Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Eks Vivo OCT-basert multimodal avbildning av menneskelige donorøyne for forskning på aldersrelatert makuladegenerasjon

Published: May 26, 2023 doi: 10.3791/65240
Automatic Translation
1, 2, 1, 1, 3,4, 5, *6, *1
1Department of Ophthalmology and Visual Sciences, University of Alabama at Birmingham Heersink School of Medicine, 2Department of Ophthalmology, University Hospital of Zurich, 3Vitreous Retina Macula Consultants of New York, 4Department of Ophthalmology, New York University Grossman School of Medicine, 5Advancing Sight Network, 6Department of Ophthalmology, University Hospital Bonn
* These authors contributed equally

Summary

Laboratorieanalyser kan utnytte prognostisk verdi fra den langsgående optiske koherenstomografien (OCT) -basert multimodal avbildning av aldersrelatert makuladegenerasjon (AMD). Menneskelige donorøyne med og uten AMD avbildes ved hjelp av OCT, farge, nær-infrarød refleksjonsskanning, laseroftalmoskopi og autofluorescens ved to eksitasjonsbølgelengder før vevsseksjonering.

Abstract

En progresjonssekvens for aldersrelatert makuladegenerasjon (AMD) lært fra optisk koherenstomografi (OCT) -basert multimodal (MMI) klinisk bildebehandling kan legge til prognostisk verdi for laboratoriefunn. I dette arbeidet ble ex vivo OCT og MMI påført humane donorøyne før retinal vevsseksjonering. Øynene ble gjenfunnet fra ikke-diabetiske hvite donorer i alderen ≥80 år, med en død-til-bevaringstid (DtoP) på ≤6 timer. Kulene ble gjenfunnet på stedet, skåret med en 18 mm trefin for å lette fjerning av hornhinnen, og nedsenket i bufret 4% paraformaldehyd. Fargefundusbilder ble anskaffet etter fjerning av fremre segment med dissekeringsomfang og et speilreflekskamera med trans-, epi- og blitsbelysning ved tre forstørrelser. Globusene ble plassert i en buffer i et spesialdesignet kammer med en 60 diopterlinse. De ble avbildet med spektraldomenet OCT (30° makula-kube, 30 μm avstand, gjennomsnitt = 25), nær-infrarød refleksjon, 488 nm autofluorescens og 787 nm autofluorescens. AMD-øynene viste en forandring i retinalpigmentepitelet (RPE), med drusen eller subretinale drusenoidavleiringer (SDD), med eller uten neovaskularisering, og uten tegn på andre årsaker. Mellom juni 2016 og september 2017 ble 94 høyre øyne og 90 venstre øyne gjenfunnet (DtoP: 3,9 ± 1,0 timer). Av de 184 øynene hadde 40,2% AMD, inkludert tidlig mellomliggende (22,8%), atrofisk (7,6%) og neovaskulær (9,8%) AMD, og 39,7% hadde unremarkable makulaer. Drusen, SDD, hyperreflekterende foci, atrofi og fibrovaskulære arr ble identifisert ved hjelp av OCT. Artefakter inkluderte vevsopasifisering, løsrivelser (bacillary, retinal, RPE, choroidal), foveal cystisk forandring, en bølgende RPE og mekanisk skade. For å veilede kryoseksjoneringen ble OCT-volumer brukt til å finne fovea og synsnervehodelandemerker og spesifikke patologier. Ex vivo-volumene ble registrert med in vivo-volumene ved å velge referansefunksjon for øyesporing. Ex vivo-synligheten av patologien sett in vivo avhenger av bevaringskvaliteten. Innen 16 måneder ble 75 raske DtoP-donorøyne i alle stadier av AMD gjenvunnet og iscenesatt ved hjelp av kliniske MMI-metoder.

Introduction

Femten år med å håndtere neovaskulær aldersrelatert makuladegenerasjon (AMD) med anti-VEGF-terapi under veiledning av optisk koherenstomografi (OCT) har gitt ny innsikt i progresjonssekvensen og mikroarkitekturen til denne utbredte årsaken til synstap. En viktig anerkjennelse er at AMD er en tredimensjonal sykdom som involverer nevrosensorisk retina, retinal pigmentepitel (RPE) og choroid. Som et resultat av OCT-avbildning av forsøkspasienter og medøynene til behandlede klinikkpasienter, er funksjonene i patologi utover de som ses av fargefundusfotografering, en klinisk standard i flere tiår, nå anerkjent. Disse inkluderer intraretinal neovaskularisering (type 3 makulærneovaskularisering1, tidligere angiomatøs proliferasjon), subretinale drusenoidavleiringer (SDDs, også kalt retikulære pseudodrusen)2, multiple veier av RPE-skjebne3,4 og intenst gliotiske Müller-celler i atrofi 5,6.

Modellsystemer som mangler makulaer (celler og dyr) gjenskaper noen skiver av denne komplekse sykdommen 7,8,9. Ytterligere suksess i å forbedre byrden av AMD kan komme fra oppdagelsen og utforskningen av primær patologi i menneskelige øyne, forstå den unike cellulære sammensetningen av makulaen, etterfulgt av oversettelse til modellsystemer. Denne rapporten skildrer et tre tiår langt samarbeid mellom et akademisk forskningslaboratorium og en øyebank. Målene med vevskarakteriseringsmetodene beskrevet her er todelt: 1) å informere utviklende diagnostisk teknologi ved å demonstrere grunnlaget for fundusutseende og bildesignalkilder med mikroskopi, og 2) å klassifisere AMD-prøver for målrettede (immunhistokjemi) og ikke-målrettede molekylære oppdagelsesteknikker (avbildningsmassespektrometri, IMS og romlig transkriptomikk) som bevarer kjeglefovea og stavrike para- og perifovea. Slike studier kan akselerere oversettelsen til klinisk OCT, der en progresjonssekvens og longitudinell oppfølging er mulig gjennom øyesporing. Denne teknologien, som er designet for å overvåke behandlingseffekter, registrerer skanninger fra ett klinikkbesøk til det neste ved hjelp av netthinnekar. Kobling av øyesporet OCT til laboratorieresultater oppnådd med destruktive teknikker kan gi et nytt nivå av prognostisk verdi for molekylære funn.

I 1993 tok forskningslaboratoriet fargefotografier av post mortem fundus på film10. Denne innsatsen ble inspirert av den ypperlige fotomikroskopien og histologien til den humane perifere netthinnen av Foos og kolleger 11,12,13 og de omfattende AMD kliniskpatologiske korrelasjonene av Sarks et al.14,15. Fra og med 2009 ble ex vivo multimodal imaging (MMI) forankret på spektraldomenet OCT vedtatt. Denne overgangen ble inspirert av den samme innsatsen til andre 16,17 og spesielt av erkjennelsen av at så mye av ultrastrukturen beskrevet av Sarks var tilgjengelig i tre dimensjoner, over tid, i klinikken 18,19. Målet var å skaffe øyne med tilhørende makulaer i en rimelig tidsramme for veldrevne studier av fenotyper på cellenivå i netthinnen, RPE og årehinnen. Hensikten var å gå utover "per øye" -statistikk til "per lesjonstype", en standard påvirket av "sårbar plakk" -konseptene fra kardiovaskulær sykdom20,21.

Protokollen i denne rapporten gjenspeiler erfaringer med nesten 400 par donorøyne i flere bekker. I 2011-2014 ble Project MACULA-nettstedet til AMD-histopatologi opprettet, som inkluderer lagtykkelser og merknader fra 142 arkiverte prøver. Disse øynene ble bevart fra 1996-2012 i et glutaraldehyd-paraformaldehydfikseringsmiddel for høyoppløselig epoksyharpikshistologi og elektronmikroskopi. Alle fundi hadde blitt fotografert i farger da de ble mottatt og ble reimaged av OCT like før histologi. En øyeholder opprinnelig designet for optiske nervestudier22 ble brukt til å imøtekomme en 8 mm diameter i full tykkelse vevstans sentrert på fovea. OCT B-skanninger gjennom fovealsenteret og et område 2 mm superior, tilsvarende histologi på samme nivå, ble lastet opp til nettstedet, pluss et fargefundusfotografi. Valget av OCT-flyene ble diktert av fremtredenen av AMD-patologi under fovea23 og fremtredenen av SDDer i stavrike områder overlegen fovea24,25.

Fra og med 2013 var øyne avbildet med OCT-forankret MMI i løpet av livet tilgjengelige for direkte kliniskpatologiske korrelasjoner. De fleste (7 av 10 givere) involverte pasienter ved en retina-henvisningspraksis (forfatter: KBF), som tilbød et avansert direktivregister for pasienter som var interessert i å donere øynene etter døden til forskningsformål. Øynene ble gjenfunnet og bevart av den lokale øyebanken, overført til laboratoriet og tilberedt på samme måte som Project MACULA-øynene. Pre-mortem kliniske OCT-volumer ble sømløst lest i laboratoriet, og justerte dermed patologiske trekk sett i løpet av livet med funksjonene sett under mikroskopet26.

Fra og med 2014 begynte prospektiv øyeinnsamling ved screening for AMD i donorøyne uten klinisk historie, men bevart under en definert tidsbegrensning (6 timer). Til dette formål ble øyeholderen modifisert for å imøtekomme en hel klode. Dette reduserte sjansen for løsrivelse rundt kuttkantene på den tidligere brukte 8 mm stansen. Øynene ble bevart i 4% bufret paraformaldehyd for immunhistokjemi og overført til 1% neste dag for langtidslagring. I 2016-2017 (før pandemien) ble 184 øyne fra 90 givere gjenopprettet. Statistikken og bildene i denne rapporten er hentet fra denne serien. Under pandemitiden (2020 lockdowns og aftermath) fortsatte potensielle samlinger for transkriptomikk og IMS-samarbeid i redusert tempo, hovedsakelig ved hjelp av 2014-metodene.

Andre metoder for donor øye vurdering er tilgjengelige. Minnesota Grading System (MGS)27,28 er basert på AREDS kliniske system for fargefundusfotografering 29. Begrensningene i denne metoden inkluderer kombinasjonen av atrofisk og neovaskulær AMD i ett stadium av "sen AMD". Videre innebærer MGS fjerning av nevrosensorisk retina før fotodokumentasjonen av RPE-choroid. Dette trinnet fjerner SDD-er i varierende grad30,31 og fjerner den romlige korrespondansen til den ytre netthinnen og dens støttesystem. Dermed kan forsøk på å knytte metabolsk etterspørsel og signalering fra netthinnen til patologi i RPE-choroid hindres. Utah-systemet implementerte MMI ved hjelp av ex vivo fargefotografering og OCT for å kategorisere øyne bestemt for disseksjon i regioner for RNA og proteinekstraksjoner32. Selv om det er å foretrekke fremfor hele øyekoppekstraksjoner, representerer 3 mm diameterområdet med høyest risiko for AMD-progresjon33,34 bare 25% av en 6 mm diameter fovea-sentrert slag. Dermed er teknikker som kan lokalisere funn i referanse til fovea, for eksempel seriesnitting for immunhistokjemi, fordelaktige.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Det institusjonelle gjennomgangsstyret ved University of Alabama i Birmingham godkjente laboratoriestudiene, som fulgte god laboratoriepraksis og biosikkerhetsnivå 2/2+. Alle amerikanske øyebanker overholder 2006 Uniform Anatomical Gifts Act og US Food and Drug Administration. De fleste amerikanske øyebanker, inkludert Advancing Sight Network, overholder de medisinske standardene til Eye Bank Association of America.

Materialfortegnelsen viser forsyninger og utstyr. Tilleggsmateriale 1 gir en oversikt over disseksjon, fargefundusfotografi og OCT-basert MMI. Supplerende materiale 2 gir detaljer om OCT-basert MMI.

1. Kriterier for vevsoppsamling

  1. For å maksimere utbyttet av AMD-øyne i en skjerm av uokumenterte givere, sett følgende kriterier for akseptable givere: alder ≥80 år, hvit, ikke-diabetiker og ≤6 timers død til bevaring (DtoP).
    MERK: DtoP er definert som tiden mellom død og når øyet er plassert i et gitt konserveringsmiddel, enten på sykehuset eller i laboratoriet.

2. Konserveringsmedium og annet preparat (laboratorium)

  1. Lag 4% fosfatbufret paraformaldehyd fra 20% lager (kjøpt). Forbered 1 l ved å tilsette 200 ml 20% paraformaldehyd (fortynningsfaktor på 5) til 800 ml av 0,1 M Sorensons fosfatbuffer. Test og juster for å sikre at pH er 7,2, om nødvendig. Oppbevares ved 4 °C.
  2. Dispenser 30 ml med 4 % fosfatbufret paraformaldehyd i 40 ml krukker.
  3. Lager merket 40 ml beholdere med konserveringsmiddel på øyebanken, slik at vevet kan gjenvinnes når som helst og på hvilken som helst dag.
  4. For oppbevaring av bevarte øyne, lag 1% paraformaldehyd fra 4% løsningen. Forbered 1 L ved å tilsette 250 ml 4% paraformaldehyd (fortynningsfaktor 4) til 750 ml av 0,1 M Sorensons fosfatbuffer. Test og juster pH om nødvendig. Oppbevares ved 4 °C.
    1. Forbered 1 l av en 0,1 M løsning fra 0,2 M-løsningen av Sorensons fosfatbuffer, pH 7,2, ved å kombinere 500 ml destillert vann og 500 ml Sorensons buffer.
    2. Juster pH dråpe for dråpe ved bruk av 1 N saltsyre eller 1 N natriumhydroksid. Oppbevares ved 4 °C.
  5. Opprett en holder for å stabilisere øynene under disseksjon. Fyll en petriskål med tannvoks oppvarmet til væske. Når det er litt kult, gjør et halvkuleformet inntrykk i det med et stort kulelager, og frys deretter parabolen for å lette fjerningen av kulelageret.

3. Øyebank-metoder

  1. For å sikre rask gjenoppretting av forskningsvev, gjenopprette alle vevene raskt, inkludert de som er ment for transplantasjon.
  2. Motta dødshenvisninger, som loven krever, innen 1 time etter døden, og spor hver donor med et henvisningssekvensnummer som følger vevet.
  3. For å finne tilfeller med potensiell klinisk dokumentasjon, spør AMD- og øyesykdomsspesifikke spørsmål i forskningsintervjuet for donorrisikovurdering.
  4. For å minimere reisetiden, gjenopprette hele globuser (til forskjell fra bare hornhinner for transplantasjon) innenfor et kompakt område (dvs. by og tilstøtende forstadsfylke).
  5. Ta med to krukker konserveringsmiddel (bufret 4% paraformaldehyd) til decedentens sykehusrom for vevgjenoppretting (i motsetning til å vente på at kroppen skal flyttes til et likhus).
  6. Før og under gjenoppretting, kommuniser med etterforskerne for å bekrefte levering og timing.
  7. Gjenvinn globusene på sykehuset, åpne dem ved konsekvente håndteringsmetoder og senk det åpne øyet ned i konserveringsmiddel (figur 1).
    1. Hold det utskårne donorøyet på plass ved hjelp av en kappe av gasbind stabilisert av en hemostat.
    2. For å lette fjerningen av hornhinnen med en 2 mm bred kant av sclera, bruk en 18 mm diameter trefin for å score kloden.
    3. For å frigjøre hornhinnen med en tilhørende kant av sclera, kutt langs den scorede sirkelen ved hjelp av fjærbelastet saks med buede spisser mens du stabiliserer kloden med hemostatklippet gasbind.
    4. Løft hornhinnen av sclera, utsett iris og ciliary kroppen.
    5. For å lette penetrasjonen av konserveringsmiddelet i glasslegemet, lage en 2 mm lang spalt i iris vinkelrett på pupillmarginen. Legg øynene i prøveglass med 30 ml konserveringsmiddel ved 4 °C, og overfør til laboratoriet på våtis.
  8. Overfør avidentifisert donorinformasjon elektronisk fra øyebanken til forskningslaboratoriedatabasen.
    MERK: Databasen opprettholder henvisningsnummeret, øyebankens vevsnummer og laboratorie-ID-nummeret for sporing, pluss annen relevant informasjon.

4. Vevsforberedelse for ex vivo farge fundus fotografering

  1. Bruk to stereomikroskoper, ett for disseksjon og ett for fargefundusfotografering.
    MERK: For transilluminasjon for å visualisere pigmentendringer, bruk en base for mørkefeltmikroskopi.
  2. Fjern de fremre segmentrestene (iris og linse). For å stabilisere øyet under disseksjon, legg det i petriskålen fylt med voks (tilleggsmateriale 1, lysbilde 7-8). For å forhindre at ciliary kroppen og festet retina kollapser inn i glasshulen, minimer forstyrrelsen av ringen av tykk glasslegeme festet til ciliary kroppen (glasslegemet).
  3. Merk den overordnede polen for orientering. Legg globusen med forsiden ned i fatet. Finn innstikkssenene til overlegen rectus og overlegen skrå muskulatur. Bruk en applikator av tre og påfør sparsomt en merkeblekk i en 10 mm linje i en fremre til bakre retning (dvs. vinkelrett på den tendinøse innføringen av den overlegne rektusmuskelen).
  4. Før fotografering, fyll fundus med kald Sørensens fosfatbuffer.
  5. Sett inn en 1 mm rubinperle i fundus som en intern skalastang som skal vises i hvert bilde27.
  6. Få fargebilder med et speilreflekskamera montert på et stereomikroskop utstyrt med ringblits. Bruk trans-, epi- og blitsbelysning ved hver av tre standardforstørrelser for å ta bilder som er ment å markere bestemte områder (tilleggsmateriale 1, lysbilde 11): 1) fundus til ekvator, 2) bakre pol (vaskulære arkader, synsnervehode, fovea) og 3) fovea i macula lutea (gul flekk).

5. Forberedelse for ex vivo farge fundus fotografering

  1. Slå på kameraet og skjermen. Koble til fjernkontrolllukkeren, og slipp aktuatoren i HDMI-kameraet/TV-skjermen og skjermkabelen.
  2. Sett kamerainnstillingene til manuell ISO-funksjon og speillåseposisjon (låst på plass for å redusere vibrasjon).
    MERK: Se produsentens brukerhåndbok for innstillingene på kameraet som brukes. Lær fra kameradisplayet over-/undereksponeringsinnstillingene i forhold til histogrammet og eksponeringsavlesningene.
  3. Arranger to lyskilder, hver med to fleksible lysføringer plassert vinkelrett på hverandre, for belysning i de fire himmelretningene på mikroskopstadiet (tilleggsmateriale 1, side 10).
  4. Slå på epi-belysningslyskildene til full effekt.
    MERK: Det er nyttig, men ikke nødvendig å ha et svart filtdeksel rundt scenen for å begrense lys / blitsspredning for fotografen.
  5. Ved dissekeringsmikroskopet, bruk tang for å sette den bakre polen inn i en 30 ml kvartsdigel fylt med buffer. La vevet synke til bunnen. Sett inn en avstiving, for eksempel en vevssvamp, mellom øyet og veggen av smeltedigelen for å forhindre bevegelse. Sett 1 mm rubinperlen inn i bakre pol.
    MERK: Perlen kan falle inn i synsnervekoppen.
  6. Plasser forsiktig kloden i smeltedigelen på stereomikroskopstadiet, og observer den indre okulære fundus gjennom mikroskopokularene. Bruk den laveste forstørrelsen, orienter øyet ved å identifisere vevsmerket ved klokka 12, synsnervehodet (ONH) og fovea 5° under ONH. Roter øyet slik at fovea faller under en linje gjennom ONH med 5°.
    MERK: Hvis det er et høyre øye, er ONH til høyre for fovea, sett gjennom mikroskopets okularer. Hvis det er et venstre øye, er ONH til venstre for fovea.
  7. Slå på den eksterne skjermen fra kameraet. Forsikre deg om at glidebryteren for mikroskopstrålesplitter er satt til å observere gjennom fotoporten og ikke gjennom porten for okularene. Avhengig av lys- og speilbanen, vær forberedt på å rotere vevet 180 ° på scenen for riktig orientering.

6. Bildeoppkjøp ved hjelp av ex vivo farge fundus fotografering

  1. Når epibelysningen er slått på, sett forstørrelsen slik at hele 18 mm trefinsnittet opptar hele synsfeltet. Øk forstørrelsen slik at det er mulig å fokusere på bunnen av fovealgropen. Reduser forstørrelsen til forrige innstilling.
  2. Juster ISO-innstillingene i området 1,600-3,000 slik at eksponeringstidene faller i senterområdet til måleren på kameraet.
  3. Trykk på utløseren for fjernutløseren. Lytt etter at speilet låses i opp-posisjon. Trykk på utløseren igjen for eksponering.
  4. Observer bildet på skjermen, med de forhåndsinnstilte metadataene som viser rødt, grønt, blått (RGB) og et fargehistogram for riktig eksponering. Hvis eksponeringen er akseptabel, fortsett; Hvis ikke, slett deretter, evaluer parametrene på nytt og bilde på nytt.
  5. Slå av svanehalslampene for epibelysning for å markere drusen, og slå på blitsen, med en 1/4 s eksponering, en kameralukkerhastighet på 1/250 s og en ISO på 100-320. Sett blitshastigheten til standard, eller endre den under det første oppsettet av kameraet. Skaff deg et bilde, og kontroller histogrammet for riktig eksponering.
  6. Slå av blitsen og slå på lyskilden for transbelysning. Tilbakestill ISO til over 5000, og sørg for at eksponeringstiden ikke går under 1/30 s på grunn av potensiell vibrasjon i det fotografiske systemet. Skaff deg et bilde, og kontroller histogrammet for riktig eksponering.
  7. Øk forstørrelsen for å se både ONH og fovea i synsfeltet. Slå på epibelysningslampene. Sett ISO-området til 1,600-3,000. Forsikre deg om at eksponeringstidene faller i kameraets senterområde.
  8. Slå av epibelysningslampene, og slå på blitsen, med en eksponering på 1/4 s, den forhåndsinnstilte kameralukkerhastigheten satt til 1/250 s, og ISO satt til 400-800. Skaff deg et bilde, og kontroller histogrammet for riktig eksponering.
  9. Slå av blitsen, og slå på transbelysningen ved hjelp av mørkefeltbasen. Tilbakestill ISO til over 5,000. Forsikre deg om at eksponeringstiden ikke er langsommere enn 1/30 s på grunn av potensiell vibrasjon i det fotografiske systemet. Skaff deg et bilde, og se etter et riktig histogram.
  10. Slå av transilluminasjonen, og slå på epi-belysningslampene igjen.
  11. Øk forstørrelsen til den som ble brukt i trinn 6.7. Fokuser på nytt om nødvendig.
  12. Øk ISO innenfor området 3,000-6,000, og juster eksponeringstiden for å falle innenfor riktig eksponeringsområde for kameraet. Skaff deg et bilde.
    MERK: rubinperlen vises kanskje ikke lenger i synsfeltet. I så fall tar du separate bilder av perlen ved denne forstørrelsen som referanse.
  13. Slå av epibelysningslampene. Slå på blitsen med eksponering på 1/4 s og med kameraets lukkerhastighet til 1/250 s. Sett blitshastigheten til standard, eller endre den under det første oppsettet av kameraet, og sett ISO til 500-1,000. Skaff deg bildet. Kontroller histogrammet for riktig eksponering.
  14. Slå av blitsen, og slå på transbelysningslampene. Tilbakestill ISO til over 8,000 for å tillate en raskere eksponeringstid med en mer følsom bildesensor. Forsikre deg om at eksponeringstiden ikke går under 1/30 s på grunn av potensiell vibrasjon i det fotografiske systemet. Skaff deg et bilde.
  15. Eksporter bildene fra kameraet til en datamaskin. Se gjennom bildene før du fjerner prøven fra mikroskopstadiet i tilfelle noen må fanges igjen.

7. Oversikt over bildeinnsamling for ex vivo OCT og skanning av laser oftalmoskopi (SLO)

  1. For spektraldomene OCT, plasser globusene i fosfatbuffer i en tilpasset øyeholder med et kammer med en 60-diopterlinse35. Monter øyeholderen på en brakett på en klinisk OCT-bildebehandlingsenhet, og fest den til hvor en pasient vil hvile pannen. OCT-enheten setter automatisk inn en skalalinje i hvert bilde.
  2. Samtidig, ved å bruke samme enhet og med øyet fortsatt i holderen, avbilde globusene med et skanningslaseroftalmoskop (SLO) ved hjelp av nær-infrarød refleksjon (NIR, brukt som lokaliseringsbilde av inneboende programvare), 488 nm eksitasjon fundus autofluorescens (FAF) og rødfri (RF) refleksjon.
    MERK: 787 nm eksitasjons-FAF i denne enheten er bare av og til egnet fordi en strålesplitter reduserer lystransmisjonen til SLO. Av denne grunn brukes en annen enhet for 787 nm FAF-bilder (se neste punkt).
  3. Separat, men med øyet fortsatt i øyeholderen, avbilde globusene med 787 nm FAF for å oppdage RPE-forstyrrelse36 ved hjelp av en separat enhet som viser denne modaliteten godt.

8. Bildeinnsamlingsprotokoll for ex vivo OCT/ SLO (se lysbilder i tilleggsmateriale 2)

  1. Angi den overlegne rektusmuskelen med vevsmerkefargestoff. Slå på laseren (blå pil, tilleggsmateriale 2, side 1).
  2. Med henvisning til side 2 i tilleggsmateriale 2, plasser OCT-hodet ved å flytte hele enheten i to akser i forhold til basen (grønn pil) og deretter heve høyden (y) ved å dreie joysticken med urviseren/mot klokken (cw/ccw, blå piler). Fokuser bildet ved å dreie på knappen (oransje pil), med den svarte spaken i posisjon R (*). Lås enheten ved å feste tommelskruen (lilla pil).
  3. Sett øyet inn i holderen, og stabiliser fra bakre aspekt med avstandsstykker (tilleggsmateriale 1, side 13). Utøve så lite press som mulig for å unngå denting sclera. Orienter deg med vevsmerket for den overlegne rektusmuskelen vendt oppover.
    MERK: Den omtrentlige avstanden fra forsiden av øyeholderen til OCT-enheten er 25 mm.
  4. Åpne den proprietære visualiserings- og analyseprogramvaren for OCT-enheten. En pasientliste vises i venstre kolonne. Øyedonorene indeksert med et internt kodenummer er "pasientene". Se brukerhåndboken fra produsenten.
  5. Velg ikonet Ny pasient . Fyll ut pasientinformasjonen etter behov. Velg OK. Bruk et logisk ordnet nummereringssystem for individuelle øyne, for eksempel ÅÅÅYNNNL,R_agesex. Dette kan for eksempel være 2017016R_97F.
  6. Når du har fortsatt dataregistreringen i følgende vindu, trykker du OK. Velg operatør og studie fra rullegardinmenyen.
    MERK: Den angitte informasjonen vises i de eksporterbare metadataene.
  7. Etter å ha vist en tom skjerm, trykk på den gule knappen for å starte bildeoppkjøpet.
  8. Trykk på IR + OCT (nær infrarød refleksjon + OCT). La laseren få et levende SLO bilde av fundus og OCT B-scan.
    1. Fullfør riktig anatomisk posisjon basert på ONH og fovea, og bruk en applikator av tre for å justere øyeposisjonen i holderen. Drei den svarte runde knappen på kontrollpanelet for å justere intensiteten.
    2. Trykk på den samme knappen for å gjennomsnittlig 9-100 bilder (røde piler; 9 er tilstrekkelig, 100 ser kremaktig ut). Hvis enheten er riktig orientert, skal fundus være i fokus, og OCT B-skanningen skal vises i den øverste tredjedelen av displayet (tilleggsmateriale 2, side 9, dobbel rød pil).
    3. På fundusbildet bruker du markøren til å flytte den blå linjen for å sentrere fovea (tilleggsmateriale 2, side 9, hvit pil). Trykk på Hent.
      MERK: Andre standardknapper er Retina, EDI (av) og Linjeskanning.
  9. Trykk RF + OCT for neste oppkjøp. Kontroller posisjonen på nytt for å sikre at bildet ikke har beveget seg eller blitt dårligere. Trykk på den svarte knappen for gjennomsnitt. Trykk på Hent.
  10. Bytt den interne kuben for autofluorescensavbildning til eksitasjonsbølgelengdene 488 nm og 787 nm (tilleggsmateriale 2, side 10).
    MERK: Kubeposisjonen etter bryteren vises.
  11. Velg Autofluorescensmodus. Kontroller justeringen på nytt. Trykk på Hent.
  12. For mistenkte tilfeller av RPE-forstyrrelser og atrofi, velg ICGA (indocyaningrønn angiografi) for 787 nm autofluorescens. Kontroller øyeposisjonen på nytt, og trykk deretter Hent.
    MERK: Et fundusbilde vises ofte ikke i denne modaliteten fordi den indre kuben demper strålen.
  13. Bytt den interne kuben tilbake til R for IR og rød fri bildebehandling for volumopptak.
    MERK: Kubeposisjonen etter byttet vises på side 13 i tilleggsmateriale 2.
  14. Hvis du vil hente OCT-volumene , velger du IR og voluminnstillingen. Tilpass alle innstillingene på side 14 i tilleggsmateriale 2 ved å veksle de riktige knappene på kontrollmodulen (30° makula-kube, 30 μm avstand, gjennomsnittlig avhengig av eksperimentelle krav).
  15. Legg merke til at den nær-infrarøde refleksjonsfundusvisningen er dekket av blå B-skannelinjer. Kontroller OCT-posisjonen øverst i høyre vindu på nytt. Trykk på Hent på kontrollmodulen, og vent 5 minutter til volumskanningen er fullført. Når avbildningsinnsamlingen er fullført, velger du EXIT. Bildene lagres (rød pil).
    MERK: De blå linjene avgrenser avstandene som vises i forrige visning i mikrometer. Skanningene starter nummereringen fra bunnen (underordnet) og fortsetter oppover. Legg merke til den røde linjeprogresjonen.
  16. La datamaskinen behandle de oppkjøpte bildene, som vises på skjermen (tilleggsmateriale 2, side 16).
  17. Når du avbilder de andre øynene til en donor, må du ikke endre posisjonen til monteringsbraketten mellom øynene. Hvis venstre øye avbildes først, vises resultatene i OD (høyre øye) kolonne. Høyreklikk for å merke alle bildene, og velg deretter Exchange OS/OD. Bildene vil skifte til OS-kolonnen.
  18. Trykk Velg > vindu > database. Skjermen bruker panel 6 som standard med tillegg av donorøyet avbildet i høyre kolonne (tilleggsmateriale 2, side 18). Høyreklikk på pasienten i rullegardinmenyen, velg Batch, og eksporter E2E-filen.
  19. Bla til den forhåndsbestemte mappen som er opprettet på skrivebordet for filoverføringer. Velg OK. Mappen inneholder E2E-filene som skal kopieres til en ekstern harddisk og arkiveres.
  20. Ta øyet i holderen til skanningslaseroftalmoskopet, som hovedsakelig brukes til 787 nm autofluorescens.
    MERK: Se produsentens brukerhåndbok for anskaffelse og arkivering av bildene.
  21. Slå på datamaskinen og laseren.
  22. Velg ikonet Ny pasient . Fyll ut pasientdataene etter behov.
  23. Hvis du vil holde øyedataarket likt, trykker du OK. Siden C-kurven forblir den samme, trykker du på Fortsett.
  24. Velg Studiemodus , og skriv inn passordet om nødvendig. Hold C-kurven på 7,7 mm. Trykk på OK.
  25. Velg Fortsett for å kontrollere C-kurven. Velg den gule indikatoren for å starte kameraet.
  26. Velg R-posisjonen . Juster og orienter kloden. Velg IR-modus for å fokusere og orientere deg som ovenfor.
  27. Orienter kamerahodet ved å bevege hele enheten i to akser i forhold til basen (tilleggsmateriale 2, side 28, grønn pil) og deretter heve høyden (y) på enheten (blå piler). Fokuser bildet ved å dreie på knappen (oransje pil). Den svarte spaken er i posisjon R (*). Når dette hodet er på plass, låser du enheten ved å vri tommelskruen (lilla pil).
  28. Merk at skjermbildet vises som vist på side 29 i tilleggsmateriale 2.
  29. Flytt valgknappen fra R til A. Velg ICGA (for å oppnå 787 nm autofluorescens) i blått, 100 % intensitet, 30° synsfelt og enfasebilde.
    MERK: I likhet med fargestoffet indocyaningrønt blir melanin begeistret av 787 nm bølgelengdelys.
  30. Merk at skjermen vises som vist på side 31 i tilleggsmateriale 2. Trykk på den svarte platen for gjennomsnitt, og velg deretter Hent.
  31. Velg Vindu > database. Velg Importer E2E-filer fra SLO-enheten; Disse filene lagres på en ekstern harddisk og lastes opp til skrivebordet.
  32. Velg Åpne. Merk av for at merkene er standard, og velg OK.
  33. Merk at pasienten nå har to faner: en som viser bildene hentet fra SLO (blå pil), og den andre fanen som viser bildene hentet fra OCT-enheten (rød pil) (tilleggsmateriale 2, side 34).
  34. Høyreklikk på 786 nm (ICGA) bildet, og eksporter bildet til en fil merket SLO 786 på skrivebordet.
  35. For å lagre 786 nm autofluorescens SLO bildet, velg pasienten, og høyreklikk for å eksportere bilder som RAW-filer (for .vol filer) til en mappe på skrivebordet.
  36. Hvis du vil eksportere bilder fra OCT-enheten for overføring til arkivdatamaskinen, kopierer/limer du inn fra RAWEXPORT til en mappe merket RAW.

9. Imaging gjennomgang

  1. Sett sammen bildene (farge, .vol-fil, SLO bilder) i mapper for hver giver med undermapper for hvert øye, og indekser mappene fortløpende etter laboratorie-ID.
  2. Registrer vevsinntrykkene (kvalitet, patologi) i en database for en standardisert rapport.
  3. Se gjennom de eksporterte OCT-volumene med et internt ImageJ-plugin.
    1. Finn fovea-senteret, som kan gjenkjennes av midten av fovealdyppen, den indre stigningen av de ytre retinalbåndene eller det tynneste punktet. I de fleste tilfeller vil disse sammenfalle, men ikke alltid, da dette avhenger av foveal bevaring, individuell variabilitet og tilstedeværelse av patologi.
    2. Finn en standard skanning i øvre perifovea (2 mm / 67 B-skanning unna i overlegen retning, dvs. økende skannetall).
    3. Lagre en .tif stabel med hele volumet for hurtigreferanse i fremtiden.
    4. Bla gjennom OCT-volumet i sin helhet, fra skanning 1 (dårligere), mens du registrerer skannenumrene der funksjoner gjenkjennes.
    5. Sjekk peripapillærområdet i tillegg til makulaen.
      MERK: Peripapillær chorioretinal atrofi i eldre øyne inkluderer en særegen basal laminær avsetning og neovaskularisering. Dette er et vanlig område med pigmentforandring i myopiske øyne og glaukom, så vel som i aldring og AMD37.
  4. Inspiser fargefotografiene, og koble eventuelle funn til de som er sett av OCT hvis mulig.
    MERK: Generelt er det lettere å se de fleste funn ved OCT først. Fargefotografier gir en stor utsikt over området utenfor området på SLO, koroidal pigmentering inkludert nevi, tilstedeværelse av heme og harde ekssudater og svart pigment i neovaskulær AMD. Mørkt pigment i fovea kan representere løse melanosomer fra fremre segment og bør vaskes forsiktig bort med buffer ved hjelp av pipette.
  5. Inspiser SLO bilder, og koble eventuelle funn til de sett av OCT hvis mulig.
  6. Lagre standard B-skanninger ved fovea og perifovea, ekstra B-skanninger med bemerkelsesverdig patologi eller andre funksjoner, og SLO bilder i en patologirapport.
  7. Kategoriser øynene som følger: Unremarkable, tvilsomme, tidlig mellomliggende AMD, atrofisk AMD, neovaskulær AMD, andre, ukjente, ikke graderbare, ikke registrert. "Tvilsom" brukes hvis det ikke er klart om endringene er alvorlige nok for en annen kategorisering. "Not Gradable" er reservert for øyne som mangler nyttige OCT-skanninger, for eksempel de med alvorlig frittliggende netthinner. "Not Recorded" er reservert for øyne som behandles umiddelbart etter mottak uten fotografering.
  8. Bruk disse kriteriene for AMD: alvorlig RPE-endring med enten drusen eller subretinale drusenoidavsetninger, med eller uten tegn på neovaskularisering, som væske eller fibrose, og uten tegn på andre årsaker (oppdatert fra Curcio et al.10 for å imøtekomme SDD).
    MERK: Den endelige diagnosen bekreftes ved histologisk analyse.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Tabell 1 viser at i løpet av 2016-2017 ble 184 øyne fra 94 hvite ikke-diabetiske donorer >80 år gjenfunnet. Gjennomsnittlig død-til-bevaringstid var 3,9 timer (område: 2,0-6,4 timer). Av de 184 øynene som ble gjennomgått, hadde 75 (40,2%) visse AMD. Følgende kategorier ble identifisert: Unremarkable (39,7%), Tvilsom (11,4%), Early-Intermediate AMD (22,8%), Atrofisk (7,6%), Neovaskulær (9,8%), Annet (8,7%) og Ukjent/Ikke registrert/Ikke graderbart (<1%). Figur 2, figur 3, figur 4 og figur 5 viser multiskala, multimodal ex vivo-avbildning av eksepsjonelt godt bevarte øyne fra denne serien. Øynene ble gjennomgått i samarbeid med en øyelege som spesialiserer seg på retinal sykdom (J.A.K.). Mens noen øyne viste individuelle egenskaper bedre enn andre, ble disse sakene valgt for allsidig høy kvalitet.

Som beskrevet38, skiller ex vivo fargefotografering seg fra tilsvarende in vivo-fotografering. Retinal ødem og / eller løsrivelse kan redusere synligheten av det bakre pigmenterte vevet. Observasjoner i friske øyne indikerer at disse endringene skjer post mortem og ikke forverres markert med rask fiksering. I tillegg tømmes koroidale kar etter døden. På grunn av en bølgende bakgrunn av bleke kar og mørkt interstitielt vev, bør vurderingen av pigmentvariasjoner i RPE-planet assisteres av andre modaliteter enn farge. I ex vivo OCT er mer informasjon tilgjengelig enn i fargefotografering. Ex vivo OCT skiller seg også vesentlig fra in vivo OCT. De største forskjellene inkluderer den generelle økte reflektiviteten til vev, spesielt i den indre netthinnen, den konsistente reflektiviteten til noen bånd (nervefiberlag, indre og ytre plexiforme lag, RPE), den lavere synligheten av choroid-detaljene, spesielt under den edematøse netthinnen, og synligheten av vevslagsavdelinger (se nedenfor). De ytre retinale hyperrefleksbåndene, som involverer fotoreseptorer og RPE (ellipsoidsone, EZ; interdigitasjonssone, IZ), er inkonsekvent synlige ex vivo og brukes ikke som landemerker i denne sammenhengen. Den kliniske konsensus for spektraldomenet OCT bruker begrepet RPE-Bruchs membranbånd (BrM). Imidlertid foretrekkes begrepet RPE-basal lamina (BL)-BrM-bånd fordi det rommer forekomsten av basale laminære avsetninger i AMD24.

Figur 2 viser en lite bemerkelsesverdig makula og hyporeflekterende store koroidale kar, med et reflekterende RPE-BL-BrM-bånd mellom de to. Et stort kar i den indre netthinnen kaster en skygge på de bakre lagene. IPL og OPL er moderat reflekterende. I NIR SLO, er både retinal og choroidal vaskulatur synlig. Den rødfrie refleksjonen SLO fungerer best for funksjoner i den indre retina og vitreoretinale grensesnitt som bueformede fibre og papillomacular bunt av NFL. I normale øyne viser 488 nm autofluorescens SLO et område med totalt redusert signal i den sentrale makulaen på grunn av fortykket parafovea og i noen tilfeller absorpsjon av det gule xantofyllpigmentet, samt hyperautofluorescens som fôrer de store retinalkarene, noe som tyder på bindevevskjeder. Autofluorescensen ved 787 nm viser en liten region med økt signal i den sentrale makulaen fra RPE, et signal i koroidal stroma og hypoautofluorescerende striper som svarer til koroidalkarene.

Figur 3 viser en makula med tidlig mellomliggende AMD. De synlige funksjonene inkluderer en myk drusen (kuppelformet RPE-høyde nær fovea), SDD (intermitterende reflektivitet med et dentat utseende internt i RPE-BL-BrM-båndet), hyperreflekterende foci (HRF, reflekterende materiale med samme reflektivitet som RPE i laget, lokalisert i netthinnen) og vitelliform forandring (en innadgående utvidelse av RPE-organellene, både intracellulær og ekstracellulær, i forbindelse med basale laminære avsetninger39). Fargefotografiet viser sterk pigmentering tilsvarende vitelliform lesjon, omgitt av redusert pigmentering. Verken drusen eller SDDene er tydelig synlige etter farge. NIR-refleksjonen viser reflektiviteten i fovea. Autofluorescensen ved 488 nm eksitasjon viser et flekkete signal i fovea. SDD-er vises av og til på SLO modaliteter; Dette er mer sannsynlig hvis SDDene er rikelige, og SDDer er lettest sett på som et regelmessig fordelt punkteringsmønster (se Spaide og Curcio19, figur 6). Mønsteret som er høyere og tidsmessig i forhold til fovea i figur 3I er ikke SDD, fordi det er uregelmessig og lokalisert til et overfladisk fokalplan. Alle ansiktsmodalitetene viser fine folder som stråler ut fra fovea. I mindre godt bevarte øyne kan lignende folder være store nok til å være synlige ved de laveste visningsforstørrelsene.

Figur 4 viser en makula med atrofisk AMD. Fargen fundus fotografi viser sirkulære atrofiske områder, sentral hyperpigmentering, og små hyperpigmenterte prikker i parafovea som tilsvarer i OCT til HRF på nivået av Henle fiber layer-ytre kjernefysiske lag (HFL-ONL). I tillegg kan en lav flat RPE-høyde i OCT representere en basal laminær avsetning, ikke-eksudativ type 1 neovaskularisering, eller begge deler. Atrofi i foveal B-skanning er gjenkjennelig ved innsynkning av HFL-ONL, et område med hypertransmisjon (lys som skinner gjennom til choroid), en vitelliform forandring med økt skygge i foveal sentrum, og HRF som kaster skygger. I dette øyet viser NIR-refleksjonen hyperrefleksive flekker i fovea. Autofluorescensen ved 787 nm eksitasjon viser effektivt et signal som svarer til foveal hyperpigmentering og fraværet av et signal i de sirkulære atrofiske områdene. Den rødfrie og 488 nm autofluorescensen viser de indre retinale funksjonene.

Figur 5 viser makula med makulatrofi sekundært til neovaskulær AMD. Fargefundusfotografiet viser svart pigmentering i det atrofiske området. OCT viser atrofi ved sagging (innsynkning) av HFL-ONL og økt hypertransmisjon. Foveal B-skanning viser en haug av subfovealt hyperreflekterende materiale og intraretinale cyster. Den nær-infrarøde refleksjonen viser reflektivitet i det atrofiske området på grunn av tap av RPE og koroidale kar. Et lite, intenst reflekterende område i fovea er ikke synlig på farge. Den rødfrie refleksjonen viser retinale kar og, innenfor en ringformet sone, koroidale kar. Autofluorescensen (488 nm) viser tydelig en omtrent sirkulær atrofisk grense og øyer med begynnende atrofi. Et sentralt område uten signal er omgitt av et ringrom av moderat signal og synlige choroidale kar.

Figur 6 viser vanlige artefakter i ex vivo OCT-avbildning. Ødem kan være fremtredende i den indre netthinnen, og skape buler og folder gjennom fovea (figur 6A,I). Mekanisk skade kan oppstå ved trekkraft på glasslegemet eller ved direkte kontakt av netthinnen med dissekeringsverktøyene, noe som resulterer i dislokasjon av materiale og noen ganger tap av materialet (figur 6F, G). Løsrivelser kan forekomme langs flere vevsplan og kan representere relative strekkkrefter mellom lagene som også forekommer in vivo. Enhver løsrivelse kan utvides ytterligere ved etterfølgende behandling. Den vanligste løsningen er retinal (dvs. mellom fotoreceptorens ytre segmenter og de apikale prosessene til RPE) (figur 6B-D, F-I). De apikale prosessene kan enten løsne fra de ytre segmentene eller forbli med RPE-cellelegemene, som bestemt av histologi. Netthinneavløsning kan være stor og bølgende (figur 6 B,D,I) eller smal og knapt merkbar (figur 6C,F,G). Bacillær lagløsning (BALAD40) ble først sett i laboratoriet og senere funnet i klinisk OCT. BALAD tilskrives en splittelse gjennom den myoide delen av fotoreceptorens indre segmenter, som etterlater ellipsoiddelen av det indre segmentet og det ytre segmentet festet til RPE (figur 6A, D, I). BALAD må ikke forveksles med SDD in in vivo OCT. Et tredje løsrivelsesplan er den indre begrensningsmembranen (ILM), og det er ofte gjenværende reflekterende væske mellom ILM og de gjenværende retinale lagene (figur 6A,B,I). Den minst vanlige løsningen er mellom choroid og sclera (figur 6C). Fovea viser ofte cystoide rom som ikke bør betraktes som patologiske uten støttende evidens, for eksempel tegn på neovaskularisering (figur 6H). I enkle B-skanninger kan bølger av RPE gi inntrykk av drusen. 3D-visningen av et OCT-volum tydeliggjør at disse beveger seg langs koroidalkarene (figur 6E,J). Bølger kan skyldes differensielle volumendringer mellom karene og intervenerende stroma etter død og under fiksering.

For å kalibrere forventningene til kvalitet og utforske begrensningene til ex vivo OCT, sammenligner figur 7 in vivo-avbildning, ex vivo-avbildning og histologi av tre klinisk dokumenterte øyne med AMD. Disse tre øynene ble bevart annerledes enn i figur 2, figur 3, figur 4 og figur 5. For å bekrefte de strukturelle OCT-reflektivitetskildene, som er subcellulære41, ble øynene i figur 7 bevart i 2,5 % glutaraldehyd og 1 % glutaraldehyd for å muliggjøre høyoppløselig epoksyharpikshistologi og korrelativ elektronmikroskopi. Glutaraldehyd legger opasitet til disse prøvene i forhold til de i figur 2, figur 3, figur 4 og figur 5. Effekten av en kortere versus lengre DtoP er tydelig (figur 7A-F, 2.1 h vs. figur 7G-I, 8.9 h). I øyet med lengre DtoP endret post mortem-ødem retinalkonturen, og ILM ble løsrevet. Patologien av interesse (ytre retinal tubulering) var subtil i ex vivo avbildning. Det ble funnet fordi øyesporet in vivo OCT fant den relevante B-skanningen, og de koroidale karene kunne matches. I de to øynene med kortere DtoP var noen store patologier (type 3 makulær neovaskularisering) umiddelbart synlige (figur 7A-C). Andre ble funnet ved hjelp av øyesporing (figur 7D-F).

Figure 1
Figur 1: Hornhinneeksisjon fra et humant donorøye for nedsenking fiksering av netthinnen. Øverst til venstre holdes det utskårne donorøyet på plass av en kappe av gasbind stabilisert av en hemostat; Øverst til høyre brukes en 18 mm trefin til å lage en sirkulær poengsum inkludert hornhinnen og en 2 mm bred kant av sclera; midten, den scorede sirkelen avsluttes av et kutt med fjærbelastet buet tippet saks, mens kloden er stabilisert; Nederst til venstre løftes hornhinnen og skleralranden, og utsetter iris (blå) og ciliær kropp (brunbrun); nederst i midten løftes hornhinnen med kanten helt av; Nederst til høyre klippes iris vinkelrett på pupillmarginen for å lette penetrasjonen av konserveringsmiddelet i glasslegemet. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Multimodal ex vivo avbildning av en lite bemerkelsesverdig makula. En makula fra en 82 år gammel kvinnelig donor med et død-til-bevaringsintervall på 1,97 timer. (A) Fundus på høyre øye sett med det fremre segmentet fjernet (epi-belysning). (B) Nærbilde av makulaen (epi-belysning). (C) Nærbilde av fovea (epibelysning). De grønne linjene indikerer plasseringen av OCT B-skanningene i panelene D og E. (D,E) OCT B-skanner gjennom (D) superior perifovea (E) og fovea. Netthinnen (R), årehinnen (C) med hyporeflekterende store kar og det mellomliggende hyperreflekterende RPE-BL-BrM-båndet er synlige. I dette eksepsjonelt godt bevarte øyet er den moderat reflekterende IPL og OPL også synlige. (D) Et stort kar i den indre netthinnen kaster en skygge på de bakre lagene. (E) Separasjonen mellom netthinnen og RPE i panel E (gul pilspiss) er artefaktuell. (F) Den nær-infrarøde refleksjonen viser detaljene i både retinal og choroidal vaskulatur. (G) Den rødfrie refleksjonen viser de bueformede fibrene (venstre grønne buede pil) og papillomakulære bunt (grønn pil) i nervefiberlaget. (H) 488 nm bølgelengde autofluorescens viser et område med generelt redusert signal i den sentrale makulaen på grunn av en fortykket edematøs parafovea, samt ringer og et punkt med lavt signal i fovealsenteret og hyperautofluorescens som fôrer de store retinalkarene, noe som tyder på bindevevskjeder. (I) Autofluorescensen ved 787 nm viser et lite område med økt signal i den sentrale makulaen fra RPE, et signal i choroidal stroma og hypoautofluorescerende striper som tilsvarer koroidale kar. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3. Multimodal ex vivo avbildning av et donorøye med tidlig mellomliggende AMD. Donorøye fra en 97 år gammel kvinnelig donor med et død-til-bevaringsintervall på 3,1 timer. (A) Fundus på høyre øye sett med fremre segment fjernet (epibelysning). (B) Nærbilde av makulaen (epi-belysning). De grønne linjene angir plasseringen av OCT B-skanningene i panelene D, E og F. (C) Nærbilde av fovea som viser hyperpigmentering (pil, blitsbelysning). (D) En SDD i superior perifovea (oransje piler) ses på OCT. I Vitelliform endring i RPE under fovea (hvite piler). (F) Dårligere enn fovea er en myk drusen med en hyporeflekterende linje ved basen (gul pil) og et hyperreflekterende fokus over (lyseblå pil). (VG Nett) Bildene fra skanningslaseroftalmoskopet viser svært fine stjernefolder i fovea (også sett i C). (G) Den nær-infrarøde refleksjonen viser reflektivitetsmateriale i fovea som delvis tilsvarer vitelliformet materiale. (H) Den rødfrie refleksjonen viser netthinneoverflaten. (I) 488 nm bølgelengde autofluorescens viser et område med generelt redusert signal i den sentrale makulaen på grunn av en litt fortykket parafovea. SDD-er er ikke godt synlige. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: Multimodal ex vivo avbildning av komplett RPE og retinal atrofi ved aldersrelatert makuladegenerasjon. Donorøye fra en 97 år gammel kvinne med et død-til-bevaringsintervall på 2,33 timer. (A) Fundus på venstre øye sett med transbelysning. (B) Nærbilde av makulaen (epi-belysning). De grønne linjene indikerer plasseringen av OCT B-skanningene i panelene D og E. (C) Nærbilde av fovea (epibelysning) som viser sentral hyperpigmentering (grønn pilspiss) og små hyperpigmenterte prikker (gule pilspisser). Den sentrale prikken er intens brun fordi den overliggende netthinnen er veldig tynn. Prikkene virker desaturerte fordi den overliggende netthinnen er tykk. Sirkulære atrofiske områder er indikert (hvite pilspisser). (D,E) OCT B-skanner gjennom (D) perifovea (E) og fovea. Netthinnen (R) og tynn årehinnen (C) er synlige. (D) Hyperreflekterende foci (gule pilspisser) på nivået av HFL-ONL tilsvarer de hyperpigmenterte prikkene i C. Den lave flate RPE-høyden under dem kan representere en basal laminær avsetning, ikke-eksudativ type 1 neovaskularisering, eller begge deler. (E) B-skanningen gjennom fovea viser atrofi gjenkjennelig ved innsynkning av HFL-ONL (rød pilspiss), et område med hypertransmisjon, en vitelliform forandring med økt skyggelegging i fovealsenteret (grønn stjerne) og hyperreflekterende foci (blågrønn pilspiss) med skygge. Det hyporeflekterende rommet mellom netthinnen og RPE-båndet kan representere subretinalvæske. (F) Den nær-infrarøde refleksjonen viser hyperreflekterende flekker i fovea. (G) Det rødfrie bildet viser de bueformede fibrene i NFL og reflekterende blomster på netthinneoverflaten. (H) 488 nm autofluorescens fokusert på netthinnen viser et signal assosiert med retinalkarrene, ingen signal assosiert med RPE og svake autofluorescerende flekker i det sentrale makulære området. (I) 787 nm autofluorescens viser et signal som tilsvarer pigmentering i C. Sirkulære atrofiske områder er tydelige. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 5
Figur 5: Multimodal ex vivo-avbildning av type 1-neovaskularisering og makulaatrofi ved aldersrelatert makuladegenerasjon. Et donorøye fra en 86 år gammel kvinnelig donor med et død-til-bevaringsintervall på 3,5 timer. (A) Fundus på venstre øye sett med det fremre segmentet fjernet (transbelysning). (B) Nærbilde av makulaen med atrofiske grenser (gule pilspisser). De grønne linjene indikerer plasseringen av OCT B-skanningene i panelene D og E. (C) Nærbilde av fovea viser svart pigmentering (grønne pilspisser) innenfor det atrofiske området. (D,E) OCT B-skanner gjennom (D) perifovea (E) og fovea. Netthinnen I og tynn årehinnen (C) er synlige. I dette eksepsjonelt godt bevarte øyet er den moderat reflekterende IPL og OPL også synlige. (D) Den perifoveale B-skanningen beiter den øvre kanten av det atrofiske området. Atrofi fremgår av sagging av HFL-ONL og økt hypertransmisjon (røde pilspisser). Mulige subretinale drusenoidavsetninger er indikert (fuchsia pilspisser). (E) Den foveale B-skanningen viser en haug av subfovealt hyperreflekterende materiale og intraretinale cyster (stjerne). O = synsnervehodet. (F) Den nær-infrarøde refleksjonen viser et reflekterende område med atrofi og koroidale kar (blågrønne pilspisser), inkludert et lite intenst område i den sentrale makulaen (oransje pilspiss) som ikke er synlig ved fargeavbildning. (G) Den rødfrie refleksjonen viser retinale kar og, innenfor en ringformet sone, koroidale kar. (H) 488 nm autofluorescens viser en omtrent sirkulær atrofisk grense (gule pilspisser) og øyer med begynnende atrofi. Et sentralt område uten autofluorescens er omgitt av et ringrom av moderat autofluorescens og synlige koroidale kar (hvite pilspisser). Autofluorescensen på 787 nm var ikke mulig på dette øyet. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 6
Figur 6: Vanlige artefakter sett i ex vivo OCT-avbildning av donorøyne. Disse øynene kommer fra 2016-2017-serien av øyne. De fleste netthinner er hyperreflekterende i forhold til retinaene avbildet in vivo, og de indre retinale lagene er mer reflekterende enn de ytre retinale lagene. Bacillær løsrivelse (gule pilspisser i panel A, D, G og I) er definert som en splitt på nivået av fotoreceptorens indre segment myoid, noe som skaper et karakteristisk intraretinalt hulrom40. Netthinneavløsning (grønne pilspisser i panelene B, C, D, F, G og I) beskriver en separasjon av hele den nevrosensoriske netthinnen fra den underliggende RPE42. Avdelinger av den interne begrensningsmembranen (ILM) skiller ILM og nervefiberlaget (røde pilspisser i panel A, B og I). En koroidal løsrivelse (blå pilspiss i panel C) er en separasjon i årehinnen eller mellom årehinnen og sclera. Mekanisk skade (lilla pil i panel F og G) kan vises på alle nivåer og med alle dimensjoner, som gjelder manglende materiale (grønn pil i panel G) og forstuet materiale (gul pil i panel G). Netthinneødem (lilla stjerner i panel A og I) fremstår som en fortykkelse av netthinnevevet med dårlig definerte grenser mellom de separate retinallagene. En bølgende RPE (blå piler i panelene E og J) vises som et ujevnt, bølgete RPE-lag. Cystoide lesjoner (rød firkant i panel H) korrelerer med hyporeflekterende kammerlignende forandringer i netthinnevevet, vanligvis i fovea. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 7
Figur 7: Ex vivo synlighet av patologien sett in vivo avhengig av bevaringskvaliteten. (En-Jeg) Paneler En, Bog CPaneler D, Eog F, og paneler G, Hog Jeg representere tre klinisk dokumenterte øyne fra to donorer, hver sett ved øyesporing in vivo (En1-En2,D1-D2,G1-G2) og ex vivo (B1-B2,E1-E2,H1-H2) bildebehandling, etterfulgt av histologi (C,F,Jeg). De grønne linjene på nær-infrarød refleksjon (NIR, En1,B1,D1,E1,G1,H1) representerer nivåene av optisk koherenstomografi (OCT), B-skanning og panoramahistologi. Paneler En, Bog C og paneler D, Eog F, presentere henholdsvis høyre og venstre øye til en kvinnelig donor i 90-årene. Paneler G, Hog Jeg viser høyre øye til en annen kvinnelig donor, også i 90-årene. (En-C) Godt bevart okulært vev (DtoP: 2,1 h) muliggjør god synlighet av hovedpatologien. (En) En hyperreflekterende intraretinal makulær neovaskularisering (type 3 MNV, grønn pilspiss) er omgitt av intraretinal væske 17 måneder før døden (En2). RPE/Bruchs membrankompleks er splittet av hyporeflekterende materiale og fremstår som et "dobbeltlagstegn" (En2). Til venstre er et annet dobbeltlagsskilt med strekkodehypertransmisjon inn i årehinnen (oransje pilspiss). På ex vivo oktober (B2), type 3 MNV og strekkode hypertransmisjon er tydelig synlig og avgrenset. Netthinnen er kunstig løsrevet, som vist av den hvite pilspissen. Panoramahistologien viser en vertikalt orientert type 3 MNV-lesjon (grønn pilspiss, C1). Se tidligere forskning43,44 for detaljer om den opprinnelige saken. (D-F) Godt bevart okulært vev (DtoP: 2.1 h) kan resultere i gjennomsiktighet som er redusert, men likevel tilstrekkelig for å oppdage alvorlig patologi. oktober (D2) viser en stabel med intraretinale hyperreflekterende foci (HRF, fuchsia pilspiss) i et øye fulgt for eksudativ type 3 MNV. Ingen intraretinale cyster er synlige 11 måneder før døden. På ex vivo oktober (E2), er stakken med HRF komprimert vertikalt (fuchsia pilspiss), men tydelig avgrenset. På panoramahistologi (F1), stiger et retinalt pigmentepiteltårn (fuchsia pilspiss) oppover fra en myk druse. (G-Jeg) Mindre godt bevart okulært vev (DtoP: 8,9 h) resulterer i redusert synlighet av alvorlig patologi. OCT indikerer en ytre retinal tubulasjon (ORT, gul pilspiss) ved 48 måneder før døden (G2). På siden ex vivo OCT, fremstår ORT som en subtil forstyrrelse, og dette ville vært vanskelig å skjelne uten forkunnskaper (H2). Den indre grensemembranen er artifakt løsrevet (hvit pilspiss). Ødem har forvrengt retinal konturen. Den histologiske analysen viser ORT-lumen avgrenset av den eksterne begrensningsmembranen og fotoreseptorene som stikker ut i den (Jeg1). Se tidligere forskning26,45 for detaljer om den opprinnelige saken. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Numre Prosenter
Diagnostisk kategori Høyre øyne Venstre øyne Total Høyre øyne Venstre øyne Total
Unremarkable 39 34 73 41.50% 37.80% 39.70%
Tvilsom AMD 10 11 21 10.60% 12.20% 11.40%
Tidlig AMD 20 22 42 21.30% 24.40% 22.80%
Atrofisk AMD 6 8 14 6.40% 8.90% 7.60%
Neovaskulær AMD 11 7 18 11.70% 7.80% 9.80%
Annen 7 8 15 7.40% 8.90% 8.20%
Ukjent 0 0 0 0.00% 0.00% 0.00%
Ikke registrert 1 0 1 1.10% 0.00% 0.50%
Total 94 90 184 100.00% 100.00% 100.00%
Visse AMD 37 37 75 39.40% 41.10% 40.20%
Mulig AMD 47 48 95 50.00% 53.30% 51.60%
Øyne ble tiltrådt i perioden 17.06.16 - 14.09.17. Kriterier: ≥ 80 år, hvit, ikke-diabetiker, ≤6 t død-til-bevaring. Mål: 184 øyne (180 øyne av 90 givere, bevart; 4 øyne av 4 givere, bevart) Død-til-bevaring tid (gjennomsnitt, maksimum, minimum): 3,9 timer, 6,4 timer, 2,0 h

Tabell 1: Gjenoppretting av donorøye fra 2016-2017.

Tilleggsmateriale 1: Oversikt over disseksjon, fargefundusfotografi og OCT-basert multimodal avbildning. Klikk her for å laste ned denne filen.

Tilleggsmateriale 2: Detaljer om den OCT-baserte multimodale avbildningen for å illustrere trinnene i avsnitt 5-8. Klikk her for å laste ned denne filen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Ved å bruke en populasjonsbasert screeningtilnærming i løpet av en 16 måneders periode i pre-COVID-tiden, var det mulig å skaffe 75 donorøyne med AMD. Alle ble gjenfunnet med en kort DtoP og iscenesatt ved hjelp av OCT-forankret MMI. Alderskriteriet (>80 år) ligger utenfor det typiske aldersspennet for vevsgjenvinning beregnet på transplanterbare hornhinner. Til tross for den høye alderen resulterte kriteriene våre i øyne i alle stadier av AMD. Mange RPE-fenotyper er felles for alle AMD-stadier, og noen er eksklusive for neovaskulær AMD 3,46. Den direkte sammenligningen av ex vivo og in vivo avbildning (figur 7) bekreftet at kort DtoP er en kritisk faktor, sammen med eksperthåndtering (figur 1), for å produsere ex vivo-bilder av ytre retina tilstrekkelig for toppnivådiagnostisk klassifisering, og noen av disse prøvene var egnet for direkte korrelasjoner mellom avbildning og histologi 4,35, 47. Ikke all patologi er synlig ex vivo. Imidlertid er langt mer synlig når du bruker OCT sammenlignet med fargefotograferingsbaserte metoder10, spesielt de som involverer å skille netthinnen fra RPE / choroid27. Videre retter øyesporing fra klinisk OCT oppmerksomheten mot fokale og noen ganger små trekk (figur 7).

Dette bevaringssystemet innebærer typiske øyebankprosedyrer og verktøy for fjerning av hornhinnen, etterfulgt av nedsenking av et åpnet øye i et konserveringsmiddel som er gitt på forhånd. På denne måten kan øyebankpersonellet hente ut forskningsvev kontinuerlig (24/7). Sistnevnte karakteristikk er kritisk, da vev bestemt for umiddelbare komplekse disseksjoner27,32 krever døgnkontinuerlig bemanning av enten etterforskerne, øyebanken eller begge deler. Andre stabilisatorer som vil muliggjøre vevsgjenoppretting når som helst etterfulgt av spesialisert disseksjon og ekstraksjoner i arbeidstiden, for eksempel PAXgene Tissue System og Hibernate-A, kan være nyttige i fremtiden hvis disse er kompatible med OCT-avbildning.

Denne tilnærmingen gir retinas som forblir i stor grad festet til RPE og er dermed i stand til å generere data som kan oversettes til OCT-bildebehandling. Presis lokalisering er viktig fordi makulaen er liten (<3% av retinalområdet). Videre justerer avleiringsdrevet AMD-progresjon seg med topografien til tapper og staver48, og de tidligste utbruddene og de mest vedvarende synsdefektene forekommer på et bestemt sted (dvs. den stavholdige parafovea ved siden av all-cone fovea)49. For sammenligning med OCT er immunhistokjemi med kolorimetriske fargestoffer kompatibel med omfattende mikroskopi (f.eks. lysfelt) for å ta hensyn til alle vevselementene, både merket og umerket4. Ikke-målrettede molekylære analyser basert på prøvetakingsarrayer kan utnytte den horisontale justeringen av vertikalt oppdelte fotoreceptorer og RPE for effektivt å øke oppløsningen. Avbildning av massespektrometri med ioniserende laserpulser på 8 μm i diameter og 10-15 μm fra hverandre kan lokalisere dusinvis av lipider til subcellulære rom i de ytre retinale cellene50. Romlig oppløst transkriptomikk bruker et forhåndsarrangert sett med strekkodede reverstranskripsjonsprimere på glasslysbilder, som vevsseksjoner påføres51. Denne teknologien er for tiden begrenset til 55 μm diameterfangst og 100 μm avstand; Det forventes forbedringer i oppløsningen som vil gjøre denne teknologien egnet for AMD-forskning.

Denne protokollen har begrensninger. Gjenopprettingskriteriet utelater diagnoser av diabetes (30% blant Medicare-mottakere i Alabama)52 på grunn av betydningen av årehinnen i begge sykdommene. Denne ekskluderingen reduserer det totale donorbassenget og forlenger tiden som trengs for å samle nok øyne til en studie. Av historiske grunner utelot 2016-2017-kriteriene svarte givere, som nå representerer 14% av statlige øyedonorer, og svarte givere er nå inkludert i nåværende potensielle prosjekter. Forhåndsdirektivregisteret for personer som ønsker å være øyedonorer er omfattende, men inkluderer ennå ikke praktisk registrering ved lokale spesialitetspraksiser på netthinnen som tar vare på AMD-pasienter; Dette prosjektet er under utvikling. Under en populasjonsbasert skjerm som denne, vil øyne med forhold som overlapper fenotype med AMD vises og må gjenkjennes i samråd med den utviklende kliniske litteraturen og en oftalmolog som spesialiserer seg på retinale sykdommer. For eksempel inkluderte denne serien av øyne nevi med drusen53 og en linje med RPE-forstyrrelse over et pachyfartøy (et tykt kar i den indre årehinnen)54. Til slutt ble tidlig og mellomliggende AMD kombinert på grunn av mangelen på et OCT-basert graderingssystem for AMD, som er under utvikling av klassifiseringen av atrofimøtegruppe55. Ikke desto mindre tillater optimalisering av vevsgjenoppretting og OCT-basert karakterisering AMD-forskning som fokuserer på å utnytte tidselementet i øyesporet OCT-forankret MMI som skal planlegges, drives, planlegges og budsjetteres for i finansieringsapplikasjoner.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

C.A.C. mottar forskningsstøtte fra Heidelberg Engineering og konsulterer for Apellis, Astellas, Boehringer Ingelheim, Character Bioscience og Osanni. T.A. mottar forskningsstøtte fra Novartis og konsulterer for Roche, Novartis, Bayer, Nidek og Apellis. K.B.F. er konsulent for Genentech, Zeiss, Heidelberg Engineering, Allergan, Bayer og Novartis.

Acknowledgments

Vi takker Heidelberg Engineering for instrumenteringen og utformingen av den opprinnelige øyeholderen, Richard F. Spaide MD for introduksjonen til OCT-basert multimodal bildebehandling, Christopher Girkin MD for å lette tilgangen til kliniske bildebehandlingsenheter og David Fisher for figur 1. Utvinningen av de menneskelige donorøynene for forskning ble støttet av National Institutes of Health (NIH) tilskudd R01EY06019 (CAC), P30 EY003039 (Pittler), R01EY015520 (Smith) R01EY027948 (CAC, TA) R01EY030192 (Li), R01EY031209 (Stambolian) og U54EY032442 (Spraggins), IZKF Würzburg (N-304, T.A.), EyeSight Foundation of Alabama, International Retinal Research Foundation (CAC), Arnold og Mabel Beckman Initiative for Macular Research (CAC) og Research to Prevent Blindness AMD Catalyst (Schey).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Beakers, 250 mL Fisher # 02-540K
Bottles, 1 L, Pyrex  Fisher # 10-462-719 storage for preservative
Bunsen burner or heat source Eisco # 17-12-818 To melt wax
Camera, digital Nikon D7200 D7200
Computer and storage Apple iMac Pro; 14 TB external hard drive Image storage
Container, insulated Fisher # 02-591-45 For wet ice
Containers, 2 per donor, 40 mL Fisher Sameco Bio-Tite  40 mL # 13-711-86 For preservative
Crucible, quartz 30 mL Fisher # 08-072D Hold globe for photography
Cylinder, graduate, 250 mL Fisher # 08-549G
Disinfectant cleaning supplies   https://www.cardinalhealth.com/en/product-solutions/medical/infection-control/antiseptics.html
Eye holder with lens and mounting bracket contact J. Messinger jeffreymessinger@uabmc.edu custom modification of Heidelberg Engineering original design
Face Protection Masks Fisher # 19-910-667
Forceps, Harmon Fix Roboz  # RS-8247
Forceps, Micro Adson Roboz  # RS-5232
Forceps, Tissue Roboz # RS-5172
Glass petri dish, Kimax Fisher # 23064
Gloves Diamond Grip Fisher # MF-300
Gowns GenPro Fisher # 19-166-116
Image editing software Adobe Photoshop 2021, Creative Suite
KimWipes Fisher # 06-666
Lamps, 3 goosenecks Schott Imaging # A20800
Microscope, stereo Nikon SMZ 1000 for dissection
Microscope, stereo Olympus  SZX9 color fundus photography
Paraformaldehyde, 20%  EMS # 15713-S for preservative; dilute for storage
pH meter Fisher  # 01-913-806
Phosphate buffer, Sorenson’s, 0.2 M pH 7.2  EMS # 11600-10
Ring flash B & H Photo Video Sigma EM-140 DG 
Ruby bead, 1 mm diameter Meller Optics # MRB10MD
Safety Glasses 3M Fisher # 19-070-940
Scanning laser ophthalmoscope Heidelberg Engineering HRA2
Scissors, curved spring Roboz # RS-5681
Sharps container Fisher # 1482763
Shutter cord, remote Nikon MC-DC2
Spectral Domain OCT device Heidelberg Engineering Spectralis HRA&OCT https://www.heidelbergengineering.com/media/e-learning/Totara-US/files/pdf-tutorials/2238-003_Spectralis-Training-Guide.pdf
Stainless steel ball bearing, 25.4 mm diameter McMaster-Carr # 9529K31
Tissue marking dye, black Cancer Diagnostics Inc # 0727-1
Tissue slicer blades Thomas Scientific # 6767C18
Trephine, 18-mm diameter Stratis Healthcare # 6718L
TV monitor (HDMI) and cord for digital camera B&H Photo Video BH # COHD18G6PROB for live viewing and remote camera display features
Wax, pink dental EMS  # 72670
Wooden applicators Puritan # 807-12

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Spaide, R. F., et al. Consensus nomenclature for reporting neovascular age-related macular degeneration data: Consensus on neovascular age-related macular degeneration nomenclature study group. Ophthalmology. 127 (5), 616-636 (2020).
  2. Spaide, R. F., Ooto, S., Curcio, C. A. Subretinal drusenoid deposits a.k.a. pseudodrusen. Survey of Ophthalmology. 63 (6), 782-815 (2018).
  3. Curcio, C. A., Zanzottera, E. C., Ach, T., Balaratnasingam, C., Freund, K. B. Activated retinal pigment epithelium, an optical coherence tomography biomarker for progression in age-related macular degeneration. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 58 (6), 211-226 (2017).
  4. Cao, D., et al. Hyperreflective foci, OCT progression indicators in age-related macular degeneration, include transdifferentiated retinal pigment epithelium. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 62 (10), 34 (2021).
  5. Zanzottera, E. C., et al. Visualizing retinal pigment epithelium phenotypes in the transition to geographic atrophy in age-related macular degeneration. Retina. 36, S12-S25 (2016).
  6. Edwards, M. M., et al. Subretinal glial membranes in eyes with geographic atrophy. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 58 (3), 1352-1367 (2017).
  7. Zhang, Z., Shen, M. M., Fu, Y. Combination of AIBP, apoA-I, and aflibercept overcomes anti-VEGF resistance in neovascular AMD by inhibiting arteriolar choroidal neovascularization. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 63 (12), 2 (2022).
  8. Jiang, M., et al. Microtubule motors transport phagosomes in the RPE, and lack of KLC1 leads to AMD-like pathogenesis. Journal of Cell Biology. 210 (4), 595-611 (2015).
  9. Collin, G. B., et al. Disruption of murine Adamtsl4 results in zonular fiber detachment from the lens and in retinal pigment epithelium dedifferentiation. Human Molecular Genetics. 24 (24), 6958-6974 (2015).
  10. Curcio, C. A., Medeiros, N. E., Millican, C. L. The Alabama Age-related Macular Degeneration Grading System for donor eyes. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 39 (7), 1085-1096 (1998).
  11. Bastek, J. V., Siegel, E. B., Straatsma, B. R., Foos, R. Y. Chorioretinal juncture. Pigmentary patterns of the peripheral fundus. Ophthalmology. 89 (12), 1455-1463 (1982).
  12. Lewis, H., Straatsma, B. R., Foos, R. Y., Lightfoot, D. O. Reticular degeneration of the pigment epithelium. Ophthalmology. 92 (11), 1485-1495 (1985).
  13. Lewis, H., Straatsma, B. R., Foos, R. Y. Chorioretinal juncture. Multiple extramacular drusen. Ophthalmology. 93 (8), 1098-1112 (1986).
  14. Sarks, J. P., Sarks, S. H., Killingsworth, M. C. Evolution of geographic atrophy of the retinal pigment epithelium. Eye. 2 (5), 552-577 (1988).
  15. Sarks, J. P., Sarks, S. H., Killingsworth, M. C. Evolution of soft drusen in age-related macular degeneration. Eye. 8 (3), 269-283 (1994).
  16. Ghazi, N. G., Dibernardo, C., Ying, H. S., Mori, K., Gehlbach, P. L. Optical coherence tomography of enucleated human eye specimens with histological correlation: Origin of the outer "red line". American Journal of Ophthalmology. 141 (4), 719-726 (2006).
  17. Brown, N. H., et al. Developing SDOCT to assess donor human eyes prior to tissue sectioning for research. Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 247 (8), 1069-1080 (2009).
  18. Helb, H. M., et al. Clinical evaluation of simultaneous confocal scanning laser ophthalmoscopy imaging combined with high-resolution, spectral-domain optical coherence tomography. Acta Ophthalmologica. 88 (8), 842-849 (2010).
  19. Spaide, R. F., Curcio, C. A. Drusen characterization with multimodal imaging. Retina. 30 (9), 1441-1454 (2010).
  20. Naghavi, M., et al. From vulnerable plaque to vulnerable patient: a call for new definitions and risk assessment strategies: Part 1. Circulation. 108 (14), 1664-1672 (2003).
  21. Garcia-Garcia, H. M., Gonzalo, N., Regar, E., Serruys, P. W. Virtual histology and optical coherence tomography: from research to a broad clinical application. Heart. 95 (16), 1362-1374 (2009).
  22. Strouthidis, N. G., et al. Comparison of clinical and spectral domain optical coherence tomography optic disc margin anatomy. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 50 (10), 4709-4718 (2009).
  23. Sarks, S. H. Ageing and degeneration in the macular region: A clinico-pathological study. British Journal of Ophthalmology. 60 (5), 324-341 (1976).
  24. Sura, A. A., et al. Measuring the contributions of basal laminar deposit and Bruch's membrane in age-related macular degeneration. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 61 (13), 19 (2020).
  25. Chen, L., Messinger, J. D., Kar, D., Duncan, J. L., Curcio, C. A. Biometrics, impact, and significance of basal linear deposit and subretinal drusenoid deposit in age-related macular degeneration. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 62 (1), 33 (2021).
  26. Litts, K. M., et al. Clinicopathological correlation of outer retinal tubulation in age-related macular degeneration. JAMA Ophthalmology. 133 (5), 609-612 (2015).
  27. Olsen, T. W., Feng, X. The Minnesota grading system of eye bank eyes for age-related macular degeneration. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 45 (12), 4484-4490 (2004).
  28. Mano, F., Sprehe, N., Olsen, T. W. Association of drusen phenotype in age-related macular degeneration from human eye-bank eyes to disease stage and cause of death. Ophthalmology Retina. 5 (8), 743-749 (2021).
  29. Age-related eye disease study research group. The Age-Related Eye Disease Study system for classifying age-related macular degeneration from stereoscopic color fundus photographs: The Age-Related Eye Disease Study Report Number 6. American Journal of Ophthalmology. 132 (5), 668-681 (2001).
  30. Arnold, J. J., Sarks, S. H., Killingsworth, M. C., Sarks, J. P. Reticular pseudodrusen. A risk factor in age-related maculopathy. Retina. 15 (3), 183-191 (1995).
  31. Olsen, T. W., Bottini, A. R., Mendoza, P., Grossniklausk, H. E. The age-related macular degeneration complex: linking epidemiology and histopathology using the Minnesota grading system (the inaugural Frederick C. Blodi Lecture). Transactions of the American Ophthalmological Society. 113, (2015).
  32. Owen, L. A., et al. The Utah protocol for postmortem eye phenotyping and molecular biochemical analysis. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 60 (4), 1204-1212 (2019).
  33. Wang, J. J., et al. Ten-year incidence and progression of age-related maculopathy: The Blue Mountains Eye Study. Ophthalmology. 114 (1), 92-98 (2007).
  34. Joachim, N., Mitchell, P., Burlutsky, G., Kifley, A., Wang, J. J. The incidence and progression of age-related macular degeneration over 15 years: The Blue Mountains Eye Study. Ophthalmology. 122 (12), 2482-2489 (2015).
  35. Pang, C., Messinger, J. D., Zanzottera, E. C., Freund, K. B., Curcio, C. A. The onion sign in neovascular age-related macular degeneration represents cholesterol crystals. Ophthalmology. 122 (11), 2316-2326 (2015).
  36. Keilhauer, C. N., Delori, F. C. Near-infrared autofluorescence imaging of the fundus: Visualization of ocular melanin. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 47 (8), 3556-3564 (2006).
  37. Curcio, C. A., Saunders, P. L., Younger, P. W., Malek, G. Peripapillary chorioretinal atrophy: Bruch's membrane changes and photoreceptor loss. Ophthalmology. 107 (2), 334-343 (2000).
  38. Curcio, C. A. Imaging maculopathy in the post-mortem human retina. Vision Research. 45 (28), 3496-3503 (2005).
  39. Brinkmann, M., et al. Histology and clinical lifecycle of acquired vitelliform lesion, a pathway to advanced age-related macular degeneration. American Journal of Ophthalmology. 240, 99-114 (2022).
  40. Ramtohul, P., et al. Bacillary layer detachment: Multimodal imaging and histologic evidence of a novel optical coherence tomography terminology. Literature review and proposed theory. Retina. 41 (11), 2193-2207 (2021).
  41. Wilson, J. D., Foster, T. H. Mie theory interpretations of light scattering from intact cells. Optics Letters. 30 (18), 2442-2444 (2005).
  42. Ghazi, N. G., Green, W. R. Pathology and pathogenesis of retinal detachment. Eye. 16 (4), 411-421 (2002).
  43. Berlin, A., et al. Correlation of optical coherence tomography angiography of type 3 macular neovascularization with corresponding histology. JAMA Ophthalmology. 140 (6), 628-633 (2022).
  44. Berlin, A., et al. Histology of type 3 macular neovascularization and microvascular anomalies in anti-VEGF treated age-related macular degeneration. Ophthalmology Science. 3 (3), 100280 (2023).
  45. Schaal, K. B., et al. Outer retinal tubulation in advanced age-related macular degeneration: optical coherence tomographic findings correspond to histology. Retina. 35 (7), 1339-1350 (2015).
  46. Chen, L., et al. Histology and clinical imaging lifecycle of black pigment in fibrosis secondary to neovascular age-related macular degeneration. Experimental Eye Research. 214, 108882 (2022).
  47. Balaratnasingam, C., et al. Histologic and optical coherence tomographic correlations in drusenoid pigment epithelium detachment in age-related macular degeneration. Ophthalmology. 124 (1), 644-656 (2017).
  48. Curcio, C. A., et al. Subretinal drusenoid deposits in non-neovascular age-related macular degeneration: Morphology, prevalence, topography, and biogenesis model. Retina. 33 (2), 265-276 (2013).
  49. Owsley, C., et al. Biologically guided optimization of test target location for rod-mediated dark adaptation in age-related macular degeneration: ALSTAR2 baseline. Ophthalmology Science. 3 (2), 100274 (2023).
  50. Anderson, D. M. G., et al. The molecular landscape of the human retina and supporting tissues by high resolution imaging mass spectrometry. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 31 (12), 2426-2436 (2020).
  51. Lee, J., Yoo, M., Choi, J. Recent advances in spatially resolved transcriptomics: challenges and opportunities. BMB Reports. 55 (3), 113-124 (2022).
  52. Diabetes. Alabama Public Health. , Available from: https://www.alabamapublichealth.gov/healthrankings/diabetes.html (2022).
  53. Francis, J. H., et al. Swept-source optical coherence tomography features of choroidal nevi. American Journal of Ophthalmology. 159 (1), 169-176 (2015).
  54. Inoue, M., Dansingani, K. K., Freund, K. B. Progression of age-related macular degeneration overlying a large choroidal vessel. Retina Cases Brief Reports. 10 (1), 22-25 (2016).
  55. Jaffe, G. J., et al. Imaging features associated with progression to geographic atrophy in age-related macular degeneration: CAM Report 5. Ophthalmology Retina. 5 (9), 855-867 (2021).

Tags

Nevrovitenskap utgave 195 Øyebank biobanking optisk koherenstomografi multimodal avbildning aldersrelatert makuladegenerasjon
<em>Eks Vivo</em> OCT-basert multimodal avbildning av menneskelige donorøyne for forskning på aldersrelatert makuladegenerasjon
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Messinger, J. D., Brinkmann, M.,… More

Messinger, J. D., Brinkmann, M., Kimble, J. A., Berlin, A., Freund, K. B., Grossman, G. H., Ach, T., Curcio, C. A. Ex Vivo OCT-Based Multimodal Imaging of Human Donor Eyes for Research into Age-Related Macular Degeneration. J. Vis. Exp. (195), e65240, doi:10.3791/65240 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter