Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

אקס ויוו הדמיה מולטימודאלית מבוססת OCT של עיני תורם אנושיות למחקר על ניוון מקולרי תלוי גיל

Published: May 26, 2023 doi: 10.3791/65240
Automatic Translation
1, 2, 1, 1, 3,4, 5, *6, *1
1Department of Ophthalmology and Visual Sciences, University of Alabama at Birmingham Heersink School of Medicine, 2Department of Ophthalmology, University Hospital of Zurich, 3Vitreous Retina Macula Consultants of New York, 4Department of Ophthalmology, New York University Grossman School of Medicine, 5Advancing Sight Network, 6Department of Ophthalmology, University Hospital Bonn
* These authors contributed equally

Summary

בדיקות מעבדה יכולות למנף את הערך הפרוגנוסטי מההדמיה הרב-מודאלית מבוססת טומוגרפיית קוהרנטיות אופטית אורכית (OCT) של ניוון מקולרי תלוי גיל (AMD). עיניים מתורם אנושי עם ובלי AMD מצולמות באמצעות OCT, צבע, סריקת השתקפות אינפרא אדום קרוב לייזר, אופטלמוסקופיה, ו autofluorescence בשני אורכי גל עירור לפני חתך רקמות.

Abstract

רצף התקדמות לניוון מקולרי תלוי גיל (AMD) שנלמד מהדמיה קלינית מבוססת טומוגרפיה אופטית קוהרנטית (OCT) רב-מודאלית (MMI) עשוי להוסיף ערך פרוגנוסטי לממצאי המעבדה. בעבודה זו, ex vivo OCT ו- MMI יושמו על עיני תורם אנושי לפני חתך רקמת הרשתית. העיניים נמצאו מתורמים לבנים שאינם סוכרתיים בני ≥80, עם זמן מוות לשימור (DtoP) של ≤6 שעות. הגלובוסים נמצאו באתר, קיבלו טרפין בקוטר 18 מ"מ כדי להקל על הסרת הקרנית, וטובלים בפרפורמלדהיד חוצץ 4%. תמונות פונדוס צבעוניות נרכשו לאחר הסרת סגמנט קדמי עם היקף ניתוח ומצלמת SLR באמצעות תאורת טרנס, אפי ומבזק בשלוש הגדלות. הגלובוסים הונחו בחיץ בתוך תא שעוצב במיוחד עם עדשת דיופטר 60. הם צולמו עם תחום ספקטרלי OCT (קוביית מקולה של 30°, מרווח של 30 מיקרומטר, ממוצע = 25), החזר אינפרא אדום קרוב, אוטופלואורסצנטיות של 488 ננומטר ואוטופלואורסצנטיות של 787 ננומטר. עיני AMD הראו שינוי באפיתל פיגמנט הרשתית (RPE), עם משקעי דרוסן או דרוסנואידים תת-רשתית (SDD), עם או בלי ניאו-וסקולריזציה, וללא עדות לסיבות אחרות. בין יוני 2016 לספטמבר 2017 נמצאו 94 עיניים ימניות ו-90 עיניים שמאליות (DtoP: 3.9 ±-1.0 שעות). מתוך 184 העיניים, ל-40.2% היה AMD, כולל AMD בשלב הביניים המוקדם (22.8%), אטרופי (7.6%) וניאו-וסקולרי (9.8%), ול-39.7% היו מקולות ללא ייחוד. דרוסן, SDDs, מוקדים היפר-רפלקטיביים, ניוון וצלקות פיברו-וסקולריות זוהו באמצעות OCT. הממצאים כללו opacification רקמות, ניתוקים (bacillary, retinal, RPE, choroidal), שינוי ציסטי foveal, RPE גלי, ונזק מכני. כדי להנחות את חתך ההקפאה, נעשה שימוש בנפחי OCT כדי למצוא את הגומה המרכזית ואת ציוני הדרך של ראש עצב הראייה ופתולוגיות ספציפיות. אמצעי האחסון של ex vivo נרשמו באמצעי האחסון in vivo על-ידי בחירת פונקציית הייחוס למעקב אחר העיניים. הנראות ex vivo של הפתולוגיה הנראית in vivo תלויה באיכות השימור. בתוך 16 חודשים, 75 עיניים מהירות של תורם DtoP בכל שלבי AMD התאוששו ובויימו בשיטות MMI קליניות.

Introduction

חמש עשרה שנים של ניהול ניוון מקולרי הקשור לגיל ניאו-וסקולרי (AMD) עם טיפול אנטי-VEGF בהנחיית טומוגרפיה קוהרנטית אופטית (OCT) הציעו תובנות חדשות לגבי רצף ההתקדמות והמיקרו-ארכיטקטורה של גורם שכיח זה לאובדן ראייה. הכרה מרכזית היא כי AMD היא מחלה תלת ממדית המערבת את הרשתית הנוירו-חושית, אפיתל פיגמנט הרשתית (RPE) וכורואיד. כתוצאה מהדמיית OCT של מטופלי ניסוי ועיניים עמיתות של מטופלי מרפאה מטופלים, תכונות הפתולוגיה מעבר לאלה הנראות על ידי צילום פונדוס צבע, תקן קליני במשך עשרות שנים, מוכרות כיום. אלה כוללים neovascularization intraretinal (סוג 3 מקולריזציה neovascularization1, לשעבר התפשטות אנגיומטית), משקעי drusenoid subretinal (SDDs, המכונה גם pseudodrusen רשתית)2, מסלולים מרובים של גורל RPE3,4, ותאי Müller גליוטי אינטנסיבי ניוון 5,6.

מערכות מודל חסרות מקולה (תאים ובעלי חיים) משחזרות כמה פרוסות של מחלה מורכבת זו 7,8,9. הצלחה נוספת בהקלת הנטל של AMD יכולה להגיע מגילוי וחקירה של פתולוגיה ראשונית בעיניים אנושיות, הבנת ההרכב התאי הייחודי של המקולה, ולאחר מכן תרגום למערכות מודל. דו"ח זה מתאר שיתוף פעולה בן שלושה עשורים בין מעבדת מחקר אקדמית לבין בנק עיניים. המטרות של שיטות אפיון הרקמות המתוארות כאן הן כפולות: 1) ליידע את טכנולוגיית האבחון המתפתחת על ידי הדגמת הבסיס של מראה פונדוס ומקורות אותות הדמיה במיקרוסקופיה, ו-2) לסווג דגימות AMD עבור טכניקות גילוי מולקולרי ממוקדות (אימונוהיסטוכימיה) ובלתי ממוקדות (ספקטרומטריית מסות הדמיה, IMS ושעתוק מרחבי) המשמרים את הגומה המרכזית העשירה בחרוט בלבד ואת הפארא והפריפוביה העשירה במוט. מחקרים כאלה יכולים להאיץ את התרגום ל-OCT קליני, שעבורו רצף התקדמות ומעקב אורכי אפשריים באמצעות מעקב עיניים. טכנולוגיה זו, שנועדה לנטר את השפעות הטיפול, רושמת סריקות מביקור אחד במרפאה למשנהו באמצעות כלי דם ברשתית. קישור OCT במעקב עיניים לתוצאות מעבדה שהתקבלו בטכניקות הרסניות יכול לספק רמה חדשה של ערך פרוגנוסטי לממצאים מולקולריים.

בשנת 1993 צילמה מעבדת המחקר תצלומי צבע של פונדוס לאחר המוות על פילם10. מאמץ זה קיבל השראה מהפוטומיקרוסקופיה וההיסטולוגיה המעולות של הרשתית ההיקפית האנושית על ידי Foos ועמיתיו 11,12,13 והמתאמים הקליניים הנרחבים של AMD על ידי Sarks et al.14,15. החל משנת 2009 אומצה הדמיה מולטימודאלית ex vivo (MMI) המעוגנת בתחום הספקטרלי OCT. מעבר זה קיבל השראה ממאמצים דומים של אחרים 16,17 ובמיוחד מההבנה שכל כך הרבה ממבנה העל שתואר על ידי הסארקים היה זמין בתלת מימד, לאורך זמן, במרפאה 18,19. המטרה הייתה לרכוש עיניים עם מקולה מחוברת במסגרת זמן סבירה למחקרים חזקים של פנוטיפים ברמה התאית ברשתית, RPE וכורואיד. הכוונה הייתה לעבור מסטטיסטיקה "לפי עין" ל"סוג נגע", תקן שהושפע מהמושגים "רובד פגיע" ממחלות לב וכלי דם20,21.

הפרוטוקול בדו"ח זה משקף ניסיון עם כמעט 400 זוגות עיניים של תורמים שהצטרפו בכמה זרמים. בשנים 2011-2014 נוצר אתר פרויקט MACULA של היסטופתולוגיה של AMD, הכולל עובי שכבות וביאורים מ-142 דגימות ארכיוניות. עיניים אלה נשמרו בין השנים 1996-2012 בקיבוע גלוטראלדהיד-פרפורמלדהיד עבור היסטולוגיה של שרף אפוקסי ברזולוציה גבוהה ומיקרוסקופ אלקטרונים. כל הפונדי צולמו בצבע כאשר התקבלו וצולמו מחדש על ידי OCT ממש לפני ההיסטולוגיה. מחזיק עיניים שתוכנן במקור למחקרי עצבי ראייה22 שימש כדי להכיל ניקוב רקמה בעובי מלא בקוטר 8 מ"מ שבמרכזו הגומה המרכזית. לאתר הועלו סריקות OCT B דרך מרכז הגומה ואתר 2 מ"מ מעולה, המתאים להיסטולוגיה באותן רמות, בתוספת צילום פונדוס צבעוני. הבחירה במטוסי OCT הוכתבה על ידי הבולטות של הפתולוגיה של AMD תחת הגומה23 והבולטות של SDD באזורים עשירים במוטות העדיפים על הגומה24,25.

החל משנת 2013, עיניים שצולמו עם MMI מעוגן OCT במהלך החיים היו זמינות לקורלציות קלינאופתולוגיות ישירות. רובם (7 מתוך 10 תורמים) היו מטופלים במרפאת הפניית רשתית (מחבר: K.B.F.), שהציעה רישום הנחיות מתקדם לחולים המעוניינים לתרום את עיניהם לאחר המוות למטרות מחקר. העיניים שוחזרו ונשמרו על ידי בנק העיניים המקומי, הועברו למעבדה והוכנו באותו אופן כמו העיניים של פרויקט מקולה. כרכי OCT קליניים לפני המוות נקראו בצורה חלקה במעבדה, ובכך התאימו את המאפיינים הפתולוגיים שנראו במהלך החיים עם התכונות שנראו במיקרוסקופ26.

החל משנת 2014, איסוף עיניים פרוספקטיבי החל על ידי בדיקת AMD בעיניים תורמות ללא היסטוריה קלינית אך נשמר במהלך מגבלת זמן מוגדרת (6 שעות). למטרה זו, מחזיק העיניים שונה כדי להתאים כדור הארץ כולו. זה הפחית את הסיכוי לניתוק סביב הקצוות החתוכים של אגרוף 8 מ"מ ששימש בעבר. העיניים נשמרו בפרפורמלדהיד חוצץ 4% לאימונוהיסטוכימיה והועברו ל-1% למחרת לאחסון לטווח ארוך. בשנים 2016-2017 (טרום המגפה) החלימו 184 עיניים מ-90 תורמים. הנתונים הסטטיסטיים והתמונות בדוח זה מופקים מסדרה זו. במהלך תקופת המגפה (הסגרים של 2020 ולאחריה), אוספים פוטנציאליים לשיתופי פעולה בתמלול ו- IMS נמשכו בקצב מופחת, בעיקר בשיטות 2014.

קיימות שיטות אחרות להערכת עין התורם. מערכת הדירוג של מינסוטה (MGS) 27,28 מבוססת על המערכת הקלינית AREDS לצילום פונדוס צבע 29. המגבלות של שיטה זו כוללות שילוב של AMD אטרופי וניאו-וסקולרי לשלב אחד של "AMD מאוחר". יתר על כן, MGS כרוך בהסרת הרשתית neurosensory לפני תיעוד צילום של choroid RPE. שלב זה מנתק SDDs בדרגות שונות30,31 ומסיר את ההתאמה המרחבית של הרשתית החיצונית ומערכת התמיכה שלה. לפיכך, המאמצים לקשר בין ביקוש מטבולי ואיתות מהרשתית לפתולוגיה בכורואיד RPE עלולים להיפגע. מערכת יוטה יישמה MMI באמצעות צילום צבע ex vivo ו-OCT כדי לסווג עיניים המיועדות לדיסקציה לאזורים עבור RNA ומיצוי חלבונים32. למרות שהוא עדיף על מיצוי משקפיים שלמים, אזור קוטר 3 מ"מ בסיכון הגבוה ביותר להתקדמות AMD33,34 מייצג רק 25% מניקוב במרכז גומה מרכזית בקוטר 6 מ"מ. לכן, טכניקות שיכולות למקם ממצאים בהתייחסות לגומה המרכזית, כגון חתך טורי לאימונוהיסטוכימיה, הן יתרון.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

ועדת הביקורת המוסדית באוניברסיטת אלבמה בברמינגהם אישרה את מחקרי המעבדה, אשר דבקו בנוהלי מעבדה טובים וברמת בטיחות ביולוגית 2/2+. כל בנקי העיניים בארה"ב עומדים בחוק המתנות האנטומיות האחיד משנת 2006 ובמנהל המזון והתרופות האמריקאי. רוב בנקי העיניים בארה"ב, כולל Advancing Sight Network, עומדים בסטנדרטים הרפואיים של איגוד בנק העיניים של אמריקה.

טבלת החומרים מפרטת את האספקה והציוד. חומר משלים 1 מספק סקירה כללית של הדיסקציה, צילום פונדוס צבע ו- MMI מבוסס OCT. חומר משלים 2 מספק פרטים על MMI מבוסס OCT.

1. קריטריונים לאיסוף רקמות

  1. כדי למקסם את התשואה של עיני AMD במסך של תורמים לא מתועדים, קבע את הקריטריונים הבאים לתורמים מקובלים: גיל ≥80 שנים, לבן, לא סוכרתי, ו ≤6 שעות מוות לשימור (DtoP).
    הערה: DtoP מוגדר כזמן שבין המוות לבין הנחת העין בחומר משמר שסופק, בבית החולים או במעבדה.

2. אמצעי שימור והכנה אחרת (מעבדה)

  1. לייצר 4% פרפורמלדהיד חוצץ פוספט מ 20% מלאי (שנרכש). הכינו 1 ליטר על ידי הוספת 200 מ"ל של 20% פרפורמלדהיד (מקדם דילול של 5) ל-800 מ"ל של חיץ פוספט של 0.1 מ' סורנסון. בדוק והתאם כדי לוודא שה- pH הוא 7.2, במידת הצורך. יש לאחסן בטמפרטורה של 4°C.
  2. יש לפזר 30 מ"ל של 4% פרפורמלדהיד חוצץ פוספט לתוך צנצנות של 40 מ"ל.
  3. מלאי מסומן 40 מ"ל מיכלים של חומר משמר בבנק העין, כך הרקמה ניתן לשחזר בכל עת ובכל יום.
  4. לאחסון עיניים משומרות, הכינו 1% פרפורמלדהיד מתמיסת 4%. הכינו 1 ליטר על ידי הוספת 250 מ"ל של 4% פרפורמלדהיד (מקדם דילול של 4) ל-750 מ"ל של חיץ פוספט של 0.1 מ' סורנסון. בדוק והתאם את ה- pH במידת הצורך. יש לאחסן בטמפרטורה של 4°C.
    1. הכינו 1 ליטר של תמיסה של 0.1 מ' מתמיסת 0.2 מ' של חיץ הפוספט של סורנסון, pH 7.2, על ידי שילוב של 500 מ"ל מים מזוקקים ו-500 מ"ל של חיץ סורנסון.
    2. התאם את טיפת ה- pH על ידי טיפה באמצעות 1 N חומצה הידרוכלורית או 1 N נתרן הידרוקסיד. יש לאחסן בטמפרטורה של 4°C.
  5. צור מחזיק כדי לייצב את העיניים במהלך נתיחה. מלאו צלחת פטרי בשעווה דנטלית מחוממת עד לנוזל. כאשר הוא מעט קריר, לעשות רושם hemispheric בו עם מיסב כדור גדול, ולאחר מכן להקפיא את המנה כדי להקל על הסרת מיסב הכדור.

3. שיטות בנק עיניים

  1. כדי להבטיח התאוששות מהירה של רקמות מחקר, לשחזר את כל הרקמות במהירות, כולל אלה המיועדים להשתלה.
  2. לקבל הפניות לפטירה, כנדרש בחוק, תוך שעה מרגע הפטירה, ולעקוב אחר כל תורם עם מספר רצף הפניה העוקב אחר הרקמה.
  3. כדי למצוא מקרים עם תיעוד קליני פוטנציאלי, שאל שאלות ספציפיות ל- AMD ולמחלות עיניים בראיון הערכת הסיכון לתורמים.
  4. כדי למזער את זמן הנסיעה, לשחזר גלובוסים שלמים (להבדיל רק קרניות להשתלה) בתוך שטח קומפקטי (כלומר, עיר ומחוז פרברי סמוך).
  5. הביאו שתי צנצנות של חומר משמר (4% פרפורמלדהיד חוצץ) לחדר בית החולים של הנפטר לצורך התאוששות רקמות (בניגוד להמתנה להעברת הגופה לחדר מתים).
  6. לפני ובמהלך ההתאוששות, לתקשר עם החוקרים כדי לאשר את המסירה ואת העיתוי.
  7. שחזרו את הגלובוסים באתר בית החולים, פתחו אותם בשיטות טיפול עקביות, וטבלו את העין הפקוחה בחומר משמר (איור 1).
    1. החזק את עין התורם נכרת במקומה באמצעות נדן של גזה המיוצב על ידי המוסטט.
    2. כדי להקל על הסרת הקרנית עם שפה רחבה של 2 מ"מ של סקלרה, השתמש בטרפין בקוטר 18 מ"מ כדי להבקיע את כדור הארץ.
    3. כדי לשחרר את הקרנית עם שפה נלווית של סקלרה, חתכו לאורך העיגול המנוקד באמצעות מספריים עמוסי קפיץ עם קצוות מעוקלים תוך ייצוב כדור הארץ עם הגזה גזוז המוסטט.
    4. הרם את הקרנית מעל הסקלרה, חושף את הקשתית ואת הגוף הרירי.
    5. כדי להקל על חדירת החומר המשמר לתא הזגוגית, יש ליצור חריץ באורך 2 מ"מ בקשתית בניצב לשולי האישונים. הכניסו את העיניים לצנצנות דגימה עם 30 מ"ל חומר משמר ב-4°C, והעבירו למעבדה על קרח רטוב.
  8. העבר מידע על תורמים ללא זיהוי באופן אלקטרוני מבנק העיניים למסד הנתונים של מעבדת המחקר.
    הערה: במאגר נשמרים מספר ההפניה, מספר רקמת בנק העיניים ומספר תעודת הזהות של המעבדה למעקב, בתוספת מידע רלוונטי אחר.

4. הכנת רקמות לצילום פונדוס צבע ex vivo

  1. השתמש בשני מיקרוסקופים סטריאופוניים, אחד לדיסקציה ואחד לצילום פונדוס צבע.
    הערה: כדי להאיר שינויים פיגמנטריים, השתמש בבסיס למיקרוסקופ שדה כהה.
  2. הסר את שאריות המקטע הקדמי (קשתית ועדשה). כדי לייצב את העין בזמן הדיסקציה, הניחו אותה בצלוחית פטרי מלאה בשעווה (חומר משלים 1, שקופיות 7-8). כדי למנוע מהגוף הריסי והרשתית המחוברת לקרוס לתוך חלל הזגוגית, מזערו את ההפרעה של טבעת הזגוגית העבה המחוברת לגוף הריסי (בסיס הזגוגית).
  3. סמן את הקוטב העליון להתמצאות. מניחים את הגלובוס בצד הקדמי כלפי מטה בצלחת. מצא את גידי ההחדרה של הרקטוס העליון והשרירים האלכסוניים העליונים. בעזרת מוליך עץ, מורחים במשורה דיו סימון בקו של 10 מ"מ בכיוון קדמי-אחורי (כלומר, בניצב להחדרה המגמתית של שריר הרקטוס העליון).
  4. לפני הצילום, מלאו את הפונדוס בחיץ פוספט קר של סורנסן.
  5. הכנס חרוז אודם בקוטר 1 מ"מ לפונדוס כסרגל קנה מידה פנימי שיופיע בכל תמונה27.
  6. קבל תמונות צבעוניות באמצעות מצלמת רפלקס בעלת עדשה יחידה המותקנת על מיקרוסקופ סטריאו המצויד במבזק טבעתי. השתמש בתאורת טרנס, אפי ומבזק בכל אחת משלוש הגדלות סטנדרטיות כדי ללכוד תמונות שנועדו להדגיש אזורים ספציפיים (חומר משלים 1, שקופית 11): 1) הפונדוס לקו המשווה, 2) הקוטב האחורי (ארקדות כלי דם, ראש עצב הראייה, גומה המרכזית), ו-3) הגומה המרכזית בתוך המקולה לוטאה (נקודה צהובה).

5. הכנה לצילומי פונדוס צבע ex vivo

  1. הפעל את המצלמה והצג. חבר את הצמצם המרוחק ושחרר את המפעיל בצג ממשק המולטימדיה בהבחנה גבוהה (HDMI), במצלמה/בטלוויזיה (TV) ובכבל התצוגה.
  2. הגדר את הגדרות המצלמה לפונקציית ISO ידנית ולמיקום נעילת המראה (נעול במקום כדי להפחית רעידות).
    הערה: עיין במדריך למשתמש של היצרן לקבלת ההגדרות במצלמה שבה נעשה שימוש. למד מתצוגת המצלמה את הגדרות חשיפת יתר/תת-חשיפה ביחס להיסטוגרמה ולקריאות החשיפה.
  3. סדרו שני מקורות אור, שבכל אחד מהם שני קווי אור גמישים הממוקמים בניצב זה לזה, להארה בארבעת הכיוונים הקרדינליים על במת המיקרוסקופ (חומר משלים 1, עמוד 10).
  4. הפעל את מקורות האור של epi-illumination לעוצמה מלאה.
    הערה: זה מועיל אך לא הכרחי שיהיה תכריכי לבד שחורים סביב הבמה כדי להגביל את פיזור האור / פלאש עבור הצלם.
  5. במיקרוסקופ המנתח, השתמשו במלקחיים כדי להחדיר את הקוטב האחורי לתוך כור היתוך קוורץ 30 מ"ל מלא בחיץ. הניחו לרקמה לשקוע לתחתית. הכנס חישוק, כגון ספוג רקמה, בין העין לדופן כור ההיתוך כדי מניעת תנועה. הכנס את חרוז האודם בקוטר 1 מ"מ למוט האחורי.
    הערה: החרוז עלול ליפול לתוך גביע עצב הראייה.
  6. מניחים בזהירות את הגלובוס בכור ההיתוך על במת המיקרוסקופ הסטריאופוני, ומתבוננים בפונדוס העין הפנימי דרך עיניות המיקרוסקופ. באמצעות ההגדלה הנמוכה ביותר, כוונו את העין על ידי זיהוי סימן הרקמה במיקום השעה 12, ראש עצב הראייה (ONH) והגומה המרכזית 5° מתחת ל- ONH. סובב את העין כך שהגומה המרכזית תיפול מתחת לקו דרך ONH ב-5°.
    הערה: אם זו עין ימין, ה-ONH נמצא מימין לגומה המרכזית, כפי שניתן לראות דרך האוקולרים של המיקרוסקופ. אם זו עין שמאל, ה- ONH נמצא משמאל לגומה המרכזית.
  7. הפעל את הצג המרוחק הצופה מהמצלמה. ודא שמחוון מפצל קרן המיקרוסקופ מוגדר לצפייה דרך יציאת הצילום ולא דרך היציאה של האוקולרים. בהתאם לנתיב האור והמראה, היו מוכנים לסובב את הרקמה 180° על הבמה להתמצאות נכונה.

6. רכישת תמונה באמצעות צילום פונדוס צבע ex vivo

  1. כאשר תאורת האפי-אילופין מופעלת, הגדר את ההגדלה כך שכל חתך הטרפין בקוטר 18 מ"מ יתפוס את כל שדה הראייה. הגדילו את ההגדלה כך שניתן יהיה להתמקד בתחתית בור הגומה. הקטן את ההגדלה להגדרה הקודמת.
  2. כוונן את הגדרות ISO בטווח של 1,600-3,000 כך שזמני החשיפה יהיו בטווח המרכזי של המונה במצלמה.
  3. לחץ על הדק התריס המרוחק. הקשיבו למראה כדי לנעול את התנוחה. לחץ שוב על ההדק לחשיפה.
  4. התבונן בתמונה על הצג, כאשר המטא-נתונים שנקבעו מראש מציגים אדום, ירוק, כחול (RGB) והיסטוגרמת צבע לחשיפה הנכונה. אם החשיפה מקובלת, המשך; אם לא, מחקו, העריכו מחדש את הפרמטרים וצרו תמונה מחדש.
  5. כבו את מנורות צוואר האווז לאפי-אילוריקה כדי להדגיש את ה-drusen, והפעילו את המבזק, בחשיפה של 1/4 שניות, מהירות תריס מצלמה של 1/250 שניות ו-ISO של 100-320. הגדר את מהירות המבזק לברירת המחדל, או שנה אותה במהלך ההגדרה הראשונית של המצלמה. רכשו תמונה ובדקו את ההיסטוגרמה לחשיפה נכונה.
  6. כבו את המבזק והפעילו את מקור האור הטרנס-תאורתי. אפס את ה-ISO ליותר מ-5,000, וודא שזמן החשיפה אינו יורד מתחת ל-1/30 שניות עקב רעידות פוטנציאליות במערכת הצילום. רכשו תמונה ובדקו את ההיסטוגרמה לחשיפה נכונה.
  7. הגדל את ההגדלה כדי להציג הן את ONH והן את הגומה המרכזית בשדה הראייה. הפעל את מנורות ה- epi-illumination. הגדר את טווח ISO ל- 1,600-3,000. ודא שזמני החשיפה נמצאים בטווח המרכזי של המצלמה.
  8. כבה את מנורות האפי-אילומינציה והפעל את המבזק, בחשיפה של 1/4 שניות, מהירות התריס שנקבעה מראש במצלמה נקבעה ל-1/250 שניות וה-ISO הוגדר ל-400-800. רכשו תמונה ובדקו את ההיסטוגרמה לחשיפה נכונה.
  9. כבה את המבזק והפעל את תאורת הטרנס באמצעות בסיס השדה החשוך. אפס את ה-ISO ליותר מ-5,000. ודא שזמן החשיפה אינו איטי מ- 1/30 שניות עקב רטט פוטנציאלי במערכת הצילום. רכשו תמונה ובדקו היסטוגרמה מתאימה.
  10. כבה את ההארה והפעל שוב את מנורות ה- epi-illumination.
  11. הגדל את ההגדלה לזו המשמשת בשלב 6.7. התמקד מחדש במידת הצורך.
  12. הגדל את ה-ISO בטווח של 3,000-6,000, והתאם את זמן החשיפה כך שיתאים לטווח החשיפה הנכון של המצלמה. רכוש תמונה.
    הערה: ייתכן שחרוז האודם לא יופיע עוד בשדה הראייה. אם כן, צלם תמונות נפרדות של החרוז בהגדלה זו לצורך השוואה.
  13. כבו את מנורות האפי-תאורה. הפעל את המבזק בחשיפה של 1/4 שניות ועם מהירות הצמצם של המצלמה ל-1/250 שניות. הגדר את מהירות המבזק לברירת המחדל, או שנה אותה במהלך ההגדרה הראשונית של המצלמה, והגדר את ה- ISO ל- 500-1,000. רכוש את התמונה. בדוק את ההיסטוגרמה לחשיפה נכונה.
  14. כבה את המבזק והפעל את מנורות הטרנס-תאורה. אפס את ה-ISO ליותר מ-8,000 כדי לאפשר זמן חשיפה מהיר יותר עם חיישן תמונה רגיש יותר. ודא שזמן החשיפה אינו יורד מתחת ל -1/30 שניות עקב רטט פוטנציאלי במערכת הצילום. רכוש תמונה.
  15. יצא את התמונות מהמצלמה למחשב. סקור את התמונות לפני הסרת הדגימה משלב המיקרוסקופ למקרה שיהיה צורך לצלם חלק מהן שוב.

7. סקירה כללית של רכישת תמונות עבור OCT ex vivo וסריקת אופטלמוסקופיה בלייזר (SLO)

  1. עבור תחום ספקטרלי OCT, מקם את הגלובוסים בחיץ פוספט במחזיק עיניים מותאם אישית עם תא עם עדשת 60 דיופטר35. הרכיבו את מחזיק העין על תושבת במכשיר הדמיה OCT קליני, והצמידו אותו למקום שבו המטופל יניח את מצחו. התקן OCT מוסיף באופן אוטומטי סרגל קנה מידה לכל תמונה.
  2. במקביל, באמצעות אותו מכשיר וכשהעין עדיין במחזיק, דמיינו את הגלובוסים עם אופטלמוסקופ לייזר סורק (SLO) באמצעות החזרה אינפרא אדומה קרובה (NIR, המשמש כתמונת איתור על ידי תוכנת המגורים), 488 ננומטר עירור פונדוס אוטופלואורסצנטי (FAF), והחזרה ללא אדום (RF).
    הערה: FAF עירור 787 ננומטר במכשיר זה מתאים רק מדי פעם מכיוון שמפצל קרן מפחית את העברת האור ל- SLO. מסיבה זו, מכשיר שני עבור תמונות FAF 787 ננומטר (ראה נקודה הבאה) משמש.
  3. בנפרד, אך כשהעין עדיין במחזיק העין, דמיינו את הגלובוסים עם 787 ננומטר FAF לזיהוי הפרעות RPE36 באמצעות מכשיר נפרד המציג היטב את השיטה הזו.

8. פרוטוקול רכישת תמונות עבור ex vivo OCT/ SLO (ראה שקופיות בחומר משלים 2)

  1. ציין את שריר הרקטוס העליון עם צבע סימון רקמות. הפעל את הלייזר (חץ כחול, חומר משלים 2, עמוד 1).
  2. בהתייחס לעמוד 2 של חומר משלים 2, מקם את ראש ה-OCT על ידי הזזת היחידה כולה בשני צירים ביחס לבסיס (חץ ירוק) ולאחר מכן העלאת הגובה (y) על ידי סיבוב הג'ויסטיק בכיוון השעון/נגד כיוון השעון (cw/ccw, חיצים כחולים). מקדו את התמונה באמצעות סיבוב הידית (חץ כתום), כשהידית השחורה ממוקמת R (*). נעל את היחידה על ידי אבטחת בורג האגודל (חץ סגול).
  3. להכניס את העין לתוך המחזיק, ולייצב מהאספקט האחורי עם ספייסרים (חומר משלים 1, עמוד 13). הפעילו לחץ קטן ככל האפשר כדי למנוע פגיעה בסקלרה. התמצאות עם סימן הרקמה של שריר הרקטוס העליון הפונה כלפי מעלה.
    הערה: המרחק המשוער מקדמת מחזיק העין למכשיר OCT הוא 25 מ"מ.
  4. פתח את תוכנת ההדמיה והניתוח הקניינית עבור התקן OCT. רשימת מטופלים תופיע בעמודה הימנית. תורמי העיניים המסודרים לפי מספר קוד פנימי הם ה"מטופלים". עיין במדריך למשתמש של היצרן.
  5. בחר את סמל המטופל החדש . מלא את פרטי נתוני המטופל לפי הצורך. בחר אישור. השתמש במערכת מספור מסודרת לוגית עבור עיניים בודדות, כגון YYYYNNNL,R_agesex. לדוגמה, זה יכול להיות 2017016R_97F.
  6. לאחר המשך הזנת הנתונים בחלון הבא, לחץ על אישור. בחר את המפעיל ולמד מהתפריט הנפתח.
    הערה: המידע שהוזן יופיע במטה-נתונים הניתנים לייצא.
  7. לאחר צפייה במסך ריק, גע בלחצן הצהוב כדי להתחיל ברכישת התמונה.
  8. הקש IR + OCT (ליד השתקפות אינפרא אדום + OCT). אפשר ללייזר לקבל תמונת SLO חיה של הפונדוס ו-OCT B-scan.
    1. סיימו את המיקום האנטומי הנכון בהתבסס על ה-ONH וה-fovea, והשתמשו באפליקטור עץ כדי להתאים את מיקום העיניים במחזיק. בלוח הבקרה, סובב את הלחצן העגול השחור כדי להתאים את העוצמה.
    2. לחץ על אותו כפתור כדי ליצור ממוצע של 9-100 פריימים (חצים אדומים; 9 מספיק, 100 נראה שמנת). אם היחידה מכוונת נכון, הפונדוס צריך להיות בפוקוס, וסריקת OCT B אמורה להופיע בשליש העליון של התצוגה (חומר משלים 2, עמוד 9, חץ אדום כפול).
    3. בתמונת פונדוס, השתמש בסמן כדי להזיז את הקו הכחול למרכז הגומה המרכזית (חומר משלים 2, עמוד 9, חץ לבן). לחץ על Acquire.
      הערה: לחצני ברירת מחדל אחרים הם Retina, EDI (כבוי) וסריקת קו.
  9. לחץ על RF + OCT לרכישה הבאה. בדקו שוב את המיקום כדי לוודא שהתמונה לא זזה או התקלקלה. לחץ על הכפתור השחור לממוצע. לחץ על Acquire.
  10. החליפו את הקובייה הפנימית לצורך הדמיה אוטופלואורסצנטית באורכי גל עירור של 488 ננומטר ו-787 ננומטר (חומר משלים 2, עמוד 10).
    הערה: מיקום הקובייה לאחר המתג מוצג.
  11. בחר מצב Autofluorescence . בדוק מחדש את היישור. לחץ על Acquire.
  12. במקרים חשודים של הפרעה וניוון RPE, בחר ICGA (אנגיוגרפיה ירוקה אינדוציאנינית) עבור 787 ננומטר autofluorescence. בדוק שוב את מיקום העיניים ולאחר מכן הקש Acquire.
    הערה: תמונת פונדוס לעתים קרובות אינה מופיעה במצב זה מכיוון שהקובייה הפנימית מחלישה את הקרן.
  13. החזירו את הקובייה הפנימית ל-R עבור IR והדמיה חופשית אדומה לרכישת נפח.
    הערה: מיקום הקובייה לאחר המתג מוצג בעמוד 13 של חומר משלים 2.
  14. כדי להשיג את אמצעי האחסון של OCT, בחר IR ואת הגדרת אמצעי האחסון. התאם את כל ההגדרות בעמוד 14 של חומר משלים 2 על ידי החלפת הכפתורים המתאימים במודול הבקרה (קוביית מקולה 30°, מרווח של 30 מיקרומטר, ממוצע בהתאם לדרישות הניסוי).
  15. שימו לב שתצוגת פונדוס ההחזרה התת-אדומה הקרובה מכוסה בקווי סריקת B כחולים. בדוק מחדש את מיקום OCT בשליש העליון של החלון הימני. לחץ על רכש במודול הבקרה והמתן 5 דקות להשלמת סריקת עוצמת הקול. לאחר השלמת רכישת ההדמיה, בחר יציאה. התמונות יישמרו (חץ אדום).
    הערה: הקווים הכחולים תוחמים את המרחקים שהוצגו בתצוגה הקודמת במיקרומטרים. הסריקות מתחילות במספור מלמטה (נחות) וממשיכות כלפי מעלה. שימו לב להתקדמות הקו האדום.
  16. לאפשר למחשב לעבד את התמונות שנרכשו, אשר יופיעו על המסך (חומר משלים 2, עמוד 16).
  17. בעת הדמיה של עיני עמית של תורם אחד, אין לשנות את מיקום תושבת ההרכבה בין העיניים. אם העין השמאלית מצולמת תחילה, התוצאות יוצגו בעמודה OD (עין ימין). לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני כדי לבחור את כל התמונות ולאחר מכן בחר מערכת הפעלה של Exchange/OD. התמונות יעברו לעמודת מערכת ההפעלה.
  18. לחץ על Select > Window > Database. ברירת המחדל של המסך היא לוח 6 בתוספת תמונת העין התורמת בעמודה הימנית (חומר משלים 2, עמוד 18). לחץ לחיצה ימנית על המטופל בתפריט הנפתח, בחר אצווה וייצא את קובץ E2E.
  19. אתר את התיקיה שנקבעה מראש שנוצרה בשולחן העבודה לצורך העברת קבצים. בחר אישור. התיקיה מכילה את קבצי E2E שיש להעתיק לכונן קשיח חיצוני ולאחסן אותם בארכיון.
  20. הבא את העין במחזיק שלה לאופטלמוסקופ לייזר סורק, המשמש בעיקר עבור 787 ננומטר autofluorescence.
    הערה: עיין במדריך למשתמש של היצרן לרכישה ולאחסון בארכיון של התמונות.
  21. הפעל את המחשב ואת הלייזר.
  22. בחר בסמל מטופל חדש . השלם את נתוני המטופל לפי הצורך.
  23. כדי לשמור על גליון נתונים זהה, לחץ על אישור. כאשר עקומת C נשארת זהה, לחץ על המשך.
  24. בחר מצב לימוד והזן את הסיסמה במידת הצורך. שמור על עקומת C על 7.7 מ"מ. לחץ על אישור.
  25. בחר המשך כדי לאמת את עקומת C. בחר את המחוון הצהוב כדי להפעיל את המצלמה.
  26. בחר את המיקום R . יישרו וכוונו את כדור הארץ. בחר את מצב IR כדי להתמקד ולכוון כפי שצוין לעיל.
  27. כיוון ראש המצלמה על ידי הזזת היחידה כולה בשני צירים ביחס לבסיס (חומר משלים 2, עמוד 28, חץ ירוק) ולאחר מכן הגבהת גובה היחידה (y) (חיצים כחולים). מקדו את התמונה באמצעות סיבוב הידית (חץ כתום). הידית השחורה נמצאת במצב R (*). לאחר שראש זה נמצא במקומו, נעל את היחידה על ידי סיבוב בורג האגודל (חץ סגול).
  28. שים לב שהמסך מופיע כפי שמוצג בעמוד 29 של חומר משלים 2.
  29. הזז את ידית הבורר מ- R ל - A. בחר ICGA (כדי להשיג אוטופלואורסצנטיות של 787 ננומטר) בכחול, עוצמה של 100%, שדה ראייה של 30° והדמיה חד-פאזית.
    הערה: כמו הצבע הירוק אינדוציאנין, המלנין מעורר על ידי אור באורך גל של 787 ננומטר.
  30. שים לב שהמסך מופיע כפי שמוצג בעמוד 31 של חומר משלים 2. הקש על הדיסק השחור לחישוב ממוצע ולאחר מכן בחר Acquire.
  31. בחר Window > Database. בחר ייבוא קובצי E2E מהתקן SLO; קבצים אלה מאוחסנים בכונן קשיח חיצוני ומועלים לשולחן העבודה.
  32. בחר פתח. בדוק שהסימונים הם ברירת המחדל ובחר אישור.
  33. שימו לב שלמטופל יש כעת שתי כרטיסיות: האחת מציגה את התמונות שהתקבלו מה-SLO (חץ כחול), והכרטיסייה השנייה מציגה את התמונות שנרכשו ממכשיר ה-OCT (חץ אדום) (חומר משלים 2, עמוד 34).
  34. לחץ לחיצה ימנית על התמונה 786 ננומטר (ICGA) וייצא את התמונה לקובץ שכותרתו SLO 786 בשולחן העבודה.
  35. כדי לשמור את תמונת SLO autofluorescence 786 ננומטר, בחר את המטופל ולחץ באמצעות לחצן העכבר הימני כדי לייצא תמונות כקובצי RAW (לקובצי .vol) לתיקייה בשולחן העבודה.
  36. כדי לייצא תמונות מהתקן OCT לצורך העברה למחשב הארכיון, העתק/הדבק מ- RAWEXPORT לתיקייה שכותרתה RAW.

9. סקירת הדמיה

  1. הרכיבו את התמונות (צבע, קובץ .vol, תמונות SLO) בתיקיות עבור כל תורם עם תיקיות משנה לכל עין, וצרו אינדקס של התיקיות ברצף לפי מזהה מעבדה.
  2. רשום את רשמי הרקמה (איכות, פתולוגיה) במסד נתונים עבור דוח סטנדרטי.
  3. סקור את אמצעי האחסון OCT המיוצאים באמצעות תוסף ImageJ פנימי.
    1. מצא את מרכז הגומה המרכזית, אשר ניתן לזהות על ידי מרכז טבילת הגומה, העלייה פנימה של רצועות הרשתית החיצוניות, או הנקודה הדקה ביותר. ברוב המקרים, אלה יהיו חופפים, אבל לא תמיד, כמו זה תלוי שימור foveal, השתנות הפרט, ואת נוכחותה של פתולוגיה.
    2. מצא סריקה סטנדרטית בפריפוביאה המעולה (2 מ"מ/67 סריקות B בכיוון המעולה; כלומר, הגדלת מספרי הסריקה).
    3. שמור ערימת .tif של אמצעי האחסון כולו לעיון מהיר בעתיד.
    4. גלול לאורך עוצמת הקול של OCT בשלמותה, החל מסריקה 1 (נחותה), תוך הקלטת מספרי הסריקה שבהם מזוהות תכונות.
    5. בדוק את האזור ההיקפי בנוסף למקולה.
      הערה: ניוון כוריורטינלי פריפפילרי בעיניים מבוגרות כולל משקעים למינריים בזאליים ייחודיים וניאו-וסקולריזציה. זהו אזור נפוץ של שינוי פיגמנטרי בעיניים קוצר ראייה וגלאוקומה, כמו גם בהזדקנות AMD37.
  4. בדוק את תצלומי הצבע, וקשר כל ממצא לאלה שנצפו על ידי OCT במידת האפשר.
    הערה: באופן כללי, קל יותר לראות את רוב הממצאים עד OCT תחילה. צילומי צבע אכן מספקים מבט גדול על האזור שמחוץ לאזור ב- SLO, פיגמנטציה כורואידית כולל נבי, נוכחות הם והפרשות קשות, ופיגמנט שחור ב- AMD ניאו-וסקולרי. פיגמנט כהה בגומה המרכזית עשוי לייצג מלנוזומים רופפים מהמקטע הקדמי ויש לשטוף אותו בעדינות עם חיץ באמצעות פיפטה.
  5. בדוק את תמונות SLO, וקשר כל ממצאים לאלה שנצפו על ידי OCT במידת האפשר.
  6. שמור סריקות B סטנדרטיות בגומה המרכזית ובפריפוביאה, סריקות B נוספות עם פתולוגיה בולטת או תכונות אחרות, ותמונות SLO בדו"ח פתולוגי.
  7. לסווג את העיניים כדלקמן: unremarkable, מפוקפק, AMD ביניים מוקדם, AMD אטרופי, AMD neovascular, אחר, לא ידוע, לא gradable, לא נרשם. "מוטל בספק" משמש אם לא ברור אם השינויים חמורים מספיק עבור סיווג אחר. "לא ניתן לדירוג" שמור לעיניים חסרות סריקות OCT שימושיות, כגון אלה עם רשתית מנותקת קשה. "לא מוקלט" שמור לעיניים המעובדות מיד עם קבלתן ללא צילום.
  8. השתמש בקריטריונים הבאים עבור AMD: שינוי RPE חמור עם משקעי דרוסן או דרוסנואידים תת-רשתית, עם או בלי סימנים של ניאו-וסקולריזציה, כגון נוזל או פיברוזיס, וללא עדות לסיבות אחרות (עודכן מ Curcio et al.10 כדי להתאים SDDs).
    הערה: האבחנה הסופית מאושרת על ידי ניתוח היסטולוגי.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

טבלה 1 מראה כי בשנים 2017-2016 החלימו 184 עיניים מ-94 תורמים לבנים שאינם סוכרתיים >80 שנים. זמן המוות הממוצע לשימור היה 3.9 שעות (טווח: 2.0-6.4 שעות). מתוך 184 העיניים שנסקרו, ל-75 (40.2%) היה AMD מסוים. זוהו הקטגוריות הבאות: לא ראוי לציון (39.7%), מפוקפק (11.4%), AMD בינוני מוקדם (22.8%), אטרופי (7.6%), ניאו-וסקולרי (9.8%), אחר (8.7%), ולא ידוע/לא נרשם/לא ניתן לציון (<1%). איור 2, איור 3, איור 4 ואיור 5 מראים הדמיה רב-ממדית ורב-מודאלית של עיניים שהשתמרו בצורה יוצאת דופן מהסדרה הזו. העיניים נבדקו בשיתוף פעולה עם רופא עיניים מומחה למחלות רשתית (J.A.K). בעוד שחלק מהעיניים הראו תווי פנים בודדים טוב יותר מאחרים, מקרים אלה נבחרו באיכות גבוהה מסביב.

כפי שמתואר38, צילום צבע ex vivo שונה מהצילום המקביל in vivo . בצקת רשתית ו / או ניתוק יכולים להפחית את הנראות של רקמות פיגמנטציה אחורית. תצפיות בעיניים טריות מצביעות על כך ששינויים אלה מתרחשים לאחר המוות ואינם מחמירים במידה ניכרת עם קיבוע מיידי. בנוסף, כלי choroidal להתרוקן לאחר המוות. בשל רקע גלי של כלי חיוור ורקמה interstitial כהה, הערכה של שינויים פיגמנטריים במישור של RPE צריך להיעזר על ידי מודלים אחרים מאשר צבע. ב - ex vivo OCT, מידע רב יותר זמין מאשר בצילום צבע. Ex vivo OCT גם שונה באופן משמעותי מ - in vivo OCT. ההבדלים העיקריים כוללים את ההחזר הכללי המוגבר של הרקמה, במיוחד ברשתית הפנימית, ההשתקפות העקבית של רצועות מסוימות (שכבת סיבי עצב, שכבת פרספקס פנימית וחיצונית, RPE), הראות הנמוכה יותר של פרטי הכורואידים, במיוחד מתחת לרשתית הבצקתית, והנראות של ניתוקי שכבת הרקמה (ראה להלן). הפסים ההיפררפלקטיביים החיצוניים ברשתית, המערבים פוטורצפטורים וה-RPE (אזור אליפסואידי, EZ; אזור אינטרדיגיטציה, IZ), נראים באופן לא עקבי ex vivo ואינם משמשים כציוני דרך בהקשר זה. הקונצנזוס הקליני בתחום הספקטרלי OCT משתמש במונח רצועת הממברנה של RPE-Bruch (BrM). עם זאת, המונח RPE-basal lamina (BL)-BrM band מועדף מכיוון שהוא מתאים להופעת מרבצים למינריים בסיסיים ב- AMD24.

איור 2 מראה מקולה חסרת ייחוד וכלי דם כורואידיים גדולים היפורפלקטיביים, עם רצועה רפלקטיבית RPE-BL-BrM בין השניים. כלי גדול ברשתית הפנימית מטיל צל על השכבות האחוריות. ה- IPL וה- OPL משקפים במידה בינונית. ב- NIR SLO, הן כלי הדם ברשתית והן בכלי הדם הכורואידיים גלויים. SLO ללא החזרה אדומה פועל בצורה הטובה ביותר עבור תכונות של הרשתית הפנימית וממשקי הזגוגית כמו סיבי ארקואט וצרור הפפילומקולרי של ה- NFL. בעיניים רגילות, SLO אוטופלואורסנציה של 488 ננומטר מראה אזור של אות מופחת כללי במקולה המרכזית עקב parafovea מעובה, ובמקרים מסוימים, ספיגה על ידי פיגמנט xanthophyll צהוב, כמו גם hyperautofluorescence רירית כלי הרשתית הגדולים, אשר מרמז על נדן רקמת חיבור. האוטופלואורסצנטיות ב 787 ננומטר מראה אזור קטן של אות מוגבר במקולה המרכזית מן RPE, אות סטרומה choroidal, פסים hypoautofluorescent המתאים כלי choroidal.

איור 3 מראה מקולה עם AMD בשלב ביניים מוקדם. המאפיינים הנראים לעין כוללים דרוסן רך (גובה RPE בצורת כיפה ליד הגומה המרכזית), SDDs (רפלקטיביות לסירוגין עם מראה משונן פנימי לרצועת RPE-BL-BrM), מוקדים היפר-רפלקטיביים (HRF, חומר רפלקטיבי עם אותה רפלקטיביות כמו RPE בשכבה, הממוקם ברשתית), ושינוי ויטליפורמי (התרחבות פנימה של אברוני RPE, הן תוך תאיים והן חוץ-תאיים, בשילוב עם מרבצים למינריים בסיסיים39). צילומי הצבע מראים פיגמנטציה חזקה המתאימה לנגע הוויטליפורמי, מוקפת בפיגמנטציה מופחתת. לא הדרוסן ולא SDDs נראים בבירור על ידי צבע. החזר NIR מראה את ההשתקפות בגומה המרכזית. עירור אוטופלואורסצנטי של 488 ננומטר מראה אות מנומר בגומה המרכזית. SDDs מופיעים מדי פעם באופני SLO; זה סביר יותר אם כונני SDD נמצאים בשפע, והכי קל לראות SDDs כתבנית ניקוב במרווחים קבועים (ראו Spaide and Curcio19, איור 6). התבנית העליונה והזמנית על הגומה המרכזית באיור 3I אינה SDD, מאחר שהיא לא סדירה וממוקמת למישור מוקד שטחי. כל אופני הפנים מראים קפלים עדינים הקורנים מהגומה המרכזית. בעיניים שהשתמרו פחות טוב, קפלים דומים עשויים להיות גדולים מספיק כדי להיראות בהגדלות הצפייה הנמוכות ביותר.

איור 4 מראה מקולה עם AMD אטרופי. צילום פונדוס הצבע מראה אזורים אטרופיים מעגליים, היפרפיגמנטציה מרכזית, ונקודות היפרפיגמנטציה קטנות בפרפוביאה התואמות ב- OCT ל- HRF ברמה של שכבת סיבי הנלה-שכבה הגרעינית החיצונית (HFL-ONL). בנוסף, ב- OCT, גובה RPE שטוח נמוך עשוי לייצג משקעים למינריים בסיסיים, ניאו-וסקולריזציה לא אקסודטיבית מסוג 1, או שניהם. אטרופיה בסריקת B-גומה foveal ניתנת לזיהוי על ידי שקיעת HFL-ONL, אזור של היפר-הולכה (אור הזוהר דרך כורואיד), שינוי ויטלי עם הצללה מוגברת במרכז הגומה, ו- HRF המטיל צללים. בעין זו, החזר NIR מראה כתמים היפר-רפלקטיביים בגומה המרכזית. עירור אוטופלואורסצנטי של 787 ננומטר מראה למעשה אות המתאים להיפרפיגמנטציה של הגומה והיעדר אות באזורים האטרופיים המעגליים. האוטופלואורסצנטיות ללא אדום ו- 488 ננומטר מראות את תכונות הרשתית הפנימית.

איור 5 מראה מקולה עם ניוון מקולרי משני ל-AMD ניאו-וסקולרי. צילום פונדוס הצבע מראה פיגמנטציה שחורה בתוך האזור האטרופי. OCT מראה ניוון על ידי שקיעת (שקיעת) של HFL-ONL והיפר-הולכה מוגברת. סריקת B-foveal מראה תלולית של חומר hyperreflective subfoveal וציסטות intraretinal. ההחזרה התת-אדומה הקרובה מראה השתקפות באזור האטרופי עקב אובדן RPE וכלי הדם הכורואידיים. אזור קטן ומחזיר אור בעוצמה בגומה המרכזית אינו נראה בצבע. ההחזרה האדומה ללא מראה כלי דם ברשתית, ובתוך אזור טבעתי, כלי דם כורואידיים. האוטופלואורסצנטיות (488 ננומטר) מראה בבירור גבול אטרופי מעגלי בערך ואיים של ניוון התחלתי. אזור מרכזי נטול אות מוקף בביטול של אות בינוני וכלי כורואיד גלויים.

איור 6 מראה ממצאים נפוצים בהדמיית OCT ex vivo. בצקת יכולה להיות בולטת ברשתית הפנימית, וליצור בליטות וקפלים דרך הגומה המרכזית (איור 6A,I). נזק מכני יכול להתרחש על ידי מתיחה על הזגוגית או על ידי מגע ישיר של הרשתית עם כלי הניתוח, אשר גורם לנקע של חומר, ולפעמים לאובדן של החומר הזה (איור 6F,G). ניתוקים יכולים להתרחש לאורך מישורי רקמה מרובים ועשויים לייצג כוחות מתיחה יחסיים בין השכבות המתרחשים גם in vivo. כל ניתוק יכול להתרחב עוד יותר עם העיבוד הבא. הניתוק הנפוץ ביותר הוא רשתית (כלומר, בין המקטעים החיצוניים של קולטני האור לבין התהליכים האפיקליים של RPE) (איור 6B-D,F-I). התהליכים האפיקליים עשויים להתנתק מהחלקים החיצוניים או להישאר עם גופי תאי RPE, כפי שנקבע על ידי היסטולוגיה. ניתוקי רשתית עשויים להיות גדולים ומתנפחים (איור 6 B,D,I) או צרים ובקושי ניתן להבחין בהם (איור 6C,F,G). היפרדות שכבה בצילרית (BALAD40) נראתה לראשונה במעבדה ולאחר מכן נמצאה מאוחר יותר ב- OCT קליני. BALAD מיוחס לפיצול דרך החלק המיואיד של המקטעים הפנימיים של קולטני האור, אשר משאיר את החלק האליפסואידי של המקטע הפנימי ואת החלק החיצוני מחובר ל- RPE (איור 6A,D,I). אין לטעות ב- BALAD עבור SDD ב- ex vivo OCT. מישור ניתוק שלישי הוא הממברנה המגבילה הפנימית (ILM), ולעתים קרובות יש נוזל מחזיר אור שיורי בין ה-ILM לבין שכבות הרשתית הנותרות (איור 6A,B,I). הניתוק הכי פחות נפוץ הוא בין הכורואיד לסקלרה (איור 6C). הגומה המרכזית מציגה לעתים קרובות חללים ציסטואידים שאין להתייחס אליהם כפתולוגיים ללא ראיות תומכות, כמו למשל סימנים של ניאו-וסקולריזציה (איור 6H). בסריקות B בודדות, גליות של RPE יכולות ליצור רושם של דרוסן. התצוגה התלת-ממדית של נפח OCT מבהירה שהם נעים לאורך הכלים הכורואידיים (איור 6E,J). גליות עשויות לנבוע משינויי נפח דיפרנציאליים בין כלי הדם וסטרומה מתערבת לאחר המוות ובמהלך הקיבוע.

כדי לכייל את הציפיות לאיכות ולחקור את המגבלות של ex vivo OCT, איור 7 משווה את ההדמיה in vivo, הדמיה ex vivo והיסטולוגיה של שלוש עיניים שתועדו קלינית עם AMD. שלוש העיניים האלה השתמרו באופן שונה מאלה שבאיור 2, איור 3, איור 4 ואיור 5. כדי לאשר את מקורות ההחזרה המבניים של OCT, שהם תת-תאיים41, העיניים באיור 7 נשמרו ב-2.5% גלוטראלדהיד ו-1% גלוטראלדהיד כדי לאפשר היסטולוגיה של שרף אפוקסי ברזולוציה גבוהה ומיקרוסקופ אלקטרונים מתאם. גלוטראלדהיד מוסיף אטימות לדגימות האלה בהשוואה לאלה שבאיור 2, איור 3, איור 4 ואיור 5. ההשפעה של DtoP קצר יותר לעומת ארוך יותר ניכרת (איור 7A-F, 2.1 שעות לעומת איור 7G-I, 8.9 שעות). בעין עם DtoP ארוך יותר, בצקת לאחר המוות שינתה את קווי המתאר של הרשתית, וה- ILM נותק. הפתולוגיה המעניינת (צינורית הרשתית החיצונית) הייתה עדינה בהדמיה ex vivo. היא נמצאה מכיוון שמעקב העין in vivo OCT זיהה את סריקת B הרלוונטית, וניתן היה להתאים את כלי הדם הכורואידיים. בשתי העיניים עם DtoP קצר יותר, כמה פתולוגיות עיקריות (neovascularization מקולרי סוג 3) נראו מיד (איור 7A-C). אחרים נמצאו בעזרת מעקב עיניים (איור 7D-F).

Figure 1
איור 1: כריתת הקרנית מעין תורמת אנושית לצורך קיבוע טבילה ברשתית. משמאל למעלה, עין התורם הנכרת מוחזקת במקומה על ידי נדן של גזה המיוצב על ידי המוסטט; מימין למעלה, טרפין 18 מ"מ משמש ליצירת ניקוד מעגלי הכולל את הקרנית ושפה ברוחב 2 מ"מ של סקלרה; באמצע, העיגול הניקוד מסתיים על ידי חתך עם מספריים מעוקלים טעונים קפיץ, בעוד הגלובוס מיוצב; למטה משמאל, הקרנית והשפה הסקלרלית מורמות, חושפות את הקשתית (כחול) ואת הגוף הריסי (חום שזוף); באמצע התחתון, הקרנית עם השפה מורמת לחלוטין; מימין למטה, הקשתית נחתכת בניצב לשולי האישונים כדי להקל על חדירת החומר המשמר לתוך תא הזגוגית. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: הדמיה מולטימודאלית ex vivo של מקולה חסרת ייחוד. מקולה מתורמת בת 82 עם מרווח מוות לשימור של 1.97 שעות. (A) הקרן של עין ימין שנצפתה עם הסרת המקטע הקדמי (אפי-הארה). (B) תקריב של המקולה (אפי-הארה). (C) מבט מקרוב על הגומה המרכזית (epi-illumination). הקווים הירוקים מציינים את מיקומי סריקות OCT B בלוחות D ו-E. (ד,ה) OCT B-סורק דרך (D) perifovea מעולה (E) ו fovea. הרשתית (R), הכורואיד (C) עם כלי דם גדולים היפורפלקטיביים, ואת רצועת RPE-BL-BrM היפר-רפלקטיבי מתערב. בעין זו שהשתמרה בצורה יוצאת דופן, ניתן לראות גם את ה-IPL וה-OPL בעלי ההשתקפות המתונה. (D) כלי גדול ברשתית הפנימית מטיל צל על השכבות האחוריות. (E) ההפרדה בין הרשתית ל-RPE בלוח E (ראש חץ צהוב) היא מלאכותית. (F) ההחזרה התת-אדומה הקרובה מראה את הפרטים הן של כלי הדם ברשתית והן של כלי הדם הכורואידיים. (G) ההחזרה החופשית האדומה מראה את סיבי הארקוט (חץ מעוקל ירוק שמאלי) ואת צרור הפפילומקולרי (חץ ירוק) של שכבת סיבי העצב. (H) האוטופלואורסצנטיות באורך גל של 488 ננומטר מראה אזור של אות מופחת כללי במקולה המרכזית עקב פרפוביאה בצקתית מעובה, כמו גם טבעות ונקודה של אות נמוך במרכז הגומה והיפראוטופלואורסנציה המצפה את כלי הרשתית הגדולים, מה שמרמז על נדן רקמת חיבור. (I) האוטופלואורסצנטיות ב-787 ננומטר מראה אזור קטן של אות מוגבר במקולה המרכזית מה-RPE, אות בסטרומה הכורואידית, ופסים היפואוטופלואורסצנטיים המתאימים לכלי הדם הכורואידיים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3. Multimodal ex vivo הדמיה של עין תורם עם AMD ביניים מוקדם. עין תורמת מתורמת בת 97 עם מרווח מוות לשימור של 3.1 שעות. (A) הקרן של עין ימין שנצפתה עם הסרת המקטע הקדמי (אפי-אילומינציה). (B) תקריב של המקולה (אפי-הארה). הקווים הירוקים מציינים את מיקומי סריקות OCT B בלוחות D, E ו-F. (C) מבט מקרוב על הגומה המרכזית המראה היפרפיגמנטציה (חץ, תאורת פלאש). (D) SDD בפריפוביאה העליונה (חיצים כתומים) נראה באוקטובר. I Vitelliform שינוי RPE מתחת fovea (חיצים לבנים). (F) נחות מהגומה המרכזית הוא דרוזן רך עם קו היפורפלקטיבי בבסיסו (חץ צהוב) ומיקוד היפר-רפלקטיבי מעל (חץ כחול בהיר). (ז-י) תמונות האופטלמוסקופ בלייזר הסורק מראות קפלי סטלט עדינים מאוד בגומה המרכזית (נראים גם ב-C). (G) ההחזרה התת-אדומה הקרובה מראה חומר החזרה בגומה המרכזית המתאים בחלקו לחומר ויטליפורמי. (H) ההחזרה ללא אדום מראה את משטח הרשתית. (I) אוטופלואורסצנטיות באורך גל של 488 ננומטר מראה שטח של אות מופחת כולל במקולה המרכזית עקב פרפוביה מעובה מעט. כונני SDD אינם נראים בבירור. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4: הדמיה מולטימודאלית ex vivo של RPE מלא וניוון רשתית בניוון מקולרי הקשור לגיל. עין תורמת מנקבה בת 97 עם מרווח מוות לשימור של 2.33 שעות. (A) פונדוס של עין שמאל שנצפה עם הארה טרנסית. (B) תקריב של המקולה (אפי-הארה). הקווים הירוקים מציינים את מיקומי סריקות OCT B בלוחות D ו-E. (C) תקריב של הגומה המרכזית (אפי-אילומינציה) המראה היפרפיגמנטציה מרכזית (ראש חץ ירוק) ונקודות היפרפיגמנטציה קטנות (ראשי חץ צהובים). הנקודה המרכזית חומה עז מכיוון שהרשתית שמעליה דקה מאוד. הנקודות נראות רוויות מכיוון שהרשתית שמעליה עבה. אזורים אטרופיים מעגליים מסומנים (ראשי חץ לבנים). (ד,ה) OCT B- סורק דרך (D) perifovea (E) ו fovea. הרשתית (R) והכורואיד הדק (C) גלויים. (D) מוקדים היפר-רפלקטיביים (ראשי חץ צהובים) ברמת HFL-ONL מתאימים לנקודות היפר-פיגמנטיות ב-C. גובה RPE שטוח נמוך מתחתיהם עשוי לייצג משקעים למינריים בסיסיים, neovascularization סוג 1 לא exudative, או שניהם. (E) סריקת B דרך הגומה המרכזית מראה ניוון שניתן לזהות על ידי שקיעת HFL-ONL (ראש חץ אדום), אזור של היפר-הולכה, שינוי ויטלי עם הצללה מוגברת במרכז הגומה (כוכבית ירוקה), ומוקדים היפר-רפלקטיביים (ראש חץ כחול) עם הצללה. החלל ההיפורפלקטיבי בין הרשתית לרצועת RPE עשוי לייצג נוזל תת-רשתית. (F) ההחזרה התת-אדומה הקרובה מראה כתמים היפר-רפלקטיביים בגומה המרכזית. (G) התמונה ללא אדום מראה את סיבי הארקוט של ה-NFL ופריחה רפלקטיבית על פני הרשתית. (H) האוטופלואורסצנטיות של 488 ננומטר המתמקדת ברשתית מראה אות הקשור לכלי הרשתית, ללא אות הקשור ל-RPE, וכתמים אוטופלואורסצנטיים קלושים באזור המקולרי המרכזי. (I) האוטופלואורסנציה של 787 ננומטר מראה אות המתאים לפיגמנטציה ב-C. אזורים אטרופיים מעגליים ניכרים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 5
איור 5: הדמיה מולטימודאלית ex vivo של ניאו-וסקולריזציה מסוג 1 וניוון מקולרי בניוון מקולרי הקשור לגיל. עין תורמת של תורמת בת 86 עם מרווח מוות לשימור של 3.5 שעות. (A) קרן עין שמאל שנצפתה עם הסרת המקטע הקדמי (trans-illumination). (B) תקריב של המקולה המפרט גבולות אטרופיים (ראשי חץ צהובים). הקווים הירוקים מציינים את מיקומי סריקות OCT B בלוחות D ו-E. (C) תקריב של הגומה המרכזית מראה פיגמנטציה שחורה (ראשי חץ ירוקים) בתוך האזור האטרופי. (ד,ה) OCT B-סורק דרך (D) perifovea (E) ו fovea. הרשתית I והכורואיד הדק (C) גלויים. בעין זו שהשתמרה בצורה יוצאת דופן, ניתן לראות גם את ה-IPL וה-OPL בעלי ההשתקפות המתונה. (D) סריקת B היקפית רועה את הקצה העליון של האזור האטרופי. ניוון הוא עדות על ידי צניחה של HFL-ONL ו hypertransmission מוגברת (ראשי חץ אדומים). משקעי דרוסנואידים תת-רשתית אפשריים מסומנים (ראשי חץ פוקסיה). (E) סריקת B-foveal מראה תלולית של חומר תת-עוברי היפר-רפלקטיבי וציסטות תוך רשתית (כוכבית). O = ראש עצב הראייה. (F) ההחזרה התת-אדומה הקרובה מראה אזור מחזיר אור של כלי ניוון וכורואידים (ראשי חץ כחולים), כולל אזור אינטנסיבי קטן במקולה המרכזית (ראש חץ כתום) שאינו נראה בהדמיית צבע. (G) ההחזרה האדומה ללא מראה כלי דם ברשתית, ובתוך אזור טבעתי, כלי דם כורואידיים. (H) האוטופלואורסנציה של 488 ננומטר מתארת גבול אטרופי מעגלי בערך (ראשי חץ צהובים) ואיים של ניוון התחלתי. אזור מרכזי נטול אוטופלואורסצנטיות מוקף בטל של אוטופלואורסצנטיות מתונה וכלי כורואיד גלויים (ראשי חץ לבנים). אוטופלואורסצנטיות של 787 ננומטר לא הייתה אפשרית בעין זו. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 6
איור 6: ממצאים נפוצים שנצפו בהדמיית OCT ex vivo של עיניים תורמות. עיניים אלה מגיעות מסדרת העיניים 2016-2017. רוב הרשתיות הן היפר-רפלקטיביות ביחס לרשתית המצולמת in vivo, ושכבות הרשתית הפנימיות הן רפלקטיביות יותר משכבות הרשתית החיצוניות. היפרדות בצילרית (ראשי חץ צהובים בלוחות A, D, G ו-I) מוגדרת כפיצול ברמת מיואיד המקטע הפנימי של קולטני האור, היוצר חלל תוך-רשתית ייחודי40. היפרדות רשתית (ראשי חץ ירוקים בלוחות B, C, D, F, G ו-I) מתארת הפרדה של הרשתית הנוירו-חושית כולה מה-RPE 42 הבסיסי. ניתוקים של הממברנה המגבילה הפנימית (ILM) מפרידים בין שכבת ה-ILM לבין שכבת סיבי העצב (ראשי חץ אדומים בלוחות A, B ו-I). ניתוק כורואידי (ראש חץ כחול בלוח C) הוא הפרדה בתוך הכורואיד או בין הכורואיד לסקלרה. נזק מכני (חץ סגול בלוחות F ו-G) יכול להופיע בכל רמה ובכל ממד, כפי שחל על חומר חסר (חץ ירוק בלוח G) וחומר נקע (חץ צהוב בלוח G). בצקת הרשתית (כוכבים סגולים בלוחות A ו-I) מופיעה כעיבוי של רקמת הרשתית עם גבולות לא מוגדרים היטב בין שכבות הרשתית הנפרדות. RPE גלי (חצים כחולים בלוחות E ו-J) מופיע כשכבת RPE גלית לא אחידה. נגעים ציסטואידים (ריבוע אדום בלוח H) מתואמים עם שינויים דמויי חדר היפורפלקטיבי ברקמת הרשתית, בדרך כלל בגומה המרכזית. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 7
תרשים 7נראות Ex vivo של הפתולוגיה הנראית in vivo תלויה באיכות השימור.: (A-אני) פאנלים A, Bו Cלוחות D, Eו Fוחלוניות., G, Hו אני מייצגות שלוש עיניים שתועדו קלינית משני תורמים, שכל אחת מהן נראית באמצעות מעקב עיניים in vivo (A1-A2,D1-D2,G1-G2) וכן ex vivo (B1-B2,E1-E2,H1-H2) הדמיה, ואחריה היסטולוגיה (C,F,אני). הקווים הירוקים על ההחזרה התת-אדומה הקרובה (NIR, A1,B1,D1,E1,G1,H1) מייצגים את רמות טומוגרפיית הקוהרנטיות האופטית (OCT), סריקות B והיסטולוגיה פנורמית. לוחות A, Bו C ופאנלים D, Eו Fמציגים את עינה הימנית והשמאלית, בהתאמה, של תורמת אחת בשנות ה-90 לחייה., לוחות G, Hו אני להראות עין ימין של תורמת שנייה, גם היא בשנות ה -90 לחייה. (A-Cרקמת עין שמורה היטב (DtoP: 2.1 שעות) מאפשרת ראות טובה של הפתולוגיה העיקרית. (A) ניאו-וסקולריזציה מקולרית תוך-רשתית היפר-רפלקטיבית (סוג 3 MNV, ראש חץ ירוק) מוקפת בנוזל תוך רשתית 17 חודשים לפני המוות (A2). קומפלקס הממברנות של RPE/Bruch מפוצל על ידי חומר היפורפלקטיבי ומופיע כסימן "שכבה כפולה" (A2). משמאל מופיע שלט נוסף בשכבה כפולה עם היפר-שידור ברקוד לתוך הכורואיד (ראש חץ כתום). הלאה ex vivo אוק (B2), סוג 3 MNV וברקוד hypertransmission גלויים בבירור ומסומנים. הרשתית מנותקת באופן מלאכותי, כפי שמראה ראש החץ הלבן. ההיסטולוגיה הפנורמית מראה נגע MNV מסוג 3 בכיוון אנכי (ראש חץ ירוק, C1). ראה מחקרים קודמים43,44 לפרטים על המקרה המקורי. (D-Fרקמת עין שהשתמרה היטב (DtoP: 2.1 שעות) יכולה לגרום לשקיפות מופחתת אך עדיין מספיקה לגילוי פתולוגיה מרכזית. ה-OCT (D2) מראה ערימה של מוקדים היפר-רפלקטיביים תוך רשתית (HRF, ראש חץ פוקסיה) בעין שאחריה מתבצע MNV אקסודטיבי מסוג 3. אין ציסטות תוך רשתית גלויות לאחר 11 חודשים לפני המוות. הלאה ex vivo אוק (E2), ערימת HRF דחוסה אנכית (ראש חץ פוקסיה) אך מסומנת בבירור. על היסטולוגיה פנורמית (F1), מגדל אפיתל פיגמנט רשתית (ראש חץ פוקסיה) עולה כלפי מעלה מדרוזה רכה. (G-אני) רקמת עין פחות שמורה היטב (DtoP: 8.9 שעות) גורמת לנראות מופחתת של פתולוגיה מרכזית. OCT מציין צינורית רשתית חיצונית (ORT, ראש חץ צהוב) 48 חודשים לפני המוות (G2). על ex vivo OCT, ה- ORT מופיע כהפרעה עדינה, והיה קשה להבחין בכך ללא ידע מוקדם (H2). הקרום המגביל הפנימי מנותק עובדתית (ראש חץ לבן). בצקת עיוותה את קווי המתאר של הרשתית. הניתוח ההיסטולוגי מראה את לומן ORT התחום על ידי הממברנה המגבילה החיצונית והפוטורצפטורים הבולטים לתוכו (אני1). ראה מחקרים קודמים26,45 לפרטים על המקרה המקורי. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

מספרים אחוזים
קטגוריית אבחון עיניים ימניות עיניים שמאליות סך עיניים ימניות עיניים שמאליות סך
לא ראוי לציון 39 34 73 41.50% 37.80% 39.70%
AMD מפוקפק 10 11 21 10.60% 12.20% 11.40%
AMD מוקדמת 20 22 42 21.30% 24.40% 22.80%
AMD אטרופי 6 8 14 6.40% 8.90% 7.60%
AMD ניאו-וסקולרי 11 7 18 11.70% 7.80% 9.80%
אחר 7 8 15 7.40% 8.90% 8.20%
ידוע 0 0 0 0.00% 0.00% 0.00%
לא הוקלט 1 0 1 1.10% 0.00% 0.50%
סך 94 90 184 100.00% 100.00% 100.00%
AMD מסוימים 37 37 75 39.40% 41.10% 40.20%
AMD אפשרי 47 48 95 50.00% 53.30% 51.60%
העיניים נצמדו בתקופה 17/6/16 - 14/9/17. קריטריונים: ≥ 80 שנה, לבן, לא סוכרתי, ≤6 שעות מוות לשימור. יעד: 184 עיניים (180 עיניים של 90 תורמים, נשמרו; 4 עיניים של 4 תורמים, נשמרו) זמן מוות לשימור (ממוצע, מקסימלי, מינימום): 3.9 שעות, 6.4 שעות, 2.0 שעות

טבלה 1: התאוששות עין התורם בשנים 2016-2017.

חומר משלים 1: סקירה כללית של הדיסקציה, צילום פונדוס צבע והדמיה מולטימודאלית מבוססת OCT. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

חומר משלים 2: פירוט ההדמיה הרב-מודאלית מבוססת OCT להמחשת השלבים בסעיפים 5-8. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

באמצעות גישת סינון מבוססת אוכלוסייה במהלך תקופה של 16 חודשים בעידן שלפני הקורונה, ניתן היה לרכוש 75 עיניים מתורם עם AMD. כולם שוחזרו עם DtoP קצר ובויימו באמצעות MMI מעוגן OCT. קריטריון הגיל (>80 שנים) נמצא מחוץ לטווח הגילאים האופייני לשחזור רקמות המיועדות לקרניות הניתנות להשתלה. למרות הגיל המתקדם, הקריטריונים שלנו הביאו לעיניים בכל שלבי AMD. פנוטיפים רבים של RPE משותפים לכל שלבי AMD, וחלקם בלעדיים ל- AMD 3,46 הניאו-וסקולרי. ההשוואה הישירה בין הדמיית ex vivo והדמיית in vivo (איור 7) אישרה כי DtoP קצר הוא גורם קריטי, יחד עם טיפול מומחים (איור 1), בהפקת תמונות ex vivo של הרשתית החיצונית המספיקות לסיווג אבחוני ברמה העליונה, וחלק מהדגימות הללו התאימו למתאם ישיר בין הדמיה להיסטולוגיה 4,35, 47. לא כל הפתולוגיה נראית ex vivo. עם זאת, הרבה יותר גלוי בעת שימוש ב-OCT בהשוואה לשיטות מבוססות צילום צבע10, במיוחד אלה הכוללות הפרדת הרשתית מה-RPE/כורואיד27. יתר על כן, מעקב עיניים מ-OCT קליני מפנה את תשומת הלב למאפיינים מוקדיים ולפעמים קטנים (איור 7).

מערכת שימור זו כוללת הליכי בנק עיניים טיפוסיים וכלים להסרת קרנית, ולאחר מכן טבילה של עין פקוחה בחומר משמר המסופק מראש. בדרך זו, אנשי בנק העיניים יכולים לשחזר רקמות מחקר ברציפות (24/7). המאפיין האחרון הוא קריטי, שכן רקמות המיועדות לנתיחות מורכבות מיידיות27,32 דורשות איוש מסביב לשעון על ידי החוקרים, בנק העיניים, או שניהם. מייצבים אחרים שיאפשרו התאוששות רקמות בכל שעה ולאחר מכן דיסקציה ועקירות מיוחדות במהלך שעות העבודה, כגון מערכת הרקמה PAXgene ו- Hibernate-A, עשויים להיות מועילים בעתיד אם אלה תואמים להדמיית OCT.

גישה זו מניבה רשתיות שנשארות מחוברות במידה רבה ל-RPE ולכן מסוגלות לייצר נתונים הניתנים לתרגום להדמיית OCT. לוקליזציה מדויקת חיונית מכיוון שהמקולה קטנה (<3% מאזור הרשתית). יתר על כן, התקדמות AMD מונעת מרבצים מיישרת קו עם הטופוגרפיה של מדוכים ומוטות48, וההתחלה המוקדמת ביותר והפגמים החזותיים המתמשכים ביותר מתרחשים במקום מסוים (כלומר, parafovea המכיל מוט ליד הגומה של כל החרוט)49. לשם השוואה ל-OCT, אימונוהיסטוכימיה עם צבעים קולורימטריים תואמת למיקרוסקופ מקיף (למשל, שדה בהיר) כדי להסביר את כל מרכיבי הרקמה, הן מסומנים והן לא מסומנים4. בדיקות מולקולריות לא ממוקדות המבוססות על מערכי דגימה יכולות למנף את היישור האופקי של פוטורצפטורים ממודרים אנכית ואת RPE כדי להגדיל ביעילות את הרזולוציה. ספקטרומטריית מסות הדמיה עם פולסי לייזר מייננים בקוטר 8 מיקרומטר ובהפרש של 10-15 מיקרומטר יכולה למקם עשרות ליפידים למדורים תת-תאיים של תאי הרשתית החיצוניים50. תעתיק שפורע מרחבית משתמש בסט מסודר מראש של פריימרים לשעתוק לאחור ברקודים על שקופיות זכוכית, שעליהם מוחלים קטעי רקמה51. טכנולוגיה זו מוגבלת כיום ללכידה בקוטר 55 מיקרומטר ומרווח של 100 מיקרומטר; צפויים שיפורים ברזולוציה שיהפכו טכנולוגיה זו למתאימה למחקר של AMD.

לפרוטוקול זה יש מגבלות. קריטריון ההחלמה משמיט אבחנות של סוכרת (30% בקרב מקבלי מדיקר באלבמה)52 בשל חשיבותו של הכורואיד בשתי המחלות. הרחקה זו מפחיתה את מאגר התורמים הכולל ומאריכה את הזמן הדרוש לאיסוף מספיק עיניים למחקר. מסיבות היסטוריות, הקריטריונים של 2016-2017 השמיטו תורמים שחורים, המייצגים כיום 14% מתורמי העין ברחבי המדינה, ותורמים שחורים נכללים כעת בפרויקטים פוטנציאליים נוכחיים. הרישום המנחה מראש לאנשים המבקשים להיות תורמי עיניים הוא נרחב, אך עדיין אינו כולל רישום נוח במרפאות מקומיות המתמחות ברשתית המטפלות בחולי AMD; פרויקט זה נמצא כעת בפיתוח. במהלך בדיקה מבוססת אוכלוסייה כמו זו, יופיעו עיניים עם מצבים חופפים בפנוטיפ עם AMD ויש להכיר אותן בהתייעצות עם הספרות הקלינית המתפתחת ורופא עיניים המתמחה במחלות רשתית. לדוגמה, סדרת עיניים זו כללה נבי עם דרוזן53 וקו של הפרעה RPE מעל כלי פצ'י (כלי עבה בכורואיד הפנימי)54. לבסוף, AMD מוקדמת ובינונית שולבו בשל היעדר מערכת דירוג מבוססת OCT עבור AMD, אשר נמצאת בפיתוח על ידי סיווג של Atrophy Meeting קבוצה55. עם זאת, האופטימיזציה של שחזור רקמות ואפיון מבוסס OCT מאפשרת למחקר AMD המתמקד במינוף אלמנט הזמן של MMI מעוגן OCT במעקב עיניים כדי להיות מתוכנן, מופעל, מתוזמן ותוקצב ביישומי מימון.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

C.A.C. מקבלת תמיכה מחקרית מהיידלברג הנדסה ומייעצת ל-Apellis, Astellas, Boehringer Ingelheim, Character Bioscience ו-Osanni. ת.א. מקבלת תמיכה מחקרית מנוברטיס ומייעצת לרוש, נוברטיס, באייר, נידק ואפליס. ק.ב.פ. היא יועצת לג'ננטק, Zeiss, היידלברג הנדסה, אלרגן, באייר ונוברטיס.

Acknowledgments

אנו מודים להיידלברג הנדסה על המכשור והעיצוב של מחזיק העין המקורי, ריצ'רד פ. ספייד MD על המבוא לדימות רב-מודאלי מבוסס OCT, כריסטופר גירקין MD על הקלת הגישה להתקני הדמיה קליניים, ודייוויד פישר על איור 1. ההתאוששות של עיני התורם האנושי למחקר נתמכה על ידי מענקי המכונים הלאומיים לבריאות (NIH) R01EY06019 (C.A.C.), P30 EY003039 (Pittler), R01EY015520 (Smith), R01EY027948 (C.A.C., T.A.) R01EY030192 (Li), R01EY031209 (Stambolian) ו-U54EY032442 (Spraggins), IZKF Würzburg (N-304, T.A.), קרן EyeSight של אלבמה, הקרן הבינלאומית לחקר הרשתית (C.A.C.), יוזמת ארנולד ומייבל בקמן למחקר מקולרי (C.A.C.), ומחקר למניעת עיוורון AMD Catalyst (Schey).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Beakers, 250 mL Fisher # 02-540K
Bottles, 1 L, Pyrex  Fisher # 10-462-719 storage for preservative
Bunsen burner or heat source Eisco # 17-12-818 To melt wax
Camera, digital Nikon D7200 D7200
Computer and storage Apple iMac Pro; 14 TB external hard drive Image storage
Container, insulated Fisher # 02-591-45 For wet ice
Containers, 2 per donor, 40 mL Fisher Sameco Bio-Tite  40 mL # 13-711-86 For preservative
Crucible, quartz 30 mL Fisher # 08-072D Hold globe for photography
Cylinder, graduate, 250 mL Fisher # 08-549G
Disinfectant cleaning supplies   https://www.cardinalhealth.com/en/product-solutions/medical/infection-control/antiseptics.html
Eye holder with lens and mounting bracket contact J. Messinger jeffreymessinger@uabmc.edu custom modification of Heidelberg Engineering original design
Face Protection Masks Fisher # 19-910-667
Forceps, Harmon Fix Roboz  # RS-8247
Forceps, Micro Adson Roboz  # RS-5232
Forceps, Tissue Roboz # RS-5172
Glass petri dish, Kimax Fisher # 23064
Gloves Diamond Grip Fisher # MF-300
Gowns GenPro Fisher # 19-166-116
Image editing software Adobe Photoshop 2021, Creative Suite
KimWipes Fisher # 06-666
Lamps, 3 goosenecks Schott Imaging # A20800
Microscope, stereo Nikon SMZ 1000 for dissection
Microscope, stereo Olympus  SZX9 color fundus photography
Paraformaldehyde, 20%  EMS # 15713-S for preservative; dilute for storage
pH meter Fisher  # 01-913-806
Phosphate buffer, Sorenson’s, 0.2 M pH 7.2  EMS # 11600-10
Ring flash B & H Photo Video Sigma EM-140 DG 
Ruby bead, 1 mm diameter Meller Optics # MRB10MD
Safety Glasses 3M Fisher # 19-070-940
Scanning laser ophthalmoscope Heidelberg Engineering HRA2
Scissors, curved spring Roboz # RS-5681
Sharps container Fisher # 1482763
Shutter cord, remote Nikon MC-DC2
Spectral Domain OCT device Heidelberg Engineering Spectralis HRA&OCT https://www.heidelbergengineering.com/media/e-learning/Totara-US/files/pdf-tutorials/2238-003_Spectralis-Training-Guide.pdf
Stainless steel ball bearing, 25.4 mm diameter McMaster-Carr # 9529K31
Tissue marking dye, black Cancer Diagnostics Inc # 0727-1
Tissue slicer blades Thomas Scientific # 6767C18
Trephine, 18-mm diameter Stratis Healthcare # 6718L
TV monitor (HDMI) and cord for digital camera B&H Photo Video BH # COHD18G6PROB for live viewing and remote camera display features
Wax, pink dental EMS  # 72670
Wooden applicators Puritan # 807-12

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Spaide, R. F., et al. Consensus nomenclature for reporting neovascular age-related macular degeneration data: Consensus on neovascular age-related macular degeneration nomenclature study group. Ophthalmology. 127 (5), 616-636 (2020).
  2. Spaide, R. F., Ooto, S., Curcio, C. A. Subretinal drusenoid deposits a.k.a. pseudodrusen. Survey of Ophthalmology. 63 (6), 782-815 (2018).
  3. Curcio, C. A., Zanzottera, E. C., Ach, T., Balaratnasingam, C., Freund, K. B. Activated retinal pigment epithelium, an optical coherence tomography biomarker for progression in age-related macular degeneration. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 58 (6), 211-226 (2017).
  4. Cao, D., et al. Hyperreflective foci, OCT progression indicators in age-related macular degeneration, include transdifferentiated retinal pigment epithelium. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 62 (10), 34 (2021).
  5. Zanzottera, E. C., et al. Visualizing retinal pigment epithelium phenotypes in the transition to geographic atrophy in age-related macular degeneration. Retina. 36, S12-S25 (2016).
  6. Edwards, M. M., et al. Subretinal glial membranes in eyes with geographic atrophy. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 58 (3), 1352-1367 (2017).
  7. Zhang, Z., Shen, M. M., Fu, Y. Combination of AIBP, apoA-I, and aflibercept overcomes anti-VEGF resistance in neovascular AMD by inhibiting arteriolar choroidal neovascularization. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 63 (12), 2 (2022).
  8. Jiang, M., et al. Microtubule motors transport phagosomes in the RPE, and lack of KLC1 leads to AMD-like pathogenesis. Journal of Cell Biology. 210 (4), 595-611 (2015).
  9. Collin, G. B., et al. Disruption of murine Adamtsl4 results in zonular fiber detachment from the lens and in retinal pigment epithelium dedifferentiation. Human Molecular Genetics. 24 (24), 6958-6974 (2015).
  10. Curcio, C. A., Medeiros, N. E., Millican, C. L. The Alabama Age-related Macular Degeneration Grading System for donor eyes. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 39 (7), 1085-1096 (1998).
  11. Bastek, J. V., Siegel, E. B., Straatsma, B. R., Foos, R. Y. Chorioretinal juncture. Pigmentary patterns of the peripheral fundus. Ophthalmology. 89 (12), 1455-1463 (1982).
  12. Lewis, H., Straatsma, B. R., Foos, R. Y., Lightfoot, D. O. Reticular degeneration of the pigment epithelium. Ophthalmology. 92 (11), 1485-1495 (1985).
  13. Lewis, H., Straatsma, B. R., Foos, R. Y. Chorioretinal juncture. Multiple extramacular drusen. Ophthalmology. 93 (8), 1098-1112 (1986).
  14. Sarks, J. P., Sarks, S. H., Killingsworth, M. C. Evolution of geographic atrophy of the retinal pigment epithelium. Eye. 2 (5), 552-577 (1988).
  15. Sarks, J. P., Sarks, S. H., Killingsworth, M. C. Evolution of soft drusen in age-related macular degeneration. Eye. 8 (3), 269-283 (1994).
  16. Ghazi, N. G., Dibernardo, C., Ying, H. S., Mori, K., Gehlbach, P. L. Optical coherence tomography of enucleated human eye specimens with histological correlation: Origin of the outer "red line". American Journal of Ophthalmology. 141 (4), 719-726 (2006).
  17. Brown, N. H., et al. Developing SDOCT to assess donor human eyes prior to tissue sectioning for research. Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 247 (8), 1069-1080 (2009).
  18. Helb, H. M., et al. Clinical evaluation of simultaneous confocal scanning laser ophthalmoscopy imaging combined with high-resolution, spectral-domain optical coherence tomography. Acta Ophthalmologica. 88 (8), 842-849 (2010).
  19. Spaide, R. F., Curcio, C. A. Drusen characterization with multimodal imaging. Retina. 30 (9), 1441-1454 (2010).
  20. Naghavi, M., et al. From vulnerable plaque to vulnerable patient: a call for new definitions and risk assessment strategies: Part 1. Circulation. 108 (14), 1664-1672 (2003).
  21. Garcia-Garcia, H. M., Gonzalo, N., Regar, E., Serruys, P. W. Virtual histology and optical coherence tomography: from research to a broad clinical application. Heart. 95 (16), 1362-1374 (2009).
  22. Strouthidis, N. G., et al. Comparison of clinical and spectral domain optical coherence tomography optic disc margin anatomy. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 50 (10), 4709-4718 (2009).
  23. Sarks, S. H. Ageing and degeneration in the macular region: A clinico-pathological study. British Journal of Ophthalmology. 60 (5), 324-341 (1976).
  24. Sura, A. A., et al. Measuring the contributions of basal laminar deposit and Bruch's membrane in age-related macular degeneration. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 61 (13), 19 (2020).
  25. Chen, L., Messinger, J. D., Kar, D., Duncan, J. L., Curcio, C. A. Biometrics, impact, and significance of basal linear deposit and subretinal drusenoid deposit in age-related macular degeneration. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 62 (1), 33 (2021).
  26. Litts, K. M., et al. Clinicopathological correlation of outer retinal tubulation in age-related macular degeneration. JAMA Ophthalmology. 133 (5), 609-612 (2015).
  27. Olsen, T. W., Feng, X. The Minnesota grading system of eye bank eyes for age-related macular degeneration. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 45 (12), 4484-4490 (2004).
  28. Mano, F., Sprehe, N., Olsen, T. W. Association of drusen phenotype in age-related macular degeneration from human eye-bank eyes to disease stage and cause of death. Ophthalmology Retina. 5 (8), 743-749 (2021).
  29. Age-related eye disease study research group. The Age-Related Eye Disease Study system for classifying age-related macular degeneration from stereoscopic color fundus photographs: The Age-Related Eye Disease Study Report Number 6. American Journal of Ophthalmology. 132 (5), 668-681 (2001).
  30. Arnold, J. J., Sarks, S. H., Killingsworth, M. C., Sarks, J. P. Reticular pseudodrusen. A risk factor in age-related maculopathy. Retina. 15 (3), 183-191 (1995).
  31. Olsen, T. W., Bottini, A. R., Mendoza, P., Grossniklausk, H. E. The age-related macular degeneration complex: linking epidemiology and histopathology using the Minnesota grading system (the inaugural Frederick C. Blodi Lecture). Transactions of the American Ophthalmological Society. 113, (2015).
  32. Owen, L. A., et al. The Utah protocol for postmortem eye phenotyping and molecular biochemical analysis. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 60 (4), 1204-1212 (2019).
  33. Wang, J. J., et al. Ten-year incidence and progression of age-related maculopathy: The Blue Mountains Eye Study. Ophthalmology. 114 (1), 92-98 (2007).
  34. Joachim, N., Mitchell, P., Burlutsky, G., Kifley, A., Wang, J. J. The incidence and progression of age-related macular degeneration over 15 years: The Blue Mountains Eye Study. Ophthalmology. 122 (12), 2482-2489 (2015).
  35. Pang, C., Messinger, J. D., Zanzottera, E. C., Freund, K. B., Curcio, C. A. The onion sign in neovascular age-related macular degeneration represents cholesterol crystals. Ophthalmology. 122 (11), 2316-2326 (2015).
  36. Keilhauer, C. N., Delori, F. C. Near-infrared autofluorescence imaging of the fundus: Visualization of ocular melanin. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 47 (8), 3556-3564 (2006).
  37. Curcio, C. A., Saunders, P. L., Younger, P. W., Malek, G. Peripapillary chorioretinal atrophy: Bruch's membrane changes and photoreceptor loss. Ophthalmology. 107 (2), 334-343 (2000).
  38. Curcio, C. A. Imaging maculopathy in the post-mortem human retina. Vision Research. 45 (28), 3496-3503 (2005).
  39. Brinkmann, M., et al. Histology and clinical lifecycle of acquired vitelliform lesion, a pathway to advanced age-related macular degeneration. American Journal of Ophthalmology. 240, 99-114 (2022).
  40. Ramtohul, P., et al. Bacillary layer detachment: Multimodal imaging and histologic evidence of a novel optical coherence tomography terminology. Literature review and proposed theory. Retina. 41 (11), 2193-2207 (2021).
  41. Wilson, J. D., Foster, T. H. Mie theory interpretations of light scattering from intact cells. Optics Letters. 30 (18), 2442-2444 (2005).
  42. Ghazi, N. G., Green, W. R. Pathology and pathogenesis of retinal detachment. Eye. 16 (4), 411-421 (2002).
  43. Berlin, A., et al. Correlation of optical coherence tomography angiography of type 3 macular neovascularization with corresponding histology. JAMA Ophthalmology. 140 (6), 628-633 (2022).
  44. Berlin, A., et al. Histology of type 3 macular neovascularization and microvascular anomalies in anti-VEGF treated age-related macular degeneration. Ophthalmology Science. 3 (3), 100280 (2023).
  45. Schaal, K. B., et al. Outer retinal tubulation in advanced age-related macular degeneration: optical coherence tomographic findings correspond to histology. Retina. 35 (7), 1339-1350 (2015).
  46. Chen, L., et al. Histology and clinical imaging lifecycle of black pigment in fibrosis secondary to neovascular age-related macular degeneration. Experimental Eye Research. 214, 108882 (2022).
  47. Balaratnasingam, C., et al. Histologic and optical coherence tomographic correlations in drusenoid pigment epithelium detachment in age-related macular degeneration. Ophthalmology. 124 (1), 644-656 (2017).
  48. Curcio, C. A., et al. Subretinal drusenoid deposits in non-neovascular age-related macular degeneration: Morphology, prevalence, topography, and biogenesis model. Retina. 33 (2), 265-276 (2013).
  49. Owsley, C., et al. Biologically guided optimization of test target location for rod-mediated dark adaptation in age-related macular degeneration: ALSTAR2 baseline. Ophthalmology Science. 3 (2), 100274 (2023).
  50. Anderson, D. M. G., et al. The molecular landscape of the human retina and supporting tissues by high resolution imaging mass spectrometry. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 31 (12), 2426-2436 (2020).
  51. Lee, J., Yoo, M., Choi, J. Recent advances in spatially resolved transcriptomics: challenges and opportunities. BMB Reports. 55 (3), 113-124 (2022).
  52. Diabetes. Alabama Public Health. , Available from: https://www.alabamapublichealth.gov/healthrankings/diabetes.html (2022).
  53. Francis, J. H., et al. Swept-source optical coherence tomography features of choroidal nevi. American Journal of Ophthalmology. 159 (1), 169-176 (2015).
  54. Inoue, M., Dansingani, K. K., Freund, K. B. Progression of age-related macular degeneration overlying a large choroidal vessel. Retina Cases Brief Reports. 10 (1), 22-25 (2016).
  55. Jaffe, G. J., et al. Imaging features associated with progression to geographic atrophy in age-related macular degeneration: CAM Report 5. Ophthalmology Retina. 5 (9), 855-867 (2021).

Tags

מדעי המוח גיליון 195 בנקאות עיניים ביו-בנקאות טומוגרפיה קוהרנטית אופטית הדמיה רב-מודאלית ניוון מקולרי תלוי גיל
<em>אקס ויוו</em> הדמיה מולטימודאלית מבוססת OCT של עיני תורם אנושיות למחקר על ניוון מקולרי תלוי גיל
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Messinger, J. D., Brinkmann, M.,… More

Messinger, J. D., Brinkmann, M., Kimble, J. A., Berlin, A., Freund, K. B., Grossman, G. H., Ach, T., Curcio, C. A. Ex Vivo OCT-Based Multimodal Imaging of Human Donor Eyes for Research into Age-Related Macular Degeneration. J. Vis. Exp. (195), e65240, doi:10.3791/65240 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter