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JoVE Journal Neuroscience
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Neuroscience

Ex Vivo OCT-basierte multimodale Bildgebung menschlicher Spenderaugen zur Erforschung der altersbedingten Makuladegeneration

Published: May 26, 2023 doi: 10.3791/65240
Automatic Translation
1, 2, 1, 1, 3,4, 5, *6, *1
1Department of Ophthalmology and Visual Sciences, University of Alabama at Birmingham Heersink School of Medicine, 2Department of Ophthalmology, University Hospital of Zurich, 3Vitreous Retina Macula Consultants of New York, 4Department of Ophthalmology, New York University Grossman School of Medicine, 5Advancing Sight Network, 6Department of Ophthalmology, University Hospital Bonn
* These authors contributed equally

Summary

Labortests können den prognostischen Wert der auf der longitudinalen optischen Kohärenztomographie (OCT) basierenden multimodalen Bildgebung der altersbedingten Makuladegeneration (AMD) nutzen. Menschliche Spenderaugen mit und ohne AMD werden vor der Gewebeschnittierung mittels OCT, Farbe, Nahinfrarot-Reflexions-Scanning-Laser-Ophthalmoskopie und Autofluoreszenz bei zwei Anregungswellenlängen abgebildet.

Abstract

Eine Progressionssequenz für die altersbedingte Makuladegeneration (AMD), die aus der optischen Kohärenztomographie (OCT)-basierten multimodalen (MMI) klinischen Bildgebung gewonnen wurde, könnte den Laborbefunden einen prognostischen Wert verleihen. In dieser Arbeit wurden ex vivo OCT und MMI an menschlichen Spenderaugen vor der Schnittung von Netzhautgewebe appliziert. Die Augen wurden von nicht-diabetischen weißen Spendern im Alter von ≥80 Jahren mit einer Sterbezeit bis zur Konservierung (DtoP) von ≤6 h gewonnen. Die Globen wurden vor Ort geborgen, mit einem 18-mm-Trepan geritzt, um die Entfernung der Hornhaut zu erleichtern, und in gepuffertes 4%iges Paraformaldehyd getaucht. Farbfundusbilder wurden nach Entfernung des vorderen Augenabschnitts mit einem Präparierfernrohr und einer Spiegelreflexkamera unter Verwendung von Trans-, Epi- und Blitzbeleuchtung bei drei Vergrößerungen aufgenommen. Die Kugeln wurden in einem Puffer in einer speziell angefertigten Kammer mit einer 60-Dioptrien-Linse platziert. Sie wurden mit spektraler Domänen-OCT (30° Makulawürfel, 30 μm Abstand, Mittelung = 25), Nahinfrarot-Reflexion, 488 nm Autofluoreszenz und 787 nm Autofluoreszenz abgebildet. Die AMD-Augen zeigten eine Veränderung des retinalen Pigmentepithels (RPE), mit Drusen- oder subretinalen Drusenoidablagerungen (SDDs), mit oder ohne Neovaskularisation und ohne Hinweise auf andere Ursachen. Zwischen Juni 2016 und September 2017 wurden 94 rechte und 90 linke Augen geborgen (DtoP: 3,9 ± 1,0 h). Von den 184 Augen hatten 40,2 % AMD, einschließlich früher intermediärer (22,8 %), atrophischer (7,6 %) und neovaskulärer (9,8 %) AMD, und 39,7 % hatten unauffällige Makulas. Drusen, SDDs, hyperreflektive Herde, Atrophie und fibrovaskuläre Narben wurden mittels OCT identifiziert. Zu den Artefakten gehörten Gewebetrübung, Ablösungen (bakteriell, retinal, RPE, choroidal), foveale zystische Veränderungen, ein wellenförmiges RPE und mechanische Schäden. Um die Kryo-Schnitte zu steuern, wurden OCT-Volumina verwendet, um die Fovea und den Sehnervenkopf sowie spezifische Pathologien zu finden. Die ex-vivo-Volumina wurden mit den in-vivo-Volumina registriert, indem die Referenzfunktion für das Eye-Tracking ausgewählt wurde. Die Ex-vivo-Sichtbarkeit der in vivo beobachteten Pathologie hängt von der Erhaltungsqualität ab. Innerhalb von 16 Monaten wurden 75 schnelle DtoP-Spenderaugen in allen Stadien der AMD geborgen und mit klinischen MMI-Methoden in Szene gesetzt.

Introduction

Fünfzehn Jahre Behandlung der neovaskulären altersbedingten Makuladegeneration (AMD) mit einer Anti-VEGF-Therapie unter der Leitung der optischen Kohärenztomographie (OCT) haben neue Einblicke in die Progressionssequenz und Mikroarchitektur dieser weit verbreiteten Ursache des Sehverlusts ermöglicht. Eine wichtige Erkenntnis ist, dass AMD eine dreidimensionale Erkrankung ist, die die neurosensorische Netzhaut, das retinale Pigmentepithel (RPE) und die Aderhaut betrifft. Als Ergebnis der OCT-Bildgebung von Studienpatienten und den Mitaugen der behandelten Klinikpatienten werden nun die Merkmale der Pathologie erkannt, die über die von der Farbfundusfotografie hinausgehen, die seit Jahrzehnten ein klinischer Standard ist. Dazu gehören intraretinale Neovaskularisationen (Typ 3 Makulaneovaskularisation1, ehemals angiomatöse Proliferation), subretinale Drusenoidablagerungen (SDDs, auch retikuläre Pseudodrusen genannt)2, multiple Signalwege des RPE-Schicksals3,4 und intensiv gliotische Müllerzellen bei Atrophie 5,6.

Modellsysteme, denen Makula (Zellen und Tiere) fehlen, bilden einige Ausschnitte dieser komplexen Krankheit nach 7,8,9. Ein weiterer Erfolg bei der Linderung der Belastung durch AMD könnte durch die Entdeckung und Erforschung der primären Pathologie im menschlichen Auge, das Verständnis der einzigartigen zellulären Zusammensetzung der Makula und die anschließende Übertragung in Modellsysteme erzielt werden. Dieser Bericht porträtiert eine drei Jahrzehnte währende Zusammenarbeit zwischen einem akademischen Forschungslabor und einer Augenbank. Die hierin beschriebenen Gewebecharakterisierungsmethoden verfolgen zwei Ziele: 1) die sich entwickelnde diagnostische Technologie durch die Demonstration der Grundlagen des Fundusaussehens und der Bildgebungssignalquellen mit Mikroskopie zu informieren und 2) AMD-Proben für gezielte (Immunhistochemie) und ungezielte molekulare Entdeckungstechniken (bildgebende Massenspektrometrie, IMS und räumliche Transkriptomik) zu klassifizieren, die die reine Zapfenfovea und die stäbchenreiche para- und perifovea erhalten. Solche Studien könnten die Translation in die klinische OCT beschleunigen, für die eine Progressionssequenz und eine longitudinale Nachbeobachtung durch Eye-Tracking möglich sind. Diese Technologie, die zur Überwachung der Behandlungseffekte entwickelt wurde, registriert Scans von einem Klinikbesuch zum nächsten mit Hilfe von Netzhautgefäßen. Die Verknüpfung von Eye-Track-OCT mit Laborergebnissen, die mit destruktiven Techniken erzielt wurden, könnte molekularen Befunden eine neue Ebene der Prognose verleihen.

Im Jahr 1993 nahm das Forschungslabor Farbfotos des postmortalen Fundus auf Film10 auf. Inspiriert wurde diese Arbeit durch die hervorragende Photomikroskopie und Histologie der menschlichen peripheren Netzhaut von Foos und Kollegen 11,12,13 und die umfangreichen klinisch-pathologischen Korrelationen der AMD von Sarks et al.14,15. Ab 2009 wurde die multimodale Ex-vivo-Bildgebung (MMI) eingeführt, die auf der Spektraldomäne OCT verankert ist. Dieser Übergang wurde durch die ähnlichen Bemühungen anderer16,17 und insbesondere durch die Erkenntnis inspiriert, dass so viel von der von den Sarks beschriebenen Ultrastruktur im Laufe der Zeit in der Klinik dreidimensional verfügbar war18,19. Ziel war es, Augen mit anhaftenden Makulamuskeln in einem angemessenen Zeitrahmen für aussagekräftige Studien von Phänotypen auf zellulärer Ebene in Netzhaut, RPE und Aderhaut zu gewinnen. Die Absicht war, über die "Pro-Auge"-Statistik hinaus zu "pro Läsionstyp" überzugehen, einem Standard, der von den Konzepten der "anfälligen Plaque" bei Herz-Kreislauf-Erkrankungen beeinflusst wird20,21.

Das Protokoll in diesem Bericht spiegelt Erfahrungen mit fast 400 Paaren von Spenderaugen wider, die in mehreren Strömen akzessioniert wurden. In den Jahren 2011-2014 wurde die Website des Projekts MACULA zur AMD-Histopathologie erstellt, die Schichtdicken und Anmerkungen von 142 archivierten Proben enthält. Diese Augen wurden von 1996-2012 in einem Glutaraldehyd-Paraformaldehyd-Fixiermittel für hochauflösende Epoxidharz-Histologie und Elektronenmikroskopie konserviert. Alle Fundi waren bei Erhalt in Farbe fotografiert worden und wurden kurz vor der Histologie durch OCT neu abgebildet. Ein Augenhalter, der ursprünglich für die Untersuchung des Sehnervs22 konzipiert war, wurde verwendet, um eine Gewebestanze mit einem Durchmesser von 8 mm in voller Dicke aufzunehmen, die auf der Fovea zentriert war. OCT-B-Scans durch das foveale Zentrum und eine 2 mm obere Stelle, die der Histologie auf den gleichen Ebenen entspricht, wurden auf die Website hochgeladen, zusammen mit einem Farbfundusfoto. Die Wahl der OCT-Ebenen wurde durch die Prominenz der AMD-Pathologie unter der Fovea23 und die Prominenz der SDDs in stäbchenreichen Bereichen, die der Fovea überlegen sind, diktiert24,25.

Seit 2013 stehen Augen, die lebenslang mit OCT-verankertem MMI abgebildet wurden, für direkte klinisch-pathologische Korrelationen zur Verfügung. Bei den meisten (7 von 10 Spendern) handelte es sich um Patienten einer Netzhautüberweisungspraxis (Autor: K.B.F.), die ein Register für Patienten, die daran interessiert waren, ihre Augen nach dem Tod zu Forschungszwecken zu spenden, anbot. Die Augen wurden von der örtlichen Augenbank geborgen und konserviert, ins Labor gebracht und auf die gleiche Weise wie die Augen des Projekts MACULA präpariert. Die prämortalen klinischen OCT-Volumina wurden nahtlos im Labor gelesen, wodurch die im Laufe des Lebens beobachteten pathologischen Merkmale mit den unter dem Mikroskop sichtbaren Merkmalen in Einklang gebracht wurden26.

Ab 2014 begann die prospektive Augenentnahme mit einem Screening auf AMD bei Spenderaugen ohne klinische Anamnese, die jedoch während eines definierten Zeitraums (6 h) aufbewahrt wurden. Zu diesem Zweck wurde der Augenhalter so modifiziert, dass er einen ganzen Globus aufnehmen kann. Dies verringerte die Wahrscheinlichkeit, dass sich die Schnittkanten des zuvor verwendeten 8-mm-Stempels ablösten. Die Augen wurden in 4 % gepuffertem Paraformaldehyd für die Immunhistochemie konserviert und am nächsten Tag zur Langzeitlagerung auf 1 % überführt. In den Jahren 2016-2017 (vor der Pandemie) wurden 184 Augen von 90 Spendern geborgen. Die Statistiken und Bilder in diesem Bericht stammen aus dieser Serie. Während der Pandemie-Ära (Lockdowns und Nachwirkungen 2020) wurden die prospektiven Sammlungen für Transkriptomik und IMS-Kollaborationen in reduziertem Tempo fortgesetzt, wobei im Wesentlichen die Methoden von 2014 verwendet wurden.

Andere Methoden zur Beurteilung des Spenderauges stehen zur Verfügung. Das Minnesota Grading System (MGS)27,28 basiert auf dem klinischen AREDS-System für die Farbfundusfotografie 29. Zu den Einschränkungen dieser Methode gehört die Kombination von atrophischer und neovaskulärer AMD in einem Stadium der "späten AMD". Des Weiteren beinhaltet die MGS die Entfernung der neurosensorischen Netzhaut vor der Fotodokumentation der RPE-Aderhaut. Dieser Schritt löst SDDs in unterschiedlichem Ausmaß30,31 und entfernt die räumliche Entsprechung der äußeren Netzhaut und ihres Stützsystems. Daher könnten die Bemühungen, den metabolischen Bedarf und die Signalübertragung von der Netzhaut mit der Pathologie in der RPE-Aderhaut in Verbindung zu bringen, behindert werden. Das Utah-System implementierte MMI unter Verwendung von Ex-vivo-Farbfotografie und OCT, um Augen, die für die Sektion bestimmt waren, in Regionen für RNA- und Proteinextraktionen zu kategorisieren32. Obwohl er der Extraktion ganzer Augenmuscheln vorzuziehen ist, macht der Bereich mit einem Durchmesser von 3 mm und dem höchsten Risiko für eine AMD-Progression33,34 nur 25 % einer foveazentrierten Stanze mit 6 mm Durchmesser aus. Daher sind Techniken von Vorteil, die Befunde in Bezug auf die Fovea lokalisieren können, wie z. B. Reihenschnitte für die Immunhistochemie.

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Protocol

Das institutionelle Prüfungsgremium der University of Alabama in Birmingham genehmigte die Laborstudien, die den Good Laboratory Practices und der Biosicherheitsstufe 2/2+ entsprachen. Alle US-Augenbanken entsprechen dem Uniform Anatomical Gifts Act von 2006 und der US Food and Drug Administration. Die meisten US-Augenbanken, einschließlich Advancing Sight Network, entsprechen den medizinischen Standards der Eye Bank Association of America.

Die Materialtabelle listet die Verbrauchsmaterialien und Ausrüstungen auf. Ergänzendes Material 1 bietet einen Überblick über die Dissektion, die Farbfundusfotografie und das OCT-basierte MMI. Ergänzendes Material 2 enthält Einzelheiten zum OCT-basierten MMI.

1. Kriterien für die Gewebeentnahme

  1. Um die Ausbeute von AMD-Augen in einem Screening von Spendern ohne Papiere zu maximieren, legen Sie die folgenden Kriterien für akzeptable Spender fest: Alter ≥80 Jahre, weiß, nicht diabetisch und ≤6 h Tod bis zur Konservierung (DtoP).
    HINWEIS: DtoP ist definiert als die Zeit zwischen dem Tod und dem Zeitpunkt, an dem das Auge in ein bereitgestelltes Konservierungsmittel gelegt wird, entweder im Krankenhaus oder im Labor.

2. Konservierungsmedium und andere Präparate (Labor)

  1. Stellen Sie 4% phosphatgepuffertes Paraformaldehyd aus 20% Vorrat (gekauft) her. Bereiten Sie 1 l vor, indem Sie 200 ml 20%iges Paraformaldehyd (Verdünnungsfaktor 5) zu 800 ml 0,1 M Sorenson-Phosphatpuffer hinzufügen. Testen und ggf. anpassen, um sicherzustellen, dass der pH-Wert 7,2 beträgt. Bei 4 °C lagern.
  2. Geben Sie 30 ml 4%iges phosphatgepuffertes Paraformaldehyd in 40-ml-Gläser.
  3. Etikettierte 40-ml-Behälter mit Konservierungsmittel an der Augenbank, so dass das Gewebe jederzeit und an jedem Tag gewonnen werden kann.
  4. Für die Aufbewahrung von konservierten Augen stellen Sie aus der 4%igen Lösung 1% Paraformaldehyd her. 1 l wird durch Zugabe von 250 ml 4%igem Paraformaldehyd (Verdünnungsfaktor 4) zu 750 ml 0,1 M Sorenson-Phosphatpuffer hergestellt. Testen Sie den pH-Wert und passen Sie ihn bei Bedarf an. Bei 4 °C lagern.
    1. Aus der 0,2 M Lösung des Sorenson-Phosphatpuffers, pH 7,2, wird 1 l einer 0,1 M Lösung hergestellt, indem 500 ml destilliertes Wasser und 500 ml Sorenson-Puffer kombiniert werden.
    2. Stellen Sie den pH-Wert tropfenweise mit 1 N Salzsäure oder 1 N Natriumhydroxid ein. Bei 4 °C lagern.
  5. Erstellen Sie eine Halterung, um die Augen während der Sektion zu stabilisieren. Füllen Sie eine Petrischale mit erhitztem Zahnwachs, bis es flüssig ist. Wenn es leicht abgekühlt ist, machen Sie mit einem großen Kugellager einen halbkugelförmigen Abdruck und frieren Sie die Schale dann ein, um das Entfernen des Kugellagers zu erleichtern.

3. Augenbank-Methoden

  1. Um eine schnelle Genesung von Forschungsgeweben zu gewährleisten, müssen alle Gewebe schnell wiederhergestellt werden, einschließlich derjenigen, die für die Transplantation vorgesehen sind.
  2. Erhalten Sie, wie gesetzlich vorgeschrieben, innerhalb von 1 Stunde nach dem Tod Sterbeüberweisungen und verfolgen Sie jeden Spender mit einer Überweisungssequenznummer, die dem Gewebe folgt.
  3. Um Fälle mit potenzieller klinischer Dokumentation zu finden, stellen Sie AMD- und augenkrankheitsspezifische Fragen im Forschungsgespräch zur Risikobewertung von Spendern.
  4. Um die Reisezeit zu minimieren, sollten ganze Globen (im Gegensatz zu Hornhäuten für die Transplantation) in einem kompakten Gebiet (d. h. Stadt und angrenzender Vorort) geborgen werden.
  5. Bringen Sie zwei Gläser mit Konservierungsmittel (gepuffertes 4%iges Paraformaldehyd) zur Gewebegewinnung in das Krankenhauszimmer des Verstorbenen (anstatt darauf zu warten, dass der Leichnam in eine Leichenhalle gebracht wird).
  6. Kommunizieren Sie vor und während der Genesung mit den Ermittlern, um die Lieferung und den Zeitpunkt zu bestätigen.
  7. Sammeln Sie die Globen vor Ort im Krankenhaus, öffnen Sie sie mit konsequenten Handhabungsmethoden und tauchen Sie das geöffnete Auge in Konservierungsmittel (Abbildung 1).
    1. Halten Sie das herausgeschnittene Spenderauge mit einer Hülle aus Mull, die durch einen Hämostaten stabilisiert wird, an Ort und Stelle.
    2. Um die Entfernung der Hornhaut mit einem 2 mm breiten Sklera-Rand zu erleichtern, verwenden Sie einen Trepan mit einem Durchmesser von 18 mm, um den Globus einzuritzen.
    3. Um die Hornhaut mit einem begleitenden Sklera-Rand zu befreien, schneiden Sie mit einer federbelasteten Schere mit gebogenen Spitzen entlang des geritzten Kreises, während Sie den Bulbus mit der Hämostat-Gaze stabilisieren.
    4. Heben Sie die Hornhaut von der Lederhaut ab und legen Sie die Iris und den Ziliarkörper frei.
    5. Um das Eindringen des Konservierungsmittels in die Glaskörperkammer zu erleichtern, machen Sie einen 2 mm langen Schlitz in der Iris senkrecht zum Pupillenrand. Die Augen werden in Probengläser mit 30 ml Konservierungsmittel bei 4 °C gegeben und auf nassem Eis ins Labor überführt.
  8. Übermitteln Sie anonymisierte Spenderinformationen elektronisch von der Augenbank an die Datenbank des Forschungslabors.
    HINWEIS: In der Datenbank werden die Überweisungsnummer, die Gewebenummer der Augenbank und die Labor-ID-Nummer für die Nachverfolgung sowie andere relevante Informationen gespeichert.

4. Gewebevorbereitung für die Ex-vivo-Farbfundusfotografie

  1. Verwenden Sie zwei Stereomikroskope, eines für die Dissektion und eines für die Farbfundusfotografie.
    HINWEIS: Verwenden Sie für die Durchleuchtung zur Visualisierung von Pigmentveränderungen eine Basis für die Dunkelfeldmikroskopie.
  2. Entfernen Sie die Reste des vorderen Augenabschnitts (Iris und Linse). Um das Auge während der Präparation zu stabilisieren, legen Sie es in die mit Wachs gefüllte Petrischale (Ergänzungsmaterial 1, Objektträger 7-8). Um zu verhindern, dass der Ziliarkörper und die anhaftende Netzhaut in die Glaskörperhöhle kollabieren, minimieren Sie die Störung des Rings aus dickem Glaskörper, der am Ziliarkörper (Glaskörperbasis) befestigt ist.
  3. Markieren Sie den übergeordneten Pol zur Orientierung. Legen Sie den Globus mit der Vorderseite nach unten in die Schüssel. Finde die Ansatzsehnen des oberen Rektus und des oberen schrägen Muskels. Tragen Sie mit einem Holzapplikator sparsam eine Markierungsfarbe in einer Linie von 10 mm in anteriorer bis posteriorer Richtung auf (d. h. senkrecht zum Sehnenansatz des M. rectus superior).
  4. Füllen Sie den Fundus vor dem Fotografieren mit kaltem Sorensen-Phosphatpuffer.
  5. Setzen Sie eine 1 mm große Rubinperle als interne Maßstabsleiste in den Fundus ein, die in jedem Bild27 erscheint.
  6. Nehmen Sie Farbbilder mit einer Spiegelreflexkamera auf, die an einem Stereomikroskop mit Ringblitz montiert ist. Verwenden Sie Trans-, Epi- und Blitzbeleuchtung in jeder der drei Standardvergrößerungen, um Bilder aufzunehmen, die bestimmte Bereiche hervorheben sollen (Ergänzungsmaterial 1, Folie 11): 1) den Fundus bis zum Äquator, 2) den hinteren Pol (Gefäßarkaden, Sehnervenkopf, Fovea) und 3) die Fovea innerhalb der Makula lutea (gelber Fleck).

5. Vorbereitung für die Ex-vivo-Farbfundusfotografie

  1. Schalten Sie die Kamera und den Monitor ein. Schließen Sie den Fernauslöser an und lassen Sie den Aktuator im HDMI-Monitor (High Definition Multimedia Interface) der Kamera/des Fernsehers (TV) und des Anzeigekabels los.
  2. Stellen Sie die Kameraeinstellungen auf die manuelle ISO-Funktion und die Spiegelvorauslösung ein (verriegelt, um Vibrationen zu reduzieren).
    Anmerkungen: Die Einstellungen der verwendeten Kamera finden Sie in der Bedienungsanleitung des Herstellers. Lernen Sie von der Kameraanzeige die Über-/Unterbelichtungseinstellungen in Bezug auf das Histogramm und die Belichtungsanzeigen.
  3. Ordnen Sie zwei Lichtquellen mit jeweils zwei flexiblen Lichtleitern, die senkrecht zueinander angeordnet sind, für die Beleuchtung in den vier Himmelsrichtungen auf dem Mikroskoptisch an (Zusatzmaterial 1, Seite 10).
  4. Schalten Sie die Epi-Illumination-Lichtquellen auf volle Leistung ein.
    HINWEIS: Es ist hilfreich, aber nicht notwendig, eine schwarze Filzabdeckung um die Bühne herum zu haben, um die Licht-/Blitzstreuung für den Fotografen zu begrenzen.
  5. Führen Sie am Präpariermikroskop den hinteren Pol mit einer Pinzette in einen mit Puffer gefüllten 30-ml-Quarztiegel ein. Lassen Sie das Gewebe auf den Boden sinken. Führen Sie eine Versteifung, z. B. einen Gewebeschwamm, zwischen das Auge und die Wand des Tiegels ein, um Bewegungen zu verhindern. Führen Sie die 1 mm Rubinperle in den hinteren Pol ein.
    HINWEIS: Die Perle kann in die Sehnervenschale fallen.
  6. Setzen Sie den Globus vorsichtig im Tiegel auf den Stereomikroskoptisch und beobachten Sie den inneren Augenhintergrund durch die Mikroskopokulare. Richten Sie das Auge mit der niedrigsten Vergrößerung aus, indem Sie die Gewebemarkierung an der 12-Uhr-Position, den Sehnervenkopf (ONH) und die Fovea 5° unterhalb des ONH identifizieren. Drehen Sie das Auge so, dass die Fovea um 5° unter eine Linie durch den ONH fällt.
    HINWEIS: Wenn es sich um ein rechtes Auge handelt, befindet sich das ONH rechts von der Fovea, wie durch das Okular des Mikroskops gesehen. Wenn es sich um ein linkes Auge handelt, befindet sich das ONH links von der Fovea.
  7. Schalten Sie die Remote-Monitoranzeige von der Kamera aus ein. Stellen Sie sicher, dass der Schieberegler für den Strahlteiler des Mikroskops so eingestellt ist, dass er durch den Fotoanschluss und nicht durch den Anschluss für das Okular beobachtet. Bereiten Sie sich je nach Licht- und Spiegelweg darauf vor, das Gewebe auf dem Tisch um 180° zu drehen, um die richtige Ausrichtung zu gewährleisten.

6. Bildaufnahme mittels Ex-vivo-Farbfundusfotografie

  1. Stellen Sie bei eingeschalteter Epibeleuchtung die Vergrößerung so ein, dass der gesamte 18-mm-Trepanschnitt das gesamte Sichtfeld einnimmt. Erhöhen Sie die Vergrößerung, so dass es möglich ist, auf den Boden der Fovealgrube zu fokussieren. Verringern Sie die Vergrößerung auf die vorherige Einstellung.
  2. Stellen Sie die ISO-Einstellungen im Bereich von 1.600 bis 3.000 so ein, dass die Belichtungszeiten im mittleren Bereich des Messgeräts der Kamera liegen.
  3. Drücken Sie den Fernauslöser. Achten Sie darauf, dass der Spiegel in der oberen Position einrastet. Drücken Sie den Auslöser erneut, um die Belichtung zu aktivieren.
  4. Beobachten Sie das Bild auf dem Monitor, wobei die voreingestellten Metadaten Rot, Grün, Blau (RGB) und ein Farbhistogramm für die richtige Belichtung anzeigen. Wenn die Belichtung akzeptabel ist, fahren Sie fort; Wenn nicht, löschen Sie, werten Sie die Parameter erneut aus und erstellen Sie ein neues Image.
  5. Schalten Sie die Schwanenhalslampen für die Epi-Beleuchtung aus, um Drusen hervorzuheben, und schalten Sie den Blitz mit einer Belichtungszeit von 1/4 s, einer Kameraverschlusszeit von 1/250 s und einem ISO-Wert von 100-320 ein. Stellen Sie die Blitzgeschwindigkeit auf die Standardeinstellung ein oder ändern Sie sie während der Ersteinrichtung der Kamera. Nehmen Sie ein Bild auf und überprüfen Sie das Histogramm auf die richtige Belichtung.
  6. Schalten Sie den Blitz aus und schalten Sie die Lichtquelle für die Durchleuchtung ein. Setzen Sie den ISO-Wert auf über 5.000 zurück und stellen Sie sicher, dass die Belichtungszeit aufgrund möglicher Vibrationen im fotografischen System nicht unter 1/30 s sinkt. Nehmen Sie ein Bild auf und überprüfen Sie das Histogramm auf die richtige Belichtung.
  7. Erhöhen Sie die Vergrößerung, um sowohl die ONH als auch die Fovea im Sichtfeld zu sehen. Schalten Sie die Epi-Beleuchtungslampen ein. Stellen Sie den ISO-Bereich auf 1.600-3.000 ein. Achten Sie darauf, dass die Belichtungszeiten im mittleren Bereich der Kamera liegen.
  8. Schalten Sie die Epi-Beleuchtungslampen aus und schalten Sie den Blitz mit einer Belichtungszeit von 1/4 s, der voreingestellten Verschlusszeit der Kamera auf 1/250 s und dem ISO-Wert auf 400-800 ein. Nehmen Sie ein Bild auf und überprüfen Sie das Histogramm auf die richtige Belichtung.
  9. Schalten Sie den Blitz aus und schalten Sie die Durchleuchtung mit der Dunkelfeldbasis ein. Setzen Sie den ISO-Wert auf über 5.000 zurück. Stellen Sie sicher, dass die Belichtungszeit aufgrund möglicher Vibrationen im fotografischen System nicht länger als 1/30 s ist. Erfassen Sie ein Bild und überprüfen Sie, ob ein korrektes Histogramm vorhanden ist.
  10. Schalten Sie die Durchleuchtung aus und schalten Sie die Epibeleuchtungslampen wieder ein.
  11. Erhöhen Sie die Vergrößerung auf die in Schritt 6.7 verwendete. Fokussieren Sie bei Bedarf neu.
  12. Erhöhen Sie den ISO-Wert im Bereich von 3.000 bis 6.000 und passen Sie die Belichtungszeit so an, dass sie in den richtigen Belichtungsbereich der Kamera fällt. Erfassen Sie ein Bild.
    HINWEIS: Die Rubinperle wird möglicherweise nicht mehr im Sichtfeld angezeigt. Wenn dies der Fall ist, nehmen Sie separate Bilder der Perle bei dieser Vergrößerung als Referenz auf.
  13. Schalten Sie die Epi-Illuminationslampen aus. Schalten Sie den Blitz mit einer Belichtungszeit von 1/4 s und einer Verschlusszeit von 1/250 s ein. Stellen Sie die Blitzgeschwindigkeit auf die Standardeinstellung ein oder ändern Sie sie während der Ersteinrichtung der Kamera und stellen Sie den ISO-Wert auf 500-1.000 ein. Erfassen Sie das Bild. Überprüfen Sie das Histogramm auf die richtige Belichtung.
  14. Schalten Sie den Blitz aus und schalten Sie die Durchleuchtungslampen ein. Setzen Sie den ISO-Wert auf über 8.000 zurück, um eine schnellere Belichtungszeit mit einem empfindlicheren Bildsensor zu ermöglichen. Stellen Sie sicher, dass die Belichtungszeit aufgrund möglicher Vibrationen im fotografischen System nicht unter 1/30 s sinkt. Erfassen Sie ein Bild.
  15. Exportieren Sie die Bilder von der Kamera auf einen Computer. Überprüfen Sie die Bilder, bevor Sie die Probe aus dem Mikroskoptisch nehmen, falls einige erneut aufgenommen werden müssen.

7. Überblick über die Bildaufnahme für Ex-vivo-OCT und Scanning-Laser-Ophthalmoskopie (SLO)

  1. Für die Spektralbereichs-OCT legen Sie die Globen in Phosphatpuffer in einen speziellen Augenhalter mit einer Kammer mit einer 60-Dioptrien-Linse35. Befestigen Sie den Augenhalter an einer Halterung eines klinischen OCT-Bildgebungsgeräts und befestigen Sie ihn an der Stelle, an der ein Patient seine Stirn ablegen würde. Das OCT-Gerät fügt automatisch eine Maßstabsleiste in jedes Bild ein.
  2. Gleichzeitig werden die Globen mit demselben Gerät und mit dem Auge noch in der Halterung mit einem scannenden Laser-Ophthalmoskop (SLO) mit Nahinfrarot-Reflexion (NIR, von der Verweilsoftware als Ortungsbild verwendet), 488-nm-Anregungsfundus-Autofluoreszenz (FAF) und rotfreier (RF) Reflexion abgebildet.
    HINWEIS: Die 787 nm Anregung FAF in diesem Gerät ist nur gelegentlich geeignet, da ein Strahlteiler die Lichtdurchlässigkeit zum SLO reduziert. Aus diesem Grund wird ein zweites Gerät für 787 nm FAF-Bilder (siehe nächster Punkt) verwendet.
  3. Bilden Sie die Globen separat, aber mit dem Auge noch in der Augenhalterung ab, um die RPE-Störung36 mit 787 nm FAF zu erkennen, indem Sie ein separates Gerät verwenden, das diese Modalität gut anzeigt.

8. Bildaufnahmeprotokoll für ex vivo OCT/SLO (siehe Folien im Zusatzmaterial 2)

  1. Markieren Sie den oberen Rektusmuskel mit Gewebemarkierungsfarbstoff. Schalten Sie den Laser ein (blauer Pfeil, Zusatzmaterial 2, Seite 1).
  2. Positionieren Sie den OCT-Kopf gemäß Seite 2 des Zusatzmaterials 2, indem Sie die gesamte Einheit in zwei Achsen in Bezug auf die Basis bewegen (grüner Pfeil) und dann die Höhe (y) erhöhen, indem Sie den Joystick im Uhrzeigersinn/gegen den Uhrzeigersinn drehen (cw/ccw, blaue Pfeile). Fokussieren Sie das Bild, indem Sie den Knopf (orangefarbener Pfeil) drehen, wobei sich der schwarze Hebel in Position R (*) befindet. Verriegeln Sie das Gerät, indem Sie die Rändelschraube (lila Pfeil) sichern.
  3. Setzen Sie die Öse in die Halterung ein und stabilisieren Sie sie von hinten mit Abstandshaltern (Ergänzungsmaterial 1, Seite 13). Üben Sie so wenig Druck wie möglich aus, um eine Verbeulung der Lederhaut zu vermeiden. Richten Sie sich so aus, dass die Gewebemarkierung für den oberen Rektusmuskel nach oben zeigt.
    Anmerkungen: Der ungefähre Abstand von der Vorderseite des Augenhalters zum OCT-Gerät beträgt 25 mm.
  4. Öffnen Sie die proprietäre Visualisierungs- und Analysesoftware für das OCT-Gerät. In der linken Spalte wird eine Patientenliste angezeigt. Die Augenspender, die durch eine interne Codenummer indiziert sind, sind die "Patienten". Weitere Informationen finden Sie in der Bedienungsanleitung des Herstellers.
  5. Wählen Sie das Symbol Neuer Patient aus. Vervollständigen Sie die Patientendaten nach Bedarf. Wählen Sie OK aus. Verwenden Sie ein logisch geordnetes Nummerierungssystem für einzelne Augen, z. B. YYYYNNNL,R_agesex. Dies könnte z. B. 2017016R_97F sein.
  6. Nachdem Sie die Dateneingabe im folgenden Fenster fortgesetzt haben, drücken Sie OK. Wählen Sie den Operator und die Studie aus dem Dropdown-Menü aus.
    HINWEIS: Die eingegebenen Informationen werden in den exportierbaren Metadaten angezeigt.
  7. Nachdem Sie einen leeren Bildschirm angezeigt haben, berühren Sie die gelbe Taste, um die Bildaufnahme zu starten.
  8. Drücken Sie IR + OCT (Nahinfrarot-Reflexion + OCT). Lassen Sie den Laser ein Live-SLO-Bild des Fundus und des OCT-B-Scans aufnehmen.
    1. Legen Sie die richtige anatomische Position auf der Grundlage von ONH und Fovea fest und verwenden Sie einen hölzernen Applikator, um die Augenposition im Halter anzupassen. Drehen Sie auf dem Bedienfeld die schwarze runde Taste, um die Intensität einzustellen.
    2. Drücken Sie die gleiche Taste, um durchschnittlich 9-100 Bilder zu erzeugen (rote Pfeile; 9 sind ausreichend, 100 sehen cremig aus). Wenn das Gerät richtig ausgerichtet ist, sollte der Augenhintergrund scharf sein und das OCT-B-Bild sollte im oberen Drittel des Displays erscheinen (Zusatzmaterial 2, Seite 9, doppelter roter Pfeil).
    3. Bewegen Sie auf dem Fundusbild mit dem Cursor die blaue Linie, um die Fovea zu zentrieren (Ergänzungsmaterial 2, Seite 9, weißer Pfeil). Drücken Sie auf Acquire.
      HINWEIS: Weitere Standardschaltflächen sind Retina, EDI (aus) und Zeilenscan.
  9. Drücken Sie RF + OCT für die nächste Erfassung. Überprüfen Sie die Position erneut, um sicherzustellen, dass sich das Bild nicht verschoben oder verschlechtert hat. Drücken Sie die schwarze Taste, um den Mittelwert zu bilden. Drücken Sie auf Acquire.
  10. Schalten Sie den internen Würfel für die Autofluoreszenzbildgebung auf die Anregungswellenlängen 488 nm und 787 nm um (Zusatzmaterial 2, Seite 10).
    HINWEIS: Die Würfelposition nach dem Schalter wird angezeigt.
  11. Wählen Sie den Autofluoreszenzmodus . Überprüfen Sie die Ausrichtung erneut. Drücken Sie auf Acquire.
  12. Bei Verdacht auf RPE-Störung und -Atrophie wählen Sie ICGA (Indocyanin-Grün-Angiographie) für eine 787-nm-Autofluoreszenz. Überprüfen Sie die Augenposition erneut, und drücken Sie dann auf Erfassen.
    HINWEIS: Ein Fundusbild erscheint in dieser Modalität oft nicht, da der interne Würfel den Strahl abschwächt.
  13. Schalten Sie den internen Würfel wieder auf R für IR und rotfreie Bildgebung für die Volumenerfassung um.
    HINWEIS: Die Position des Würfels nach dem Schalter ist auf Seite 13 des Zusatzmaterials 2 dargestellt.
  14. Um die OAT-Volumes abzurufen, wählen Sie IR und die Volume-Einstellung. Passen Sie alle Einstellungen auf Seite 14 des Zusatzmaterials 2 an, indem Sie die entsprechenden Tasten am Steuermodul umschalten (30°-Makulawürfel, 30 μm Abstand, Mittelung je nach experimentellen Anforderungen).
  15. Beachten Sie, dass die Nahinfrarot-Reflexionsfundusansicht mit blauen B-Bild-Linien bedeckt ist. Überprüfen Sie erneut die OCT-Position im oberen Drittel des rechten Fensters. Drücken Sie die Taste "Erfassen" auf dem Steuermodul und warten Sie 5 Minuten, bis der Volume-Scan abgeschlossen ist. Wenn die Bildaufnahme abgeschlossen ist, wählen Sie EXIT. Die Bilder werden gespeichert (roter Pfeil).
    HINWEIS: Die blauen Linien begrenzen die in der vorherigen Ansicht angezeigten Abstände in Mikrometern. Die Scans beginnen mit der Nummerierung von unten (minderwertig) und gehen nach oben. Beachten Sie den Verlauf der roten Linie.
  16. Lassen Sie den Computer die aufgenommenen Bilder verarbeiten, die auf dem Bildschirm angezeigt werden (Zusatzmaterial 2, Seite 16).
  17. Wenn Sie die anderen Augen eines Spenders abbilden, ändern Sie nicht die Position der Halterung zwischen den Augen. Wenn zuerst das linke Auge abgebildet wird, werden die Ergebnisse in der Spalte OD (rechtes Auge) angezeigt. Klicken Sie mit der rechten Maustaste, um alle Bilder auszuwählen, und wählen Sie dann Exchange OS/OD aus. Die Bilder werden in die Spalte "Betriebssystem" verschoben.
  18. Drücken Sie > Fenster > Datenbank auswählen. Der Bildschirm ist standardmäßig auf Panel 6 eingestellt, wobei das Spenderauge in der rechten Spalte hinzugefügt wird (Zusatzmaterial 2, Seite 18). Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf den Patienten im Dropdown-Menü, wählen Sie Batch und exportieren Sie die E2E-Datei.
  19. Navigieren Sie zu dem vordefinierten Ordner, der auf dem Desktop für Dateiübertragungen erstellt wurde. Wählen Sie OK aus. Der Ordner enthält die E2E-Dateien, die auf eine externe Festplatte kopiert und archiviert werden sollen.
  20. Bringen Sie das Auge in seiner Halterung zum scannenden Laserophthalmoskop, das hauptsächlich für die Autofluoreszenz von 787 nm verwendet wird.
    HINWEIS: Informationen zur Erfassung und Archivierung der Bilder finden Sie im Benutzerhandbuch des Herstellers.
  21. Schalten Sie den Computer und den Laser ein.
  22. Wählen Sie das Symbol Neuer Patient aus. Vervollständigen Sie die Patientendaten nach Bedarf.
  23. Um das Augendatenblatt unverändert zu lassen, drücken Sie OK. Da die C-Kurve unverändert bleibt, drücken Sie Weiter.
  24. Wählen Sie den Lernmodus und geben Sie bei Bedarf das Kennwort ein. Halten Sie die C-Kurve bei 7,7 mm. Drücken Sie OK.
  25. Wählen Sie Weiter aus, um die C-Kurve zu überprüfen. Wählen Sie die gelbe Anzeige, um die Kamera zu starten.
  26. Wählen Sie die R-Position aus. Richten Sie den Globus aus und richten Sie ihn aus. Wählen Sie den IR-Modus , um wie oben beschrieben zu fokussieren und auszurichten.
  27. Richten Sie den Kamerakopf aus, indem Sie das gesamte Gerät in zwei Achsen in Bezug auf den Sockel bewegen (Zusatzmaterial 2, Seite 28, grüner Pfeil) und dann die Höhe (y) des Geräts erhöhen (blaue Pfeile). Fokussieren Sie das Bild durch Drehen des Knopfes (orangefarbener Pfeil). Der schwarze Hebel befindet sich in Stellung R (*). Nachdem dieser Kopf in Position ist, verriegeln Sie das Gerät, indem Sie die Rändelschraube (lila Pfeil) drehen.
  28. Beachten Sie, dass der Bildschirm wie auf Seite 29 des Zusatzmaterials 2 gezeigt angezeigt wird.
  29. Bewegen Sie den Wahlknopf von R nach A. Wählen Sie ICGA (um eine Autofluoreszenz von 787 nm zu erreichen) in Blau, 100 % Intensität, einem Sichtfeld von 30° und einphasiger Bildgebung.
    HINWEIS: Wie der Farbstoff Indocyaningrün wird Melanin durch Licht mit einer Wellenlänge von 787 nm angeregt.
  30. Beachten Sie, dass der Bildschirm wie auf Seite 31 des Zusatzmaterials 2 dargestellt angezeigt wird. Drücken Sie auf die schwarze Disc, um den Mittelwert zu bilden, und wählen Sie dann Erfassen aus.
  31. Wählen Sie Fenster > Datenbank. Wählen Sie E2E-Dateien vom SLO-Gerät importieren aus. Diese Dateien werden auf einer externen Festplatte gespeichert und auf den Desktop hochgeladen.
  32. Wählen Sie Öffnen aus. Aktivieren Sie die Standardmarkierungen, und wählen Sie OK aus.
  33. Beachten Sie, dass der Patient jetzt zwei Registerkarten hat: eine mit den Bildern, die mit dem SLO aufgenommen wurden (blauer Pfeil), und die andere Registerkarte mit den Bildern, die mit dem OCT-Gerät aufgenommen wurden (roter Pfeil) (Zusatzmaterial 2, Seite 34).
  34. Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf das 786 nm (ICGA)-Bild und exportieren Sie das Bild in eine Datei mit der Bezeichnung SLO 786 auf dem Desktop.
  35. Um das 786-nm-Autofluoreszenz-SLO-Bild zu speichern, wählen Sie den Patienten aus und klicken Sie mit der rechten Maustaste, um die Bilder als RAW-Dateien (für .vol-Dateien) in einen Ordner auf dem Desktop zu exportieren.
  36. Um Bilder vom OAT-Gerät zur Übertragung auf den Archivcomputer zu exportieren, kopieren Sie sie aus RAWEXPORT in einen Ordner mit der Bezeichnung RAW.

9. Überprüfung der Bildgebung

  1. Stellen Sie die Bilder (Farbe, .vol-Datei, SLO-Bilder) in Ordnern für jeden Spender mit Unterordnern für jedes Auge zusammen und indizieren Sie die Ordner nacheinander nach Labor-ID.
  2. Erfassen Sie die Gewebeabdrücke (Qualität, Pathologie) in einer Datenbank für einen standardisierten Bericht.
  3. Überprüfen Sie die exportierten OCT-Volumes mit einem hauseigenen ImageJ-Plugin.
    1. Finden Sie das Fovea-Zentrum, das an der Mitte der fovealen Vertiefung, dem nach innen gerichteten Anstieg der äußeren Netzhautbänder oder der dünnsten Stelle zu erkennen ist. In den meisten Fällen fallen diese zusammen, aber nicht immer, da dies von der fovealen Erhaltung, der individuellen Variabilität und dem Vorhandensein einer Pathologie abhängt.
    2. Finden Sie einen Standard-Scan in der oberen Perifovea (2 mm/67 B-Bilder entfernt in oberer Richtung; d. h. steigende Scan-Zahlen).
    3. Speichern Sie einen .tif Stapel des gesamten Volumes, um in Zukunft schnell darauf zurückgreifen zu können.
    4. Blättern Sie durch das gesamte OCT-Volume, beginnend mit Scan 1 (minderwertig), während Sie die Scannummern aufzeichnen, in denen Merkmale erkannt werden.
    5. Kontrollieren Sie neben der Makula auch den peripapillären Bereich.
      HINWEIS: Die peripapilläre chorioretinale Atrophie bei älteren Augen umfasst eine ausgeprägte basale laminare Ablagerung und Neovaskularisation. Dies ist ein häufiger Bereich der Pigmentveränderung bei kurzsichtigen Augen und Glaukomen sowie bei Alterung und AMD37.
  4. Untersuchen Sie die Farbfotos und verknüpfen Sie alle Ergebnisse nach Möglichkeit mit denen, die OCT gesehen hat.
    HINWEIS: Im Allgemeinen ist es einfacher, die meisten Ergebnisse zuerst im OCT zu sehen. Farbfotos bieten einen großen Überblick über den Bereich außerhalb des Bereichs auf dem SLO, die Aderhautpigmentierung einschließlich Nävi, das Vorhandensein von Häm und harten Exsudaten sowie schwarzes Pigment bei neovaskulärer AMD. Dunkles Pigment in der Fovea kann lose Melanosomen aus dem vorderen Augenabschnitt darstellen und sollte vorsichtig mit einem Puffer mit einer Pipette abgewaschen werden.
  5. Untersuchen Sie die SLO-Bilder und verknüpfen Sie alle Ergebnisse nach Möglichkeit mit denen, die von OCT gesehen wurden.
  6. Speichern Sie Standard-B-Bilder an der Fovea und Perifovea, zusätzliche B-Bilder mit bemerkenswerter Pathologie oder anderen Merkmalen und SLO-Bilder in einem Pathologiebericht.
  7. Kategorisieren Sie die Augen wie folgt: Unauffällig, Fragwürdig, Früh-Intermediäre AMD, Atrophische AMD, Neovaskuläre AMD, Andere, Unbekannt, Nicht gradierbar, Nicht erfasst. "Fragwürdig" wird verwendet, wenn nicht klar ist, ob die Änderungen schwerwiegend genug für eine weitere Kategorisierung sind. "Nicht bewertbar" ist für Augen reserviert, denen brauchbare OCT-Scans fehlen, wie z. B. solche mit stark abgelöster Netzhaut. "Not Recorded" ist Augen vorbehalten, die sofort nach Erhalt ohne Fotografie bearbeitet werden.
  8. Verwenden Sie diese Kriterien für AMD: schwere RPE-Veränderung mit Drusen- oder subretinalen Drusenoidablagerungen, mit oder ohne Anzeichen einer Neovaskularisation, wie Flüssigkeit oder Fibrose, und ohne Hinweise auf andere Ursachen (aktualisiert von Curcio et al.10, um SDDs zu berücksichtigen).
    HINWEIS: Die endgültige Diagnose wird durch eine histologische Analyse bestätigt.

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Representative Results

Tabelle 1 zeigt, dass zwischen 2016 und 2017 184 Augen von 94 weißen nicht-diabetischen Spendern im Alter von >80 Jahren geborgen wurden. Die mittlere Sterbezeit bis zur Konservierung betrug 3,9 h (Spanne: 2,0-6,4 h). Von den 184 untersuchten Augen hatten 75 (40,2%) eine sichere AMD. Die folgenden Kategorien wurden identifiziert: Unauffällig (39,7 %), Fragwürdig (11,4 %), Früh-Intermediäre AMD (22,8 %), Atrophisch (7,6 %), Neovaskulär (9,8 %), Sonstige (8,7 %) und Unbekannt/Nicht erfasst/Nicht bewertbar (<1 %). Abbildung 2, Abbildung 3, Abbildung 4 und Abbildung 5 zeigen eine multiskalige, multimodale ex vivo Bildgebung von außergewöhnlich gut erhaltenen Augen aus dieser Serie. Die Augen wurden in Zusammenarbeit mit einem auf Netzhauterkrankungen spezialisierten Augenarzt (J.A.K.) untersucht. Während einige Augen einzelne Merkmale besser zeigten als andere, wurden diese Hüllen aufgrund der rundum hohen Qualität ausgewählt.

Wie38 beschrieben, unterscheidet sich die ex-vivo-Farbfotografie von der entsprechenden in-vivo-Fotografie. Netzhautödeme und/oder Netzhautablösungen können die Sichtbarkeit des hinteren Pigmentgewebes verringern. Beobachtungen bei frischen Augen deuten darauf hin, dass diese Veränderungen post mortem auftreten und sich bei rechtzeitiger Fixierung nicht merklich verschlimmern. Außerdem entleeren sich die Aderhautgefäße nach dem Tod. Aufgrund eines wellenförmigen Hintergrunds aus blassen Gefäßen und dunklem interstitiellem Gewebe sollte die Beurteilung von Pigmentvariationen in der Ebene des RPE durch andere Modalitäten als die Farbe unterstützt werden. In der Ex-vivo-OCT stehen mehr Informationen zur Verfügung als in der Farbfotografie. Ex vivo Auch die OCT unterscheidet sich deutlich von der in vivo OCT. Zu den Hauptunterschieden gehören die insgesamt erhöhte Reflektivität des Gewebes, insbesondere in der inneren Netzhaut, die gleichmäßige Reflektivität einiger Bänder (Nervenfaserschicht, innere und äußere plexiforme Schicht, RPE), die geringere Sichtbarkeit der Aderhautdetails, insbesondere unter der ödematösen Netzhaut, und die Sichtbarkeit von Gewebeschichtablösungen (siehe unten). Die äußeren retinalen hyperreflektiven Banden, an denen die Photorezeptoren und die RPE (Ellipsoidzone, EZ; Interdigitation Zone, IZ) beteiligt sind, sind ex vivo inkonsistent sichtbar und werden in diesem Zusammenhang nicht als Orientierungspunkte verwendet. Der klinische Konsens für die Spektraldomänen-OCT verwendet den Begriff RPE-Bruch-Membran (BrM)-Bande. Der Begriff RPE-Basallamina (BL)-BrM-Bande wird jedoch bevorzugt, da er das Auftreten basaler laminarer Ablagerungen bei AMD24 berücksichtigt.

Abbildung 2 zeigt eine unauffällige Makula und hyporeflektive große Aderhautgefäße mit einem reflektierenden RPE-BL-BrM-Band zwischen den beiden. Ein großes Gefäß in der inneren Netzhaut wirft einen Schatten auf die hinteren Schichten. IPL und OPL reflektieren mäßig. Beim NIR SLO sind sowohl die retinalen als auch die choroidalen Gefäße sichtbar. Der rotfreie Reflexions-SLO eignet sich am besten für Merkmale der inneren Netzhaut und der vitreoretinalen Grenzflächen wie die bogenförmigen Fasern und das papillomakuläre Bündel des NFL. Bei normalen Augen zeigt die 488 nm Autofluoreszenz SLO einen Bereich mit insgesamt reduziertem Signal in der zentralen Makula, der auf eine verdickte Parafovea und in einigen Fällen auf die Absorption durch das gelbe Xanthophyllpigment sowie auf eine Hyperautofluoreszenz in den großen Netzhautgefäßen zurückzuführen ist, was auf Bindegewebshüllen hindeutet. Die Autofluoreszenz bei 787 nm zeigt eine kleine Region mit erhöhtem Signal in der zentralen Makula des RPE, ein Signal im Aderhautstroma und hypoautofluoreszierende Streifen, die den Aderhautgefäßen entsprechen.

Abbildung 3 zeigt eine Makula mit früh-intermediärer AMD. Zu den sichtbaren Merkmalen gehören eine weiche Druse (kuppelförmige RPE-Erhebung in der Nähe der Fovea), SDDs (intermittierendes Reflexionsvermögen mit einem gezähnten Erscheinungsbild innerhalb des RPE-BL-BrM-Bandes), hyperreflektierende Herde (HRF, reflektierendes Material mit dem gleichen Reflexionsvermögen wie das RPE in der Schicht, das sich in der Netzhaut befindet) und vitelliforme Veränderung (eine nach innen gerichtete Ausdehnung der RPE-Organellen, sowohl intrazellulär als auch extrazellulär, in Verbindung mit basalen laminaren Ablagerungen39). Die Farbfotografie zeigt eine starke Pigmentierung, die der vitelliformen Läsion entspricht, umgeben von reduzierter Pigmentierung. Weder die Drusen noch die SDDs sind farblich deutlich sichtbar. Der NIR-Reflexionsgrad zeigt das Reflexionsvermögen in der Fovea. Die Autofluoreszenz bei 488 nm Anregung zeigt ein gesprenkeltes Signal in der Fovea. SDDs erscheinen gelegentlich auf SLO-Modalitäten; Dies ist wahrscheinlicher, wenn die SDDs reichlich vorhanden sind, und SDDs sind am leichtesten als ein Punktionsmuster in regelmäßigen Abständen zu sehen (siehe Spaide und Curcio19, Abbildung 6). Das Muster, das der Fovea in Abbildung 3I überlegen und zeitlich ist, ist keine SDD, da es unregelmäßig und in einer oberflächlichen Fokusebene lokalisiert ist. Alle En-face-Modalitäten zeigen feine Falten, die von der Fovea ausgehen. Bei weniger gut erhaltenen Augen können ähnliche Falten groß genug sein, um bei den geringsten Sehvergrößerungen sichtbar zu sein.

Abbildung 4 zeigt eine Makula mit atrophischer AMD. Die Farbfundusfotografie zeigt zirkuläre atrophische Bereiche, zentrale Hyperpigmentierung und kleine hyperpigmentierte Punkte in der Parafovea, die in der OCT der HRF auf der Ebene der Henle-Faserschicht-äußeren Kernschicht (HFL-ONL) entsprechen. Darüber hinaus kann bei OCT eine niedrige, flache RPE-Erhöhung eine basale laminare Ablagerung, eine nicht-exsudative Typ-1-Neovaskularisation oder beides darstellen. Eine Atrophie im fovealen B-Bild ist erkennbar an der Absenkung des HFL-ONL, einem Bereich der Hypertransmission (Lichteinfall bis zur Aderhaut), einer vitelliformen Veränderung mit verstärkter Abschattung im fovealen Zentrum und einer HRF, die Schatten wirft. Bei diesem Auge zeigt die NIR-Reflexion hyperreflektierende Flecken in der Fovea. Die Autofluoreszenz bei 787 nm Anregung zeigt effektiv ein Signal, das einer fovealen Hyperpigmentierung und dem Fehlen eines Signals in den zirkulären atrophischen Bereichen entspricht. Die rotfreie und 488 nm Autofluoreszenz zeigen die inneren Netzhautmerkmale.

Abbildung 5 zeigt eine Makula mit Makulaatrophie infolge neovaskulärer AMD. Die Farbfundusfotografie zeigt eine schwarze Pigmentierung innerhalb des atrophischen Bereichs. Die OCT zeigt eine Atrophie durch das Absacken (Absinken) von HFL-ONL und eine erhöhte Hypertransmission. Der foveale B-Scan zeigt einen Hügel aus subfovealem hyperreflektivem Material und intraretinalen Zysten. Der Nahinfrarot-Reflexionsgrad zeigt ein Reflexionsvermögen im atrophischen Bereich aufgrund des Verlusts von RPE und Aderhautgefäßen. Ein kleiner, stark reflektierender Bereich in der Fovea ist farblich nicht sichtbar. Der rotfreie Reflexionsgrad zeigt retinale Gefäße und innerhalb einer ringförmigen Zone Aderhautgefäße. Die Autofluoreszenz (488 nm) zeigt deutlich eine annähernd kreisförmige atrophische Grenze und Inseln beginnender Atrophie. Ein zentraler, signalloser Bereich ist von einem Ring mit mäßigem Signal und sichtbaren Aderhautgefäßen umgeben.

Abbildung 6 zeigt häufige Artefakte in der Ex-vivo-OCT-Bildgebung. Ödeme können in der inneren Netzhaut hervortreten und Vorwölbungen und Falten durch die Fovea erzeugen (Abbildung 6A,I). Mechanische Schäden können durch Traktion auf den Glaskörper oder durch direkten Kontakt der Netzhaut mit den Präparierwerkzeugen auftreten, was zur Dislokation von Material und manchmal zum Verlust dieses Materials führt (Abbildung 6F,G). Ablösungen können entlang mehrerer Gewebeebenen auftreten und relative Zugkräfte zwischen den Schichten darstellen, die auch in vivo auftreten. Jede Ablösung kann sich bei der weiteren Verarbeitung weiter ausdehnen. Die häufigste Ablösung ist retinal (d. h. zwischen den äußeren Segmenten des Photorezeptors und den apikalen Fortsätzen des RPE) (Abbildung 6B-D,F-I). Die apikalen Fortsätze können sich entweder von den äußeren Segmenten lösen oder bei den RPE-Zellkörpern verbleiben, wie die Histologie bestimmt. Netzhautablösungen können groß und aufgebläht sein ( Abbildung 6 B,D,I) oder schmal und kaum wahrnehmbar (Abbildung 6C,F,G). Eine Ablösung der Bacillarschicht (BALAD40) wurde zuerst im Labor und später in der klinischen OCT festgestellt. BALAD wird auf eine Spaltung durch den myoiden Teil der inneren Segmente des Photorezeptors zurückgeführt, wodurch der ellipsoide Teil des inneren Segments und das äußere Segment an der RPE befestigt sind (Abbildung 6A, D, I). BALAD sollte nicht mit SDD in ex vivo OCT verwechselt werden. Eine dritte Ablösungsebene ist die innere Grenzmembran (ILM), und zwischen der ILM und den verbleibenden Netzhautschichten befindet sich oft reflektierende Flüssigkeit (Abbildung 6A,B,I). Die am wenigsten häufige Ablösung findet sich zwischen der Aderhaut und der Sklera (Abbildung 6C). Die Fovea weist häufig zystoide Räume auf, die ohne unterstützende Beweise, wie z. B. Anzeichen einer Neovaskularisation, nicht als pathologisch angesehen werden sollten (Abbildung 6H). Bei einzelnen B-Bildern können Wellenbewegungen des RPE den Eindruck von Drusen erwecken. Die 3D-Ansicht eines OCT-Volumens verdeutlicht, dass diese entlang der Aderhautgefäße verlaufen (Abbildung 6E,J). Wellenbewegungen können auf unterschiedliche Volumenänderungen zwischen den Gefäßen und dazwischenliegenden Stroma nach dem Tod und während der Fixierung zurückzuführen sein.

Um die Qualitätserwartungen zu kalibrieren und die Grenzen der ex vivo OCT zu untersuchen, vergleicht Abbildung 7 die In-vivo-Bildgebung, die Ex-vivo-Bildgebung und die Histologie von drei klinisch dokumentierten Augen mit AMD. Diese drei Augen blieben anders erhalten als in Abbildung 2, Abbildung 3, Abbildung 4 und Abbildung 5. Um die strukturellen OCT-Reflektivitätsquellen zu bestätigen, die subzellulär41 sind, wurden die Augen in Abbildung 7 in 2,5 % Glutaraldehyd und 1 % Glutaraldehyd konserviert, um eine hochauflösende Epoxidharzhistologie und korrelative Elektronenmikroskopie zu ermöglichen. Glutaraldehyd verleiht diesen Proben im Vergleich zu den Proben in Abbildung 2, Abbildung 3, Abbildung 4 und Abbildung 5 eine Opazität. Der Effekt einer kürzeren gegenüber einer längeren DtoP ist offensichtlich (Abbildung 7A-F, 2,1 h vs. Abbildung 7G-I, 8,9 h). Im Auge mit längerer DtoP veränderte das postmortale Ödem die Netzhautkontur und das ILM wurde abgelöst. Die interessierende Pathologie (äußere Netzhauttubulation) war in der Ex-vivo-Bildgebung subtil. Es wurde gefunden, weil die in vivo OCT den relevanten B-Scan lokalisierte und die Aderhautgefäße zugeordnet werden konnten. Bei den beiden Augen mit einer kürzeren DtoP waren einige schwerwiegende Pathologien (Typ 3 Makulaneovaskularisation) sofort erkennbar (Abbildung 7A-C). Andere wurden mit Hilfe von Eye-Tracking gefunden (Abbildung 7D-F).

Figure 1
Abbildung 1: Hornhautexzision aus einem menschlichen Spenderauge zur Immersionsfixierung der Netzhaut. Oben links wird das herausgeschnittene Spenderauge von einer Gazehülle gehalten, die durch einen Hämostaten stabilisiert wird. Oben rechts wird ein 18-mm-Trepan verwendet, um eine kreisförmige Ritze mit der Hornhaut und einem 2 mm breiten Sklera-Rand herzustellen. In der Mitte wird der gekerbte Kreis durch einen Schnitt mit einer federbelasteten gebogenen Schere abgeschlossen, während der Globus stabilisiert ist. unten links sind die Hornhaut und der Sklerarand angehoben, wodurch die Iris (blau) und der Ziliarkörper (hellbraun) freigelegt werden. unten in der Mitte wird die Hornhaut mit dem Rand vollständig abgehoben; Unten rechts wird die Iris senkrecht zum Pupillenrand abgeschnitten, um das Eindringen des Konservierungsmittels in die Glaskörperkammer zu erleichtern. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 2
Abbildung 2: Multimodale ex vivo Bildgebung einer unauffälligen Makula. Eine Makula einer 82-jährigen Spenderin mit einem Sterbeintervall von 1,97 h. (A) Der Fundus des rechten Auges mit entferntem vorderen Augenabschnitt (Epi-Illumination). (B) Nahaufnahme der Makula (Epi-Illumination). (C) Nahaufnahme der Fovea (Epi-Illumination). Die grünen Linien zeigen die Positionen der OCT-B-Bilder in den Feldern D und E an. (D,E) OCT-B-Scans durch die (D) obere Perifovea (E) und Fovea. Sichtbar sind die Netzhaut (R), die Aderhaut (C) mit hyporeflektiven großen Gefäßen und das dazwischen liegende hyperreflektive RPE-BL-BrM-Band. In diesem außergewöhnlich gut erhaltenen Auge sind auch die mäßig reflektierenden IPL und OPL sichtbar. (D) Ein großes Gefäß in der inneren Netzhaut wirft einen Schatten auf die hinteren Schichten. (E) Die Trennung zwischen Netzhaut und RPE in Tafel E (gelbe Pfeilspitze) ist artefaktisch. (F) Die Nahinfrarot-Reflexion zeigt die Details sowohl der Netzhaut als auch der Aderhautgefäße. (G) Der rotfreie Reflexionsgrad zeigt die bogenförmigen Fasern (linker grüner gekrümmter Pfeil) und das papillomakuläre Bündel (grüner Pfeil) der Nervenfaserschicht. (H) Die Autofluoreszenz mit einer Wellenlänge von 488 nm zeigt einen Bereich mit insgesamt reduziertem Signal in der zentralen Makula aufgrund einer verdickten ödematösen Parafovea sowie Ringe und einen Punkt mit niedrigem Signal im fovealen Zentrum und Hyperautofluoreszenz, die die großen Netzhautgefäße auskleiden, was auf Bindegewebshüllen hindeutet. (I) Die Autofluoreszenz bei 787 nm zeigt eine kleine Region mit erhöhtem Signal in der zentralen Makula des RPE, ein Signal im Aderhautstroma und hypoautofluoreszierende Streifen, die den Aderhautgefäßen entsprechen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 3
Abbildung 3. Multimodale ex vivo Bildgebung eines Spenderauges mit früher intermediärer AMD. Spenderauge einer 97-jährigen Spenderin mit einem Sterbeintervall von 3,1 h. (A) Der Fundus des rechten Auges unter Entfernung des vorderen Augenabschnitts (Epi-Illumination). (B) Nahaufnahme der Makula (Epi-Illumination). Die grünen Linien zeigen die Positionen der OCT-B-Bilder in den Feldern D, E und F an. (C) Nahaufnahme der Fovea mit Hyperpigmentierung (Pfeil, Blitzbeleuchtung). (D) Eine SDD in der oberen Perifovea (orangefarbene Pfeile) ist im OCT zu sehen. I Vitelliforme Veränderung der RPE unter der Fovea (weiße Pfeile). (F) Unterhalb der Fovea befindet sich eine weiche Druse mit einer hyporeflektierenden Linie an der Basis (gelber Pfeil) und einem hyperreflektierenden Fokus darüber (hellblauer Pfeil). (G-I) Die Scanning-Laser-Ophthalmoskop-Bilder zeigen sehr feine Sternfalten in der Fovea (auch in C zu sehen). (G) Der Nahinfrarot-Reflexionsgrad zeigt Reflektivitätsmaterial in der Fovea, das teilweise vitelliformem Material entspricht. (H) Der rotfreie Reflexionsgrad zeigt die Netzhautoberfläche. (I) Die Autofluoreszenz mit einer Wellenlänge von 488 nm zeigt einen Bereich mit insgesamt reduziertem Signal in der zentralen Makula aufgrund einer leicht verdickten Parafovea. SDDs sind nicht deutlich sichtbar. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 4
Abbildung 4: Multimodale ex vivo Bildgebung einer kompletten RPE und Netzhautatrophie bei altersbedingter Makuladegeneration. Spenderauge einer 97-jährigen Frau mit einem Sterbeintervall von 2,33 h. (A) Fundus des linken Auges mit Transillumination. (B) Nahaufnahme der Makula (Epi-Illumination). Die grünen Linien zeigen die Positionen der OCT-B-Bilder in den Feldern D und E an. (C) Nahaufnahme der Fovea (Epi-Illumination) mit zentraler Hyperpigmentierung (grüne Pfeilspitze) und kleinen hyperpigmentierten Punkten (gelbe Pfeilspitzen). Der zentrale Punkt ist intensiv braun, da die darüber liegende Netzhaut sehr dünn ist. Die Punkte erscheinen entsättigt, weil die darüber liegende Netzhaut dick ist. Kreisförmige atrophische Bereiche sind angedeutet (weiße Pfeilspitzen). (D,E) OCT-B-Scans durch die (D) Perifovea (E) und Fovea. Die Netzhaut (R) und die dünne Aderhaut (C) sind sichtbar. (D) Hyperreflektive Foci (gelbe Pfeilspitzen) auf Höhe des HFL-ONL entsprechen den hyperpigmentierten Punkten in C. Die niedrige, flache RPE-Erhebung unter ihnen kann eine basale laminare Ablagerung, eine nicht-exsudative Typ-1-Neovaskularisation oder beides darstellen. (E) Das B-Bild durch die Fovea zeigt eine Atrophie, erkennbar an der Absenkung des HFL-ONL (rote Pfeilspitze), einen Bereich der Hypertransmission, eine vitelliforme Veränderung mit verstärkter Abschattung im fovealen Zentrum (grünes Sternchen) und hyperreflektive Foci (blaugrüne Pfeilspitze) mit Abschattung. Der hyporeflektive Raum zwischen der Netzhaut und dem RPE-Band kann subretinale Flüssigkeit darstellen. (F) Die Nahinfrarot-Reflexion zeigt hyperreflektierende Flecken in der Fovea. (G) Das rotfreie Bild zeigt die bogenförmigen Fasern des NFL und reflektierende Blüten auf der Netzhautoberfläche. (H) Die auf die Netzhaut fokussierte 488-nm-Autofluoreszenz zeigt ein Signal, das mit den Netzhautgefäßen assoziiert ist, kein Signal, das mit dem RPE assoziiert ist, und schwache autofluoreszierende Flecken im zentralen Makulabereich. (I) Die 787 nm Autofluoreszenz zeigt ein Signal, das der Pigmentierung in C entspricht. Auffällig sind kreisförmige atrophische Bereiche. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 5
Abbildung 5: Multimodale ex vivo Bildgebung der Typ-1-Neovaskularisation und Makulaatrophie bei altersbedingter Makuladegeneration. Ein Spenderauge einer 86-jährigen Spenderin mit einem Sterbeintervall von 3,5 h. (A) Der Fundus des linken Auges unter Entfernung des vorderen Augenabschnitts (Transillumination). (B) Nahaufnahme der Makula mit atrophischen Rändern (gelbe Pfeilspitzen). Die grünen Linien zeigen die Positionen der OCT-B-Bilder in den Feldern D und E an. (C) Die Nahaufnahme der Fovea zeigt eine schwarze Pigmentierung (grüne Pfeilspitzen) im atrophischen Bereich. (D,E) OCT B-Scans durch die (D) Perifovea (E) und Fovea. Die Netzhaut I und die dünne Aderhaut (C) sind sichtbar. In diesem außergewöhnlich gut erhaltenen Auge sind auch die mäßig reflektierenden IPL und OPL sichtbar. (D) Der perifoveale B-Scan streift den oberen Rand des atrophischen Areals. Die Atrophie zeigt sich durch die Erschlaffung des HFL-ONL und eine erhöhte Hypertransmission (rote Pfeilspitzen). Mögliche subretinale Drusenoidablagerungen sind angedeutet (Fuchsienpfeilspitzen). (E) Der foveale B-Scan zeigt einen Hügel aus subfovealem hyperreflektivem Material und intraretinalen Zysten (Sternchen). O = Sehnervenkopf. (F) Die Nahinfrarot-Reflexion zeigt einen reflektierenden Bereich mit Atrophie und Aderhautgefäßen (blaugrüne Pfeilspitzen), einschließlich eines kleinen, intensiven Bereichs in der zentralen Makula (orangefarbene Pfeilspitze), der durch Farbaufnahmen nicht sichtbar ist. (G) Der rotfreie Reflexionsgrad zeigt retinale Gefäße und innerhalb einer ringförmigen Zone Aderhautgefäße. (H) Die 488 nm lange Autofluoreszenz zeigt einen annähernd kreisförmigen atrophischen Rand (gelbe Pfeilspitzen) und Inseln beginnender Atrophie. Ein zentraler Bereich ohne Autofluoreszenz ist von einem Ring mit mäßiger Autofluoreszenz und sichtbaren Aderhautgefäßen (weiße Pfeilspitzen) umgeben. Die Autofluoreszenz von 787 nm war bei diesem Auge nicht möglich. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 6
Abbildung 6: Häufige Artefakte, die in der Ex-vivo-OCT-Bildgebung von Spenderaugen zu sehen sind. Diese Augen stammen aus der Augenserie 2016-2017. Die meisten Netzhäute sind im Vergleich zu den in vivo abgebildeten Netzhäuten hyperreflektierend, und die inneren Netzhautschichten sind reflektierender als die äußeren Netzhautschichten. Eine bazilläre Ablösung (gelbe Pfeilspitzen in den Feldern A, D, G und I) ist definiert als eine Spaltung auf der Ebene des Myoids des inneren Segments des Photorezeptors, wodurch eine ausgeprägte intraretinale Höhleentsteht 40. Die Netzhautablösung (grüne Pfeilspitzen in den Feldern B, C, D, F, G und I) beschreibt eine Trennung der gesamten neurosensorischen Netzhaut vom darunterliegenden RPE42. Ablösungen der inneren Grenzmembran (ILM) trennen die ILM- und Nervenfaserschicht (rote Pfeilspitzen in den Feldern A, B und I). Eine Aderhautablösung (blaue Pfeilspitze in Tafel C) ist eine Trennung innerhalb der Aderhaut oder zwischen Aderhaut und Sklera. Mechanische Beschädigungen (violetter Pfeil in den Feldern F und G) können auf jeder Ebene und mit jeder Größe auftreten, z. B. bei fehlendem Material (grüner Pfeil in Feld G) und verschobenem Material (gelber Pfeil in Feld G). Das Netzhautödem (violette Sterne in den Tafeln A und I) zeigt sich als Verdickung des Netzhautgewebes mit schlecht definierten Grenzen zwischen den einzelnen Netzhautschichten. Ein wellenförmiges RPE (blaue Pfeile in den Feldern E und J) erscheint als ungleichmäßige, wellenförmige RPE-Schicht. Zystoide Läsionen (rotes Quadrat in Tafel H) korrelieren mit hyporeflektiven kammerartigen Veränderungen innerhalb des Netzhautgewebes, häufig in der Fovea. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 7
Abbildung 7: Ex-vivo-Sichtbarkeit der in vivo beobachteten Pathologie in Abhängigkeit von der Konservierungsqualität. (Ein-Ich) Paneele Ein, Bund Cpaneele D, Eund Fund Panels G, Hund Ich stellen drei klinisch dokumentierte Augen von zwei Spendern dar, die jeweils durch Eye-Tracking gesehen wurden in vivo (Ein1-Ein2,D1-D2,G1-G2) und ex vivo (B1-B2,E1-E2,H1-H2) Bildgebung, gefolgt von Histologie (C,F,Ich). Die grünen Linien auf dem Nahinfrarot-Reflexionsgrad (NIR, Ein1,B1,D1,E1,G1,H1) repräsentieren die Ebenen der optischen Kohärenztomographie (OCT), der B-Bilder und der Panoramahistologie. Paneele Ein, Bund C und Paneele D, Eund F, zeigen das rechte bzw. linke Auge einer Spenderin in ihren 90ern. Paneele G, Hund Ich zeigen das rechte Auge einer zweiten Spenderin, ebenfalls in den 90ern. (Ein-C) Gut erhaltenes Augengewebe (DtoP: 2,1 h) ermöglicht eine gute Sichtbarkeit der Hauptpathologie. (Ein) Eine hyperreflektive intraretinale Makulaneovaskularisation (Typ 3 MNV, grüne Pfeilspitze) wird 17 Monate vor dem Tod (Ein2). Der RPE/Bruchsche Membrankomplex wird durch hyporeflektives Material gespalten und erscheint als "Doppelschicht"-Zeichen (Ein2). Auf der linken Seite befindet sich ein weiteres doppellagiges Schild mit Barcode-Hypertransmission in die Aderhaut (orangefarbene Pfeilspitze). Auf ex vivo OCT (B2), sind die Typ-3-MNV und die Barcode-Hypertransmission deutlich sichtbar und abgegrenzt. Die Netzhaut ist künstlich abgelöst, wie die weiße Pfeilspitze zeigt. Die Panoramahistologie zeigt eine vertikal ausgerichtete Typ 3 MNV-Läsion (grüne Pfeilspitze, C1). Siehe frühere Forschung43,44 für Details des Originalgehäuses. (D-F) Gut erhaltenes Augengewebe (DtoP: 2,1 h) kann zu einer reduzierten Transparenz führen, die aber immer noch ausreicht, um größere Pathologien zu erkennen. Das OG (D2) zeigt einen Stapel intraretinaler hyperreflekfer Herde (HRF, Fuchsienpfeilspitze) in einem Auge, das für exsudative Typ 3 MNV verfolgt wurde. 11 Monate vor dem Tod sind keine intraretinalen Zysten sichtbar. Auf ex vivo OCT (E2), ist der HRF-Stapel vertikal gestaucht (fuchsiafarbene Pfeilspitze), aber klar abgegrenzt. Zur Panoramahistologie (F1), erhebt sich ein retinaler Pigmentepithelturm (Fuchsienpfeilspitze) aus einer weichen Druse nach oben. (G-Ich) Weniger gut erhaltenes Augengewebe (DtoP: 8,9 h) führt zu einer verminderten Sichtbarkeit der Hauptpathologie. Die OCT zeigt eine äußere Netzhauttubulation (ORT, gelbe Pfeilspitze) 48 Monate vor dem Tod (G2). Am ex vivo OCT erscheint die ORT als subtile Störung, die ohne Vorwissen nur schwer zu erkennen gewesen wäre (H2). Die innere Begrenzungsmembran ist künstlich abgelöst (weiße Pfeilspitze). Das Ödem hat die Netzhautkontur verzerrt. Die histologische Analyse zeigt das ORT-Lumen, das durch die äußere Grenzmembran und die in sie hineinragenden Photorezeptoren begrenzt wird (Ich1). Siehe frühere Forschung26,45 für Details des Originalgehäuses. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Zahlen Prozentrechnen
Diagnostische Kategorie Rechte Augen Linke Augen Gesamt Rechte Augen Linke Augen Gesamt
Unauffällig 39 34 73 41.50% 37.80% 39.70%
Fragwürdige AMD 10 11 21 10.60% 12.20% 11.40%
Frühe AMD 20 22 42 21.30% 24.40% 22.80%
Atrophische AMD 6 8 14 6.40% 8.90% 7.60%
Neovaskuläre AMD 11 7 18 11.70% 7.80% 9.80%
Andere 7 8 15 7.40% 8.90% 8.20%
Unbekannt 0 0 0 0.00% 0.00% 0.00%
Nicht aufgezeichnet 1 0 1 1.10% 0.00% 0.50%
Gesamt 94 90 184 100.00% 100.00% 100.00%
Bestimmte AMD 37 37 75 39.40% 41.10% 40.20%
Mögliche AMD 47 48 95 50.00% 53.30% 51.60%
Die Augen wurden in der Zeit vom 17.06.16 bis zum 14.09.17 akzessioniert. Kriterien: ≥ 80 Jahre, weiß, nicht diabetisch, ≤6 h Tod bis zur Erhaltung. Ziel: 184 Augen (180 Augen von 90 Spendern, erhalten; 4 Augen von 4 Spendern, erhalten) Sterbezeit bis zur Konservierung (Mittelwert, Maximum, Minimum): 3,9 h, 6,4 h, 2,0 h

Tabelle 1: Genesung des Spenderauges von 2016-2017.

Ergänzungsmaterial 1: Überblick über die Präparation, Farbfundusfotografie und OCT-basierte multimodale Bildgebung. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzendes Material 2: Details zur OCT-basierten multimodalen Bildgebung zur Veranschaulichung der Schritte in den Abschnitten 5-8. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

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Discussion

Mit einem bevölkerungsbasierten Screening-Ansatz über einen Zeitraum von 16 Monaten in der Vor-COVID-Ära konnten 75 Spenderaugen mit AMD beschafft werden. Alle wurden mit einem kurzen DtoP geborgen und mit einem OCT-verankerten MMI inszeniert. Das Alterskriterium (>80 Jahre) liegt außerhalb der typischen Altersspanne für Gewebegewinnungen, die für transplantierbare Hornhäute vorgesehen sind. Trotz des fortgeschrittenen Alters ergaben unsere Kriterien Augen in allen Stadien der AMD. Viele RPE-Phänotypen sind allen AMD-Stadien gemeinsam, und einige sind exklusiv für neovaskuläre AMD 3,46. Der direkte Vergleich von Ex-vivo- und In-vivo-Bildgebung (Abbildung 7) bestätigte, dass eine kurze DtoP zusammen mit der fachkundigen Handhabung (Abbildung 1) ein kritischer Faktor bei der Erstellung von Ex-vivo-Bildern der äußeren Netzhaut ist, die für eine diagnostische Klassifizierung auf höchster Ebene ausreichen, und einige dieser Proben waren für direkte Korrelationen zwischen Bildgebung und Histologie geeignet 4,35, 47. Der Teufel Nicht jede Pathologie ist ex vivo sichtbar. Bei der Verwendung der OCT ist jedoch weitaus mehr sichtbar als bei Methoden der Farbfotografie10, insbesondere bei solchen, bei denen die Netzhaut von der RPE/Aderhautgetrennt wird 27. Darüber hinaus lenkt das Eye-Tracking aus der klinischen OCT die Aufmerksamkeit auf fokale und manchmal kleine Merkmale (Abbildung 7).

Dieses Konservierungssystem umfasst typische Augenbankverfahren und Werkzeuge zur Entfernung der Hornhaut, gefolgt vom Eintauchen eines geöffneten Auges in ein zuvor bereitgestelltes Konservierungsmittel. Auf diese Weise kann das Personal der Augenbank kontinuierlich (24/7) Forschungsgewebe bergen. Letzteres Merkmal ist von entscheidender Bedeutung, da Gewebe, die für unmittelbare komplexe Dissektionenbestimmt sind 27,32, rund um die Uhr Personal benötigen, entweder von den Prüfärzten, der Augenbank oder von beiden. Andere Stabilisatoren, die eine Gewebegewinnung zu jeder Stunde ermöglichen, gefolgt von spezialisierten Dissektionen und Extraktionen während der Arbeitszeit, wie das PAXgene Tissue System und Hibernate-A, könnten in Zukunft hilfreich sein, wenn diese mit der OCT-Bildgebung kompatibel sind.

Dieser Ansatz führt zu Netzhäuten, die weitgehend an das RPE gebunden bleiben und somit in der Lage sind, Daten zu generieren, die in die OCT-Bildgebung übersetzt werden können. Eine genaue Lokalisation ist unerlässlich, da die Makula klein ist (<3% der Netzhautfläche). Darüber hinaus stimmt die ablagerungsgetriebene AMD-Progression mit der Topographie von Zapfen und Stäbchenüberein 48, und die frühesten und hartnäckigsten visuellen Defekte treten an einer bestimmten Stelle auf (d. h. der Stäbchen-haltigen Parafovea neben der All-Cone-Fovea)49. Zum Vergleich mit der OCT ist die Immunhistochemie mit kolorimetrischen Farbstoffen mit umfassender Mikroskopie (z. B. Hellfeld) kompatibel, um alle Gewebeelemente, sowohl markierte als auch unmarkierte, zu berücksichtigen4. Ungezielte molekulare Assays, die auf Sampling-Arrays basieren, können die horizontale Ausrichtung von vertikal kompartimentierten Photorezeptoren und dem RPE nutzen, um die Auflösung effektiv zu erhöhen. Die bildgebende Massenspektrometrie mit ionisierenden Laserpulsen mit einem Durchmesser von 8 μm und einem Abstand von 10-15 μm kann Dutzende von Lipiden in subzellulären Kompartimenten der äußeren Netzhautzellenlokalisieren 50. Bei der räumlich aufgelösten Transkriptomik wird ein vorab angeordneter Satz von Barcode-Primern für die reverse Transkription auf Objektträgern verwendet, auf die Gewebeschnitte aufgebracht werden51. Diese Technologie ist derzeit auf eine Erfassung mit einem Durchmesser von 55 μm und einem Abstand von 100 μm beschränkt. Es werden Verbesserungen in der Auflösung erwartet, die diese Technologie für die AMD-Forschung geeignet machen würden.

Dieses Protokoll hat Einschränkungen. Das Genesungskriterium lässt Diabetesdiagnosen aus (30 % bei Medicare-Empfängern in Alabama)52 aufgrund der Bedeutung der Aderhaut bei beiden Krankheiten. Dieser Ausschluss reduziert den gesamten Spenderpool und verlängert die Zeit, die benötigt wird, um genügend Augen für eine Studie zu sammeln. Aus historischen Gründen wurden in den Kriterien von 2016-2017 schwarze Spender ausgelassen, die jetzt 14 % der landesweiten Augenspender ausmachen, und schwarze Spender werden nun in aktuelle prospektive Projekte einbezogen. Das Patientenregister für Personen, die Augenspender werden möchten, ist umfangreich, beinhaltet aber noch keine bequeme Registrierung in lokalen Netzhaut-Spezialpraxen, die AMD-Patienten betreuen. Dieses Projekt befindet sich derzeit in der Entwicklung. Bei einem populationsbasierten Screening wie diesem treten Augen mit Erkrankungen auf, die sich im Phänotyp mit AMD überschneiden und in Absprache mit der sich entwickelnden klinischen Literatur und einem auf Netzhauterkrankungen spezialisierten Augenarzt erkannt werden müssen. Zum Beispiel enthielt diese Augenserie Nävi mit Drusen53 und eine Linie der RPE-Störung über einem Pachygefäß (ein dickes Gefäß in der inneren Aderhaut)54. Schließlich wurden frühe und mittlere AMD aufgrund des Fehlens eines OCT-basierten Bewertungssystems für AMD kombiniert, das von der Klassifikation der Atrophie-Meeting-Gruppe55 entwickelt wird. Nichtsdestotrotz ermöglicht die Optimierung der Gewebegewinnung und die OCT-basierte Charakterisierung die AMD-Forschung, die sich auf die Nutzung des Zeitelements des OCT-verankerten MMI konzentriert, in Förderanträgen zu planen, zu betreiben, zu terminieren und zu budgetieren.

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Disclosures

C.A.C. erhält Forschungsunterstützung von Heidelberg Engineering und berät Apellis, Astellas, Boehringer Ingelheim, Character Bioscience und Osanni. T.A. erhält Forschungsunterstützung von Novartis und berät Roche, Novartis, Bayer, Nidek und Apellis. K.B.F. ist Berater von Genentech, Zeiss, Heidelberg Engineering, Allergan, Bayer und Novartis.

Acknowledgments

Wir danken Heidelberg Engineering für die Instrumentierung und das Design des ursprünglichen Augenhalters, Dr. Richard F. Spaide für die Einführung in die OCT-basierte multimodale Bildgebung, Dr. Christopher Girkin für die Erleichterung des Zugangs zu klinischen Bildgebungsgeräten und David Fisher für Abbildung 1. Die Wiederherstellung der menschlichen Spenderaugen für die Forschung wurde durch Zuschüsse der National Institutes of Health (NIH) R01EY06019 (C.A.C.), P30 EY003039 (Pittler), R01EY015520 (Smith), R01EY027948 (C.A.C., T.A.) R01EY030192 (Li), R01EY031209 (Stambolian) und U54EY032442 (Spraggins), IZKF Würzburg (N-304, T.A.), die EyeSight Foundation of Alabama, die International Retinal Research Foundation (C.A.C.), die Arnold and Mabel Beckman Initiative for Macular Research (C.A.C.) und Research to Prevent Blindness AMD Catalyst (Schey).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Beakers, 250 mL Fisher # 02-540K
Bottles, 1 L, Pyrex  Fisher # 10-462-719 storage for preservative
Bunsen burner or heat source Eisco # 17-12-818 To melt wax
Camera, digital Nikon D7200 D7200
Computer and storage Apple iMac Pro; 14 TB external hard drive Image storage
Container, insulated Fisher # 02-591-45 For wet ice
Containers, 2 per donor, 40 mL Fisher Sameco Bio-Tite  40 mL # 13-711-86 For preservative
Crucible, quartz 30 mL Fisher # 08-072D Hold globe for photography
Cylinder, graduate, 250 mL Fisher # 08-549G
Disinfectant cleaning supplies   https://www.cardinalhealth.com/en/product-solutions/medical/infection-control/antiseptics.html
Eye holder with lens and mounting bracket contact J. Messinger jeffreymessinger@uabmc.edu custom modification of Heidelberg Engineering original design
Face Protection Masks Fisher # 19-910-667
Forceps, Harmon Fix Roboz  # RS-8247
Forceps, Micro Adson Roboz  # RS-5232
Forceps, Tissue Roboz # RS-5172
Glass petri dish, Kimax Fisher # 23064
Gloves Diamond Grip Fisher # MF-300
Gowns GenPro Fisher # 19-166-116
Image editing software Adobe Photoshop 2021, Creative Suite
KimWipes Fisher # 06-666
Lamps, 3 goosenecks Schott Imaging # A20800
Microscope, stereo Nikon SMZ 1000 for dissection
Microscope, stereo Olympus  SZX9 color fundus photography
Paraformaldehyde, 20%  EMS # 15713-S for preservative; dilute for storage
pH meter Fisher  # 01-913-806
Phosphate buffer, Sorenson’s, 0.2 M pH 7.2  EMS # 11600-10
Ring flash B & H Photo Video Sigma EM-140 DG 
Ruby bead, 1 mm diameter Meller Optics # MRB10MD
Safety Glasses 3M Fisher # 19-070-940
Scanning laser ophthalmoscope Heidelberg Engineering HRA2
Scissors, curved spring Roboz # RS-5681
Sharps container Fisher # 1482763
Shutter cord, remote Nikon MC-DC2
Spectral Domain OCT device Heidelberg Engineering Spectralis HRA&OCT https://www.heidelbergengineering.com/media/e-learning/Totara-US/files/pdf-tutorials/2238-003_Spectralis-Training-Guide.pdf
Stainless steel ball bearing, 25.4 mm diameter McMaster-Carr # 9529K31
Tissue marking dye, black Cancer Diagnostics Inc # 0727-1
Tissue slicer blades Thomas Scientific # 6767C18
Trephine, 18-mm diameter Stratis Healthcare # 6718L
TV monitor (HDMI) and cord for digital camera B&H Photo Video BH # COHD18G6PROB for live viewing and remote camera display features
Wax, pink dental EMS  # 72670
Wooden applicators Puritan # 807-12

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References

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Messinger, J. D., Brinkmann, M.,… More

Messinger, J. D., Brinkmann, M., Kimble, J. A., Berlin, A., Freund, K. B., Grossman, G. H., Ach, T., Curcio, C. A. Ex Vivo OCT-Based Multimodal Imaging of Human Donor Eyes for Research into Age-Related Macular Degeneration. J. Vis. Exp. (195), e65240, doi:10.3791/65240 (2023).

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