunstigt løsrevet (hvid pilespids). Ødem har forvrænget retinal kontur. Den histologiske analyse viser ORT-lumen afgrænset af den ydre begrænsende membran og fotoreceptorerne, der stikker ud i den (Jeg1). Se tidligere forskning26,45 for nærmere oplysninger om den oprindelige sag. Klik her for at se en større version af denne figur.
| Spillernumre | Procenter | |||||
| Diagnostisk kategori | Højre øjne | Venstre øjne | Total | Højre øjne | Venstre øjne | Total |
| Banale | 39 | 34 | 73 | 41.50% | 37.80% | 39.70% |
| Tvivlsom AMD | 10 | 11 | 21 | 10.60% | 12.20% | 11.40% |
| Tidlig AMD | 20 | 22 | 42 | 21.30% | 24.40% | 22.80% |
| Atrofisk AMD | 6 | 8 | 14 | 6.40% | 8.90% | 7.60% |
| Neovaskulær AMD | 11 | 7 | 18 | 11.70% | 7.80% | 9.80% |
| Anden | 7 | 8 | 15 | 7.40% | 8.90% | 8.20% |
| Ukendt | 0 | 0 | 0 | 0.00% | 0.00% | 0.00% |
| Ikke registreret | 1 | 0 | 1 | 1.10% | 0.00% | 0.50% |
| Total | 94 | 90 | 184 | 100.00% | 100.00% | 100.00% |
| Visse AMD | 37 | 37 | 75 | 39.40% | 41.10% | 40.20% |
| Mulig AMD | 47 | 48 | 95 | 50.00% | 53.30% | 51.60% |
| Eyes blev tiltrådt i perioden 6/17/16 - 9/14/17. Kriterier: ≥ 80 år, hvid, ikke-diabetiker, ≤6 timer død-til-konservering. Mål: 184 øjne (180 øjne af 90 donorer, bevaret; 4 øjne af 4 donorer, bevaret) Død-til-bevaringstid (gennemsnit, maksimum, minimum): 3,9 timer, 6,4 timer, 2,0 timer | ||||||
Tabel 1: Genopretning af donorøjne fra 2016-2017.
Supplerende materiale 1: Oversigt over dissektionen, farvefundusfotografering og OCT-baseret multimodal billeddannelse. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende materiale 2: Nærmere oplysninger om OLT-baseret multimodal billeddannelse til illustration af trinnene i afsnit 5-8. Klik her for at downloade denne fil.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ved hjælp af en befolkningsbaseret screeningstilgang i en 16 måneders periode i præ-COVID-æraen var det muligt at skaffe 75 donorøjne med AMD. Alle blev genoprettet med en kort DtoP og iscenesat ved hjælp af OCT-forankret MMI. Alderskriteriet (>80 år) ligger uden for det typiske aldersinterval for vævsudtagning beregnet til transplanterelige hornhinder. På trods af den fremskredne alder resulterede vores kriterier i øjne på alle stadier af AMD. Mange RPE-fænotyper er fælles for alle AMD-stadier, og nogle er eksklusive for neovaskulær AMD 3,46. Den direkte sammenligning af ex vivo- og in vivo-billeddannelse (figur 7) bekræftede, at kort DtoP sammen med eksperthåndtering (figur 1) er en kritisk faktor til fremstilling af ex vivo-billeder af den ydre nethinde, der er tilstrækkelige til diagnostisk klassificering på øverste niveau, og nogle af disse prøver var egnede til direkte korrelationer mellem billeddannelse og histologi4,35, 47. Ikke al patologi er synlig ex vivo. Imidlertid er langt mere synligt, når du bruger OCT sammenlignet med farvefotograferingsbaserede metoder10, især dem, der involverer adskillelse af nethinden fra RPE / choroid27. Endvidere retter øjensporing fra klinisk OCT opmærksomheden mod fokale og undertiden små funktioner (figur 7).
Dette konserveringssystem involverer typiske øjenbankprocedurer og værktøjer til fjernelse af hornhinden, efterfulgt af nedsænkning af et åbnet øje i et konserveringsmiddel, der leveres på forhånd. På denne måde kan øjenbankens personale genvinde forskningsvæv kontinuerligt (24/7). Sidstnævnte egenskab er kritisk, da væv bestemt til øjeblikkelige komplekse dissektioner27,32 kræver døgnet rundt bemanding af enten efterforskerne, øjenbanken eller begge. Andre stabilisatorer, der muliggør vævsgendannelse til enhver tid efterfulgt af specialiseret dissektion og ekstraktioner i arbejdstiden, såsom PAXgene Tissue System og Hibernate-A, kan være nyttige i fremtiden, hvis disse er kompatible med OCT-billeddannelse.
Denne tilgang giver nethinder, der stort set forbliver knyttet til RPE og dermed er i stand til at generere data, der kan oversættes til OCT-billeddannelse. Præcis lokalisering er afgørende, fordi makulaen er lille (<3% af nethindeområdet). Endvidere er aflejringsdrevet AMD-progression i overensstemmelse med topografien af kegler og stænger48, og de tidligste indsættende og mest vedvarende visuelle defekter forekommer på et bestemt sted (dvs. den stangholdige parafovea ved siden af fovea-keglen)49. Til sammenligning med OCT er immunhistokemi med kolorimetriske farvestoffer kompatibel med omfattende mikroskopi (f.eks. Bright-field) for at tage højde for alle vævselementerne, både mærkede og umærkede4. Ikke-målrettede molekylære assays baseret på prøveudtagningsarrays kan udnytte den vandrette justering af vertikalt opdelte fotoreceptorer og RPE for effektivt at øge opløsningen. Billeddannelse af massespektrometri med ioniserende laserpulser på 8 μm i diameter og 10-15 μm fra hinanden kan lokalisere snesevis af lipider til subcellulære rum i de ydre retinale celler50. Rumligt opløst transkriptomik bruger et forudbestemt sæt stregkodede revers transkriptionsprimere på glasglas, hvorpå vævssektioner påføres51. Denne teknologi er i øjeblikket begrænset til opsamling med en diameter på 55 μm og en afstand på 100 μm. Der forventes forbedringer i opløsningen, der ville gøre denne teknologi egnet til AMD-forskning.
Denne protokol har begrænsninger. Gendannelseskriteriet udelader diagnoser af diabetes (30% blandt Medicare-modtagere i Alabama)52 på grund af betydningen af choroid i begge sygdomme. Denne udelukkelse reducerer den samlede donorpulje og forlænger den tid, der er nødvendig for at indsamle nok øjne til en undersøgelse. Af historiske årsager udelod kriterierne for 2016-2017 sorte donorer, som nu repræsenterer 14% af de statslige øjendonorer, og sorte donorer er nu inkluderet i nuværende potentielle projekter. Forhåndsdirektivets register for personer, der ønsker at være øjendonorer, er omfattende, men omfatter endnu ikke praktisk registrering hos lokale nethindespecialer, der plejer AMD-patienter; Dette projekt er i øjeblikket under udvikling. Under en befolkningsbaseret skærm som denne vises øjne med tilstande, der overlapper fænotype med AMD, og skal genkendes i samråd med den udviklende kliniske litteratur og en øjenlæge med speciale i nethindesygdomme. For eksempel omfattede denne serie af øjne nevi med drusen53 og en linje af RPE-forstyrrelse over et pachyvessel (et tykt kar i den indre choroid)54. Endelig blev tidlig og mellemliggende AMD kombineret på grund af manglen på et OCT-baseret klassificeringssystem for AMD, som er under udvikling af klassificeringen af atrofimødegruppe55. Ikke desto mindre tillader optimeringen af vævsgendannelse og OCT-baseret karakterisering, at AMD-forskning med fokus på at udnytte tidselementet i øjensporet OCT-forankret MMI kan planlægges, drives, planlægges og budgetteres i finansieringsansøgninger.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
C.A.C. modtager forskningsstøtte fra Heidelberg Engineering og rådgiver for Apellis, Astellas, Boehringer Ingelheim, Character Bioscience og Osanni. T.A. modtager forskningsstøtte fra Novartis og rådgiver Roche, Novartis, Bayer, Nidek og Apellis. K.B.F. er konsulent for Genentech, Zeiss, Heidelberg Engineering, Allergan, Bayer og Novartis.
Acknowledgments
Vi takker Heidelberg Engineering for instrumenteringen og designet af den originale øjenholder, Richard F. Spaide MD for introduktionen til OCT-baseret multimodal billeddannelse, Christopher Girkin MD for at lette adgangen til kliniske billeddannelsesenheder og David Fisher for figur 1. Genopretningen af de menneskelige donorøjne til forskning blev støttet af National Institutes of Health (NIH) tilskud R01EY06019 (CAC), P30 EY003039 (Pittler), R01EY015520 (Smith), R01EY027948 (CAC, TA) R01EY030192 (Li), R01EY031209 (Stambolian) og U54EY032442 (Spraggins), IZKF Würzburg (N-304, T.A.), EyeSight Foundation of Alabama, International Retinal Research Foundation (CAC), Arnold og Mabel Beckman Initiative for Macular Research (CAC) og forskning til forebyggelse af blindhed AMD Catalyst (Schey).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Beakers, 250 mL | Fisher | # 02-540K | |
| Bottles, 1 L, Pyrex | Fisher | # 10-462-719 | storage for preservative |
| Bunsen burner or heat source | Eisco | # 17-12-818 | To melt wax |
| Camera, digital | Nikon D7200 | D7200 | |
| Computer and storage | Apple | iMac Pro; 14 TB external hard drive | Image storage |
| Container, insulated | Fisher | # 02-591-45 | For wet ice |
| Containers, 2 per donor, 40 mL | Fisher | Sameco Bio-Tite 40 mL # 13-711-86 | For preservative |
| Crucible, quartz 30 mL | Fisher | # 08-072D | Hold globe for photography |
| Cylinder, graduate, 250 mL | Fisher | # 08-549G | |
| Disinfectant cleaning supplies | https://www.cardinalhealth.com/en/product-solutions/medical/infection-control/antiseptics.html | ||
| Eye holder with lens and mounting bracket | contact J. Messinger | jeffreymessinger@uabmc.edu | custom modification of Heidelberg Engineering original design |
| Face Protection Masks | Fisher | # 19-910-667 | |
| Forceps, Harmon Fix | Roboz | # RS-8247 | |
| Forceps, Micro Adson | Roboz | # RS-5232 | |
| Forceps, Tissue | Roboz | # RS-5172 | |
| Glass petri dish, Kimax | Fisher | # 23064 | |
| Gloves Diamond Grip | Fisher | # MF-300 | |
| Gowns GenPro | Fisher | # 19-166-116 | |
| Image editing software | Adobe | Photoshop 2021, Creative Suite | |
| KimWipes | Fisher | # 06-666 | |
| Lamps, 3 goosenecks | Schott Imaging | # A20800 | |
| Microscope, stereo | Nikon | SMZ 1000 | for dissection |
| Microscope, stereo | Olympus | SZX9 | color fundus photography |
| Paraformaldehyde, 20% | EMS | # 15713-S | for preservative; dilute for storage |
| pH meter | Fisher | # 01-913-806 | |
| Phosphate buffer, Sorenson’s, 0.2 M pH 7.2 | EMS | # 11600-10 | |
| Ring flash | B & H Photo Video | Sigma EM-140 DG | |
| Ruby bead, 1 mm diameter | Meller Optics | # MRB10MD | |
| Safety Glasses 3M | Fisher | # 19-070-940 | |
| Scanning laser ophthalmoscope | Heidelberg Engineering | HRA2 | |
| Scissors, curved spring | Roboz | # RS-5681 | |
| Sharps container | Fisher | # 1482763 | |
| Shutter cord, remote | Nikon | MC-DC2 | |
| Spectral Domain OCT device | Heidelberg Engineering | Spectralis HRA&OCT | https://www.heidelbergengineering.com/media/e-learning/Totara-US/files/pdf-tutorials/2238-003_Spectralis-Training-Guide.pdf |
| Stainless steel ball bearing, 25.4 mm diameter | McMaster-Carr | # 9529K31 | |
| Tissue marking dye, black | Cancer Diagnostics Inc | # 0727-1 | |
| Tissue slicer blades | Thomas Scientific | # 6767C18 | |
| Trephine, 18-mm diameter | Stratis Healthcare | # 6718L | |
| TV monitor (HDMI) and cord for digital camera | B&H Photo Video | BH # COHD18G6PROB | for live viewing and remote camera display features |
| Wax, pink dental | EMS | # 72670 | |
| Wooden applicators | Puritan | # 807-12 |
References
- Spaide, R. F., et al. Consensus nomenclature for reporting neovascular age-related macular degeneration data: Consensus on neovascular age-related macular degeneration nomenclature study group. Ophthalmology. 127 (5), 616-636 (2020).
- Spaide, R. F., Ooto, S., Curcio, C. A. Subretinal drusenoid deposits a.k.a. pseudodrusen. Survey of Ophthalmology. 63 (6), 782-815 (2018).
- Curcio, C. A., Zanzottera, E. C., Ach, T., Balaratnasingam, C., Freund, K. B. Activated retinal pigment epithelium, an optical coherence tomography biomarker for progression in age-related macular degeneration. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 58 (6), 211-226 (2017).
- Cao, D., et al. Hyperreflective foci, OCT progression indicators in age-related macular degeneration, include transdifferentiated retinal pigment epithelium. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 62 (10), 34 (2021).
- Zanzottera, E. C., et al. Visualizing retinal pigment epithelium phenotypes in the transition to geographic atrophy in age-related macular degeneration. Retina. 36, S12-S25 (2016).
- Edwards, M. M., et al. Subretinal glial membranes in eyes with geographic atrophy. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 58 (3), 1352-1367 (2017).
- Zhang, Z., Shen, M. M., Fu, Y. Combination of AIBP, apoA-I, and aflibercept overcomes anti-VEGF resistance in neovascular AMD by inhibiting arteriolar choroidal neovascularization. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 63 (12), 2 (2022).
- Jiang, M., et al. Microtubule motors transport phagosomes in the RPE, and lack of KLC1 leads to AMD-like pathogenesis. Journal of Cell Biology. 210 (4), 595-611 (2015).
- Collin, G. B., et al. Disruption of murine Adamtsl4 results in zonular fiber detachment from the lens and in retinal pigment epithelium dedifferentiation. Human Molecular Genetics. 24 (24), 6958-6974 (2015).
- Curcio, C. A., Medeiros, N. E., Millican, C. L. The Alabama Age-related Macular Degeneration Grading System for donor eyes. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 39 (7), 1085-1096 (1998).
- Bastek, J. V., Siegel, E. B., Straatsma, B. R., Foos, R. Y. Chorioretinal juncture. Pigmentary patterns of the peripheral fundus. Ophthalmology. 89 (12), 1455-1463 (1982).
- Lewis, H., Straatsma, B. R., Foos, R. Y., Lightfoot, D. O.
- Lewis, H., Straatsma, B. R., Foos, R. Y. Chorioretinal juncture. Multiple extramacular drusen. Ophthalmology. 93 (8), 1098-1112 (1986).
- Sarks, J. P., Sarks, S. H., Killingsworth, M. C. Evolution of geographic atrophy of the retinal pigment epithelium. Eye. 2 (5), 552-577 (1988).
- Sarks, J. P., Sarks, S. H., Killingsworth, M. C. Evolution of soft drusen in age-related macular degeneration. Eye. 8 (3), 269-283 (1994).
- Ghazi, N. G., Dibernardo, C., Ying, H. S., Mori, K., Gehlbach, P. L. Optical coherence tomography of enucleated human eye specimens with histological correlation: Origin of the outer "red line". American Journal of Ophthalmology. 141 (4), 719-726 (2006).
- Brown, N. H., et al. Developing SDOCT to assess donor human eyes prior to tissue sectioning for research. Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 247 (8), 1069-1080 (2009).
- Helb, H. M., et al. Clinical evaluation of simultaneous confocal scanning laser ophthalmoscopy imaging combined with high-resolution, spectral-domain optical coherence tomography. Acta Ophthalmologica. 88 (8), 842-849 (2010).
- Spaide, R. F., Curcio, C. A. Drusen characterization with multimodal imaging. Retina. 30 (9), 1441-1454 (2010).
- Naghavi, M., et al. From vulnerable plaque to vulnerable patient: a call for new definitions and risk assessment strategies: Part 1. Circulation. 108 (14), 1664-1672 (2003).
- Garcia-Garcia, H. M., Gonzalo, N., Regar, E., Serruys, P. W. Virtual histology and optical coherence tomography: from research to a broad clinical application. Heart. 95 (16), 1362-1374 (2009).
- Strouthidis, N. G., et al. Comparison of clinical and spectral domain optical coherence tomography optic disc margin anatomy. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 50 (10), 4709-4718 (2009).
- Sarks, S. H. Ageing and degeneration in the macular region: A clinico-pathological study. British Journal of Ophthalmology. 60 (5), 324-341 (1976).
- Sura, A. A., et al. Measuring the contributions of basal laminar deposit and Bruch's membrane in age-related macular degeneration. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 61 (13), 19 (2020).
- Chen, L., Messinger, J. D., Kar, D., Duncan, J. L., Curcio, C. A. Biometrics, impact, and significance of basal linear deposit and subretinal drusenoid deposit in age-related macular degeneration. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 62 (1), 33 (2021).
- Litts, K. M., et al. Clinicopathological correlation of outer retinal tubulation in age-related macular degeneration. JAMA Ophthalmology. 133 (5), 609-612 (2015).
- Olsen, T. W., Feng, X. The Minnesota grading system of eye bank eyes for age-related macular degeneration. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 45 (12), 4484-4490 (2004).
- Mano, F., Sprehe, N., Olsen, T. W. Association of drusen phenotype in age-related macular degeneration from human eye-bank eyes to disease stage and cause of death. Ophthalmology Retina. 5 (8), 743-749 (2021).
- Age-related eye disease study research group. The Age-Related Eye Disease Study system for classifying age-related macular degeneration from stereoscopic color fundus photographs: The Age-Related Eye Disease Study Report Number 6. American Journal of Ophthalmology. 132 (5), 668-681 (2001).
- Arnold, J. J., Sarks, S. H., Killingsworth, M. C., Sarks, J. P. Reticular pseudodrusen. A risk factor in age-related maculopathy. Retina. 15 (3), 183-191 (1995).
- Olsen, T. W., Bottini, A. R., Mendoza, P., Grossniklausk, H. E. The age-related macular degeneration complex: linking epidemiology and histopathology using the Minnesota grading system (the inaugural Frederick C. Blodi Lecture). Transactions of the American Ophthalmological Society. 113, (2015).
- Owen, L. A., et al. The Utah protocol for postmortem eye phenotyping and molecular biochemical analysis. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 60 (4), 1204-1212 (2019).
- Wang, J. J., et al. Ten-year incidence and progression of age-related maculopathy: The Blue Mountains Eye Study. Ophthalmology. 114 (1), 92-98 (2007).
- Joachim, N., Mitchell, P., Burlutsky, G., Kifley, A., Wang, J. J. The incidence and progression of age-related macular degeneration over 15 years: The Blue Mountains Eye Study. Ophthalmology. 122 (12), 2482-2489 (2015).
- Pang, C., Messinger, J. D., Zanzottera, E. C., Freund, K. B., Curcio, C. A. The onion sign in neovascular age-related macular degeneration represents cholesterol crystals. Ophthalmology. 122 (11), 2316-2326 (2015).
- Keilhauer, C. N., Delori, F. C. Near-infrared autofluorescence imaging of the fundus: Visualization of ocular melanin. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 47 (8), 3556-3564 (2006).
- Curcio, C. A., Saunders, P. L., Younger, P. W., Malek, G. Peripapillary chorioretinal atrophy: Bruch's membrane changes and photoreceptor loss. Ophthalmology. 107 (2), 334-343 (2000).
- Curcio, C. A. Imaging maculopathy in the post-mortem human retina. Vision Research. 45 (28), 3496-3503 (2005).
- Brinkmann, M., et al. Histology and clinical lifecycle of acquired vitelliform lesion, a pathway to advanced age-related macular degeneration. American Journal of Ophthalmology. 240, 99-114 (2022).
- Ramtohul, P., et al. Bacillary layer detachment: Multimodal imaging and histologic evidence of a novel optical coherence tomography terminology. Literature review and proposed theory. Retina. 41 (11), 2193-2207 (2021).
- Wilson, J. D., Foster, T. H. Mie theory interpretations of light scattering from intact cells. Optics Letters. 30 (18), 2442-2444 (2005).
- Ghazi, N. G., Green, W. R. Pathology and pathogenesis of retinal detachment. Eye. 16 (4), 411-421 (2002).
- Berlin, A., et al. Correlation of optical coherence tomography angiography of type 3 macular neovascularization with corresponding histology. JAMA Ophthalmology. 140 (6), 628-633 (2022).
- Berlin, A., et al. Histology of type 3 macular neovascularization and microvascular anomalies in anti-VEGF treated age-related macular degeneration. Ophthalmology Science. 3 (3), 100280 (2023).
- Schaal, K. B., et al. Outer retinal tubulation in advanced age-related macular degeneration: optical coherence tomographic findings correspond to histology. Retina. 35 (7), 1339-1350 (2015).
- Chen, L., et al. Histology and clinical imaging lifecycle of black pigment in fibrosis secondary to neovascular age-related macular degeneration. Experimental Eye Research. 214, 108882 (2022).
- Balaratnasingam, C., et al. Histologic and optical coherence tomographic correlations in drusenoid pigment epithelium detachment in age-related macular degeneration. Ophthalmology. 124 (1), 644-656 (2017).
- Curcio, C. A., et al. Subretinal drusenoid deposits in non-neovascular age-related macular degeneration: Morphology, prevalence, topography, and biogenesis model. Retina. 33 (2), 265-276 (2013).
- Owsley, C., et al. Biologically guided optimization of test target location for rod-mediated dark adaptation in age-related macular degeneration: ALSTAR2 baseline. Ophthalmology Science. 3 (2), 100274 (2023).
- Anderson, D. M. G., et al. The molecular landscape of the human retina and supporting tissues by high resolution imaging mass spectrometry. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 31 (12), 2426-2436 (2020).
- Lee, J., Yoo, M., Choi, J. Recent advances in spatially resolved transcriptomics: challenges and opportunities. BMB Reports. 55 (3), 113-124 (2022).
- Diabetes. Alabama Public Health. , Available from: https://www.alabamapublichealth.gov/healthrankings/diabetes.html (2022).
- Francis, J. H., et al. Swept-source optical coherence tomography features of choroidal nevi. American Journal of Ophthalmology. 159 (1), 169-176 (2015).
- Inoue, M., Dansingani, K. K., Freund, K. B. Progression of age-related macular degeneration overlying a large choroidal vessel. Retina Cases Brief Reports. 10 (1), 22-25 (2016).
- Jaffe, G. J., et al. Imaging features associated with progression to geographic atrophy in age-related macular degeneration: CAM Report 5. Ophthalmology Retina. 5 (9), 855-867 (2021).
