Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Ex Vivo Imaging multimodale basato su OCT di occhi di donatori umani per la ricerca sulla degenerazione maculare legata all'età

Published: May 26, 2023 doi: 10.3791/65240
Automatic Translation
1, 2, 1, 1, 3,4, 5, *6, *1
1Department of Ophthalmology and Visual Sciences, University of Alabama at Birmingham Heersink School of Medicine, 2Department of Ophthalmology, University Hospital of Zurich, 3Vitreous Retina Macula Consultants of New York, 4Department of Ophthalmology, New York University Grossman School of Medicine, 5Advancing Sight Network, 6Department of Ophthalmology, University Hospital Bonn
* These authors contributed equally

Summary

I test di laboratorio possono sfruttare il valore prognostico dell'imaging multimodale basato sulla tomografia a coerenza ottica longitudinale (OCT) della degenerazione maculare legata all'età (AMD). Gli occhi dei donatori umani con e senza AMD vengono ripresi utilizzando OCT, colore, oftalmoscopia laser a scansione di riflettanza nel vicino infrarosso e autofluorescenza a due lunghezze d'onda di eccitazione prima del sezionamento dei tessuti.

Abstract

Una sequenza di progressione per la degenerazione maculare legata all'età (AMD) appresa dall'imaging clinico multimodale basato sulla tomografia a coerenza ottica (OCT) (MMI) potrebbe aggiungere valore prognostico ai risultati di laboratorio. In questo lavoro, OCT e MMI ex vivo sono stati applicati agli occhi di donatori umani prima del sezionamento del tessuto retinico. Gli occhi sono stati recuperati da donatori bianchi non diabetici di età compresa tra ≥80 anni, con un tempo di morte per conservazione (DtoP) di ≤6 ore. I globi sono stati recuperati in loco, incisi con un trephine di 18 mm per facilitare la rimozione della cornea e immersi in paraformaldeide tamponata al 4%. Le immagini del fondo oculare a colori sono state acquisite dopo la rimozione del segmento anteriore con un cannocchiale da dissezione e una fotocamera reflex utilizzando l'illuminazione trans, epi- e flash a tre ingrandimenti. I globi sono stati collocati in un buffer all'interno di una camera progettata su misura con una lente da 60 diottrie. Sono stati fotografati con dominio spettrale OCT (cubo di macula di 30°, spaziatura di 30 μm, media = 25), riflettanza nel vicino infrarosso, autofluorescenza a 488 nm e autofluorescenza a 787 nm. Gli occhi AMD hanno mostrato un cambiamento nell'epitelio pigmentato retinico (RPE), con depositi di drusen o drusenoidi sottoretinici (SDD), con o senza neovascolarizzazione e senza evidenza di altre cause. Tra giugno 2016 e settembre 2017 sono stati recuperati 94 occhi destri e 90 occhi sinistri (DtoP: 3,9 ± 1,0 ore). Dei 184 occhi, il 40,2% aveva AMD, inclusa la AMD intermedia precoce (22,8%), atrofica (7,6%) e neovascolare (9,8%) e il 39,7% aveva macule insignificanti. Drusen, SDD, focolai iperriflettenti, atrofia e cicatrici fibrovascolari sono stati identificati utilizzando OCT. Gli artefatti includevano opacizzazione tissutale, distacchi (bacillare, retinica, RPE, coroideale), cambiamento cistico foveale, un RPE ondulato e danni meccanici. Per guidare la criosezione, sono stati utilizzati volumi OCT per trovare i punti di riferimento della fovea e della testa del nervo ottico e patologie specifiche. I volumi ex vivo sono stati registrati con i volumi in vivo selezionando la funzione di riferimento per l'eye tracking. La visibilità ex vivo della patologia osservata in vivo dipende dalla qualità della conservazione. Entro 16 mesi, 75 occhi rapidi di donatori di DtoP in tutte le fasi dell'AMD sono stati recuperati e messi in scena utilizzando metodi clinici MMI.

Introduction

Quindici anni di gestione della degenerazione maculare legata all'età (AMD) neovascolare con terapia anti-VEGF sotto la guida della tomografia a coerenza ottica (OCT) hanno offerto nuove conoscenze sulla sequenza di progressione e sulla microarchitettura di questa causa prevalente di perdita della vista. Un riconoscimento chiave è che l'AMD è una malattia tridimensionale che coinvolge la retina neurosensoriale, l'epitelio pigmentato retinico (RPE) e la coroide. Come risultato dell'imaging OCT dei pazienti dello studio e degli occhi dei pazienti della clinica trattati, le caratteristiche della patologia oltre a quelle viste dalla fotografia del fondo oculare a colori, uno standard clinico per decenni, sono ora riconosciute. Questi includono neovascolarizzazione intraretinica (neovascolarizzazione maculare di tipo 31, precedentemente proliferazione angiomatosa), depositi drusenoidi sottoretinici (SDD, chiamati anche pseudodrusen reticolari)2, vie multiple del destino RPE3,4 e cellule di Müller intensamente gliotiche nell'atrofia 5,6.

Sistemi modello privi di macule (cellule e animali) ricreano alcune fette di questa complessa malattia 7,8,9. Un ulteriore successo nel migliorare l'onere dell'AMD potrebbe venire dalla scoperta e dall'esplorazione della patologia primaria negli occhi umani, dalla comprensione della composizione cellulare unica della macula, seguita dalla traduzione in sistemi modello. Questo rapporto ritrae una collaborazione trentennale tra un laboratorio di ricerca accademica e una banca degli occhi. Gli obiettivi dei metodi di caratterizzazione tissutale descritti nel presente documento sono duplici: 1) informare la tecnologia diagnostica in evoluzione dimostrando le basi dell'aspetto del fondo oculare e delle sorgenti di segnali di imaging con la microscopia e 2) classificare i campioni di AMD per tecniche di scoperta molecolare mirate (immunoistochimica) e non mirate (spettrometria di massa di imaging, IMS e trascrittomica spaziale) che preservano la fovea a solo cono e la para- e perifovea ricche di bastoncelli. Tali studi potrebbero accelerare la traduzione in OCT clinico, per il quale una sequenza di progressione e un follow-up longitudinale sono possibili attraverso l'eye-tracking. Questa tecnologia, progettata per monitorare gli effetti del trattamento, registra le scansioni da una visita clinica all'altra utilizzando vasi retinici. Collegare l'OCT tracciato oculmente ai risultati di laboratorio ottenuti con tecniche distruttive potrebbe fornire un nuovo livello di valore prognostico ai risultati molecolari.

Nel 1993, il laboratorio di ricerca ha catturato fotografie a colori del fondo oscuro postmortem sulla pellicola10. Questo sforzo è stato ispirato dalla superba fotomicroscopia e istologia della retina periferica umana di Foos e colleghi 11,12,13 e dalle estese correlazioni clinico-patologiche AMD di Sarks et al.14,15. A partire dal 2009, è stato adottato l'imaging multimodale ex vivo (MMI) ancorato sul dominio spettrale OCT. Questa transizione è stata ispirata dagli sforzi simili di altri 16,17 e soprattutto dalla consapevolezza che gran parte dell'ultrastruttura descritta dai Sark era disponibile in tre dimensioni, nel tempo, nella clinica 18,19. L'obiettivo era quello di acquisire occhi con macule attaccate in un lasso di tempo ragionevole per studi ben potenziati dei fenotipi a livello cellulare nella retina, RPE e coroide. L'intento era quello di andare oltre le statistiche "per occhio" a "per tipo di lesione", uno standard influenzato dai concetti di "placca vulnerabile" della malattia cardiovascolare20,21.

Il protocollo in questo rapporto riflette l'esperienza con quasi 400 paia di occhi di donatori accesi in diversi flussi. Nel 2011-2014 è stato creato il sito Web Project MACULA di istopatologia AMD, che include spessori di strato e annotazioni da 142 campioni archiviati. Questi occhi sono stati conservati dal 1996 al 2012 in un fissativo glutaraldeide-paraformaldeide per istologia epossi-resina ad alta risoluzione e microscopia elettronica. Tutti i fundi erano stati fotografati a colori quando ricevuti e sono stati ripresi da OCT poco prima dell'istologia. Un supporto per gli occhi originariamente progettato per gli studi sul nervo ottico22 è stato utilizzato per ospitare un punzone tissutale a tutto spessore di 8 mm di diametro centrato sulla fovea. Le scansioni OCT B attraverso il centro foveale e un sito 2 mm superiore, corrispondente all'istologia agli stessi livelli, sono state caricate sul sito web, oltre a una fotografia del fondo oculare a colori. La scelta dei piani OCT è stata dettata dalla preminenza della patologia AMD sotto la fovea23 e dalla prominenza degli SDD in aree ricche di bastoncelli superiori alla fovea24,25.

A partire dal 2013, gli occhi ripresi con MMI ancorato all'OCT durante la vita erano disponibili per correlazioni clinicopatologiche dirette. La maggior parte (7 donatori su 10) ha coinvolto pazienti in uno studio di riferimento della retina (autore: K.B.F.), che ha offerto un registro di direttive avanzate per i pazienti interessati a donare i loro occhi dopo la morte per scopi di ricerca. Gli occhi sono stati recuperati e conservati dalla banca degli occhi locale, trasferiti al laboratorio e preparati allo stesso modo degli occhi del Progetto MACULA. I volumi OCT clinici pre-mortem sono stati letti senza soluzione di continuità in laboratorio, allineando così le caratteristiche patologiche osservate durante la vita con le caratteristiche osservate al microscopio26.

A partire dal 2014, la raccolta oculare prospettica è iniziata con lo screening per AMD in occhi di donatori senza anamnesi clinica ma conservati entro un limite di tempo definito (6 ore). A tale scopo, il supporto dell'occhio è stato modificato per ospitare un intero globo. Ciò ha ridotto la possibilità di distacco attorno ai bordi tagliati del punzone da 8 mm precedentemente utilizzato. Gli occhi sono stati conservati in paraformaldeide tamponata al 4% per l'immunoistochimica e trasferiti all'1% il giorno successivo per la conservazione a lungo termine. Nel 2016-2017 (pre-pandemia) sono stati recuperati 184 occhi di 90 donatori. Le statistiche e le immagini in questo report sono generate da questa serie. Durante l'era della pandemia (lockdown e conseguenze del 2020), le raccolte prospettiche per la trascrittomica e le collaborazioni IMS sono proseguite a un ritmo ridotto, utilizzando essenzialmente i metodi del 2014.

Sono disponibili altri metodi per la valutazione dell'occhio del donatore. Il Minnesota Grading System (MGS)27,28 si basa sul sistema clinico AREDS per la fotografia del fondo oculare a colori 29. I limiti di questo metodo includono la combinazione di AMD atrofica e neovascolare in uno stadio di "AMD tardiva". Inoltre, l'MGS comporta la rimozione della retina neurosensoriale prima della foto-documentazione della coroide RPE. Questo passaggio rimuove gli SDD a vari gradi30,31 e rimuove la corrispondenza spaziale della retina esterna e del suo sistema di supporto. Pertanto, gli sforzi per collegare la domanda metabolica e la segnalazione dalla retina alla patologia nella RPE-coroide possono essere ostacolati. Il sistema Utah ha implementato MMI utilizzando la fotografia a colori ex vivo e l'OCT per classificare gli occhi destinati alla dissezione in regioni per l'estrazione di RNA e proteine32. Sebbene preferibile alle estrazioni a coppa oculare intera, l'area di 3 mm di diametro a più alto rischio di progressione AMD33,34 rappresenta solo il 25% di un punch centrato sulla fovea di 6 mm di diametro. Pertanto, le tecniche in grado di localizzare i risultati in riferimento alla fovea, come il sezionamento seriale per l'immunoistochimica, sono vantaggiose.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Il comitato di revisione istituzionale dell'Università dell'Alabama a Birmingham ha approvato gli studi di laboratorio, che hanno aderito alle buone pratiche di laboratorio e al livello di biosicurezza 2/2+. Tutte le banche degli occhi degli Stati Uniti sono conformi all'Uniform Anatomical Gifts Act del 2006 e alla Food and Drug Administration degli Stati Uniti. La maggior parte delle banche degli occhi statunitensi, tra cui Advancing Sight Network, sono conformi agli standard medici della Eye Bank Association of America.

La tabella dei materiali elenca le forniture e le attrezzature. Il materiale supplementare 1 fornisce una panoramica della dissezione, della fotografia del fondo oculare a colori e dell'MMI basato sull'OCT. Il materiale supplementare 2 fornisce informazioni dettagliate sull'MMI basato sullo PTOM

1. Criteri per la raccolta dei tessuti

  1. Per massimizzare la resa degli occhi AMD in uno schermo di donatori non documentati, impostare i seguenti criteri per i donatori accettabili: età ≥80 anni, bianco, non diabetico e ≤6 ore di morte per conservazione (DtoP).
    NOTA: DtoP è definito come il tempo tra la morte e quando l'occhio viene posto in un conservante fornito, in ospedale o in laboratorio.

2. Terreno di conservazione e altri preparati (laboratorio)

  1. Produrre paraformaldeide tamponata con fosfato al 4% dal 20% di stock (acquistato). Preparare 1 L aggiungendo 200 mL di paraformaldeide al 20% (fattore di diluizione 5) a 800 mL di tampone fosfato di Sorenson 0,1 M. Testare e regolare per assicurarsi che il pH sia 7,2, se necessario. Conservare a 4 °C.
  2. Erogare 30 ml di paraformaldeide tamponata con fosfato al 4% in barattoli da 40 ml.
  3. Stock etichettato 40 ml di contenitori di conservante nella banca degli occhi in modo che il tessuto possa essere recuperato in qualsiasi momento e in qualsiasi giorno.
  4. Per la conservazione degli occhi conservati, fare l'1% di paraformaldeide dalla soluzione al 4%. Preparare 1 L aggiungendo 250 mL di paraformaldeide al 4% (fattore di diluizione 4) a 750 mL di tampone fosfato di Sorenson 0,1 M. Testare e regolare il pH se necessario. Conservare a 4 °C.
    1. Preparare 1 L di una soluzione da 0,1 M dalla soluzione 0,2 M del tampone fosfato di Sorenson, pH 7,2, combinando 500 mL di acqua distillata e 500 mL di tampone Sorenson.
    2. Regolare il pH goccia a goccia usando acido cloridrico 1 N o idrossido di sodio 1 N. Conservare a 4 °C.
  5. Creare un supporto per stabilizzare gli occhi durante la dissezione. Riempire una capsula di Petri con cera dentale riscaldata fino a quando non è liquida. Quando è leggermente freddo, fare un'impressione emisferica con un grande cuscinetto a sfere, quindi congelare il piatto per facilitare la rimozione del cuscinetto a sfere.

3. Metodi della banca degli occhi

  1. Per garantire il rapido recupero dei tessuti di ricerca, recuperare rapidamente tutti i tessuti, compresi quelli destinati al trapianto.
  2. Ricevi i rinvii di morte, come richiesto dalla legge, entro 1 ora dal decesso e traccia ogni donatore con un numero di sequenza di riferimento che segue il tessuto.
  3. Per trovare casi con potenziale documentazione clinica, porre domande specifiche su AMD e malattie oculari nell'intervista di valutazione del rischio del donatore di ricerca.
  4. Per ridurre al minimo il tempo di viaggio, recuperare interi globi (distinti dalle sole cornee per il trapianto) all'interno di un'area compatta (ad esempio, città e contea suburbana adiacente).
  5. Portare due barattoli di conservante (tamponato 4% paraformaldeide) nella stanza d'ospedale del defunto per il recupero dei tessuti (invece di aspettare che il corpo venga spostato in un obitorio).
  6. Prima e durante il recupero, comunicare con gli investigatori per confermare la consegna e i tempi.
  7. Recuperare i globi in loco in ospedale, aprirli con metodi di manipolazione coerenti e immergere l'occhio aperto nel conservante (Figura 1).
    1. Tenere l'occhio del donatore asportato in posizione usando una guaina di garza stabilizzata da un emostato.
    2. Per facilitare la rimozione della cornea con un bordo largo 2 mm di sclera, utilizzare un trephine di 18 mm di diametro per segnare il globo.
    3. Per liberare la cornea con un bordo di sclera, tagliare lungo il cerchio segnato usando forbici caricate a molla con punte curve mentre stabilizza il globo con la garza tagliata dall'emostato.
    4. Sollevare la cornea dalla sclera, esponendo l'iride e il corpo ciliare.
    5. Per facilitare la penetrazione del conservante nella camera vitreale, fare una fessura lunga 2 mm nell'iride perpendicolare al margine pupillare. Porre gli occhi in barattoli di campioni con 30 ml di conservante a 4 °C e trasferirli in laboratorio su ghiaccio umido.
  8. Trasmettere elettronicamente le informazioni del donatore de-identificato dalla banca degli occhi al database del laboratorio di ricerca.
    NOTA: il database mantiene il numero di riferimento, il numero di tessuto della banca degli occhi e il numero ID del laboratorio per il monitoraggio, oltre ad altre informazioni pertinenti.

4. Preparazione del tessuto per la fotografia del fondo oculare a colori ex vivo

  1. Utilizzare due microscopi stereo, uno per la dissezione e uno per la fotografia del fondo oculare a colori.
    NOTA: Per la transilluminazione per visualizzare i cambiamenti pigmentari, utilizzare una base per la microscopia in campo oscuro.
  2. Rimuovere i resti del segmento anteriore (iride e lente). Per stabilizzare l'occhio durante la dissezione, posizionarlo nella capsula di Petri riempita di cera (materiale supplementare 1, vetrini 7-8). Per evitare che il corpo ciliare e la retina attaccata collassino nella cavità vitreale, ridurre al minimo la perturbazione dell'anello di vitreo spesso attaccato al corpo ciliare (base vitreale).
  3. Contrassegnare il polo superiore per l'orientamento. Posizionare il globo con il lato anteriore verso il basso nel piatto. Trova i tendini di inserimento del retto superiore e dei muscoli obliqui superiori. Utilizzando un applicatore di legno, applicare con parsimonia un inchiostro marcatore in una linea di 10 mm in direzione anteriore o posteriore (cioè perpendicolare all'inserimento tendineo del muscolo retto superiore).
  4. Prima della fotografia, riempire il fondo con tampone fosfato freddo di Sorensen.
  5. Inserire una perla di rubino di 1 mm nel fondo come barra della scala interna da visualizzare in ogni immagine27.
  6. Acquisisci immagini a colori con una fotocamera reflex a obiettivo singolo montata su un microscopio stereo dotato di un flash ad anello. Utilizzare l'illuminazione trans, epi- e flash a ciascuno dei tre ingrandimenti standard per catturare immagini destinate a evidenziare aree specifiche (materiale supplementare 1, diapositiva 11): 1) il fondo dell'equatore, 2) il polo posteriore (arcate vascolari, testa del nervo ottico, fovea) e 3) la fovea all'interno della macula lutea (macchia gialla).

5. Preparazione per la fotografia del fondo oculare a colori ex vivo

  1. Accendere la fotocamera e il monitor. Collegare l'otturatore remoto e rilasciare l'attuatore nel cavo e nel cavo di visualizzazione e nella videocamera/televisione (TV) HDMI (High-Definition Multimedia Interface).
  2. Impostare le impostazioni della fotocamera sulla funzione ISO manuale e sulla posizione di blocco dello specchio (bloccata in posizione per ridurre le vibrazioni).
    NOTA: fare riferimento al manuale utente del produttore per le impostazioni sulla fotocamera utilizzata. Impara dal display della fotocamera le impostazioni di sovra/sottoesposizione relative all'istogramma e alle letture dell'esposizione.
  3. Disporre due sorgenti luminose, ciascuna con due guide luminose flessibili posizionate perpendicolarmente l'una all'altra, per l'illuminazione nelle quattro direzioni cardinali sullo stadio del microscopio (materiale supplementare 1, pagina 10).
  4. Accendere le sorgenti luminose epi-illuminazione alla massima potenza.
    NOTA: è utile ma non necessario avere un sudario di feltro nero intorno al palco per limitare la dispersione della luce / flash per il fotografo.
  5. Al microscopio da dissezione, utilizzare una pinza per inserire il polo posteriore in un crogiolo di quarzo da 30 ml riempito con tampone. Lasciare che il tessuto affondi sul fondo. Inserire un rinforzo, come una spugna di tessuto, tra l'occhio e la parete del crogiolo per impedire il movimento. Inserire il tallone di rubino da 1 mm nel polo posteriore.
    NOTA: Il tallone può cadere nella coppa del nervo ottico.
  6. Posizionare con attenzione il globo nel crogiolo sul palco del microscopio stereoscopico e osservare il fondo oculare interno attraverso gli oculari del microscopio. Utilizzando l'ingrandimento più basso, orientare l'occhio identificando il segno di tessuto a ore 12, la testa del nervo ottico (ONH) e la fovea 5 ° sotto l'ONH. Ruotare l'occhio in modo che la fovea scenda al di sotto di una linea attraverso l'ONH di 5°.
    NOTA: Se si tratta di un occhio destro, l'ONH è a destra della fovea, come visto attraverso gli oculari del microscopio. Se si tratta di un occhio sinistro, l'ONH è a sinistra della fovea.
  7. Accendere la visualizzazione del monitor remoto dalla fotocamera. Assicurarsi che il cursore beam-splitter del microscopio sia impostato per osservare attraverso la porta fotografica e non attraverso la porta per gli oculari. A seconda del percorso della luce e dello specchio, preparati a ruotare il tessuto di 180 ° sul palco per un corretto orientamento.

6. Acquisizione di immagini utilizzando la fotografia del fondo oculare a colori ex vivo

  1. Con l'epi-illuminazione attivata, impostare l'ingrandimento in modo che l'intera incisione trefina di 18 mm occupi l'intero campo visivo. Aumentare l'ingrandimento in modo che sia possibile concentrarsi sul fondo della fossa foveale. Ridurre l'ingrandimento all'impostazione precedente.
  2. Regolare le impostazioni ISO nell'intervallo 1.600-3.000 in modo che i tempi di esposizione rientrino nell'intervallo centrale del misuratore sulla fotocamera.
  3. Premere il grilletto dell'otturatore remoto. Ascolta lo specchio per bloccarsi in posizione verticale. Premere nuovamente il grilletto per l'esposizione.
  4. Osservare l'immagine sul monitor, con i metadati preimpostati che mostrano rosso, verde, blu (RGB) e un istogramma a colori per l'esposizione corretta. Se l'esposizione è accettabile, procedere; In caso contrario, eliminare, rivalutare i parametri e ricreare l'immagine.
  5. Spegnere le lampade a collo d'oca per l'epi-illuminazione per evidenziare le drusen e accendere il flash, con un'esposizione di 1/4 di s, una velocità dell'otturatore della fotocamera di 1/250 s e un ISO di 100-320. Impostare la velocità del flash come predefinita o modificarla durante la configurazione iniziale della fotocamera. Acquisire un'immagine e controllare l'istogramma per una corretta esposizione.
  6. Spegnere il flash e accendere la sorgente luminosa di transilluminazione. Reimpostare l'ISO su 5.000 e assicurarsi che il tempo di esposizione non scenda al di sotto di 1/30 s a causa di potenziali vibrazioni nel sistema fotografico. Acquisire un'immagine e controllare l'istogramma per una corretta esposizione.
  7. Aumentare l'ingrandimento per visualizzare sia l'ONH che la fovea nel campo visivo. Accendere le lampade epi-illuminazione. Impostare l'intervallo ISO su 1.600-3.000. Assicurarsi che i tempi di esposizione rientrino nell'intervallo centrale della fotocamera.
  8. Spegnere le lampade epi-illuminazione e accendere il flash, con un'esposizione di 1/4 s, la velocità dell'otturatore della fotocamera preimpostata impostata su 1/250 s e l'ISO impostato su 400-800. Acquisire un'immagine e controllare l'istogramma per una corretta esposizione.
  9. Spegnere il flash e accendere la transilluminazione utilizzando la base in campo scuro. Reimpostare l'ISO su 5.000. Assicurarsi che il tempo di esposizione non sia più lento di 1/30 di s a causa delle potenziali vibrazioni nel sistema fotografico. Acquisire un'immagine e verificare la presenza di un istogramma corretto.
  10. Spegnere la transilluminazione e riaccendere le lampade di epiilluminazione.
  11. Aumentare l'ingrandimento a quello utilizzato nel passaggio 6.7. Rifocalizzare se necessario.
  12. Aumentare l'ISO nell'intervallo 3.000-6.000 e regolare il tempo di esposizione in modo che rientri nell'intervallo di esposizione corretto della fotocamera. Acquisire un'immagine.
    NOTA: il tallone rubino potrebbe non essere più visualizzato nel campo visivo. In tal caso, cattura immagini separate del tallone a questo ingrandimento come riferimento.
  13. Spegnere le lampade epi-illuminazione. Accendere il flash con un'esposizione di 1/4 s e con la velocità dell'otturatore della fotocamera a 1/250 s. Impostare la velocità del flash come predefinita o modificarla durante la configurazione iniziale della fotocamera e impostare l'ISO su 500-1.000. Acquisire l'immagine. Controllare l'istogramma per una corretta esposizione.
  14. Spegnere il flash e accendere le lampade di illuminazione trans. Reimpostare l'ISO a oltre 8.000 per consentire un tempo di esposizione più rapido con un sensore di immagine più sensibile. Assicurarsi che il tempo di esposizione non scenda al di sotto di 1/30 s a causa di potenziali vibrazioni nel sistema fotografico. Acquisire un'immagine.
  15. Esportare le immagini dalla fotocamera a un computer. Rivedere le immagini prima di rimuovere il campione dallo stadio del microscopio nel caso in cui sia necessario catturarne di nuovo.

7. Panoramica sull'acquisizione di immagini per OCT ex vivo e oftalmoscopia laser a scansione (SLO)

  1. Per l'OCT del dominio spettrale, posizionare i globi in un tampone fosfato in un supporto oculare personalizzato con una camera con una lente da 60 diottrie35. Montare il supporto oculare su una staffa su un dispositivo di imaging OCT clinico e collegarlo al punto in cui un paziente avrebbe appoggiato la fronte. Il dispositivo dello Strumento di personalizzazione di Office inserisce automaticamente una barra di scala in ogni immagine.
  2. Allo stesso tempo, utilizzando lo stesso dispositivo e con l'occhio ancora nel supporto, visualizzare i globi con un oftalmoscopio laser a scansione (SLO) utilizzando la riflettanza nel vicino infrarosso (NIR, utilizzata come immagine localizzatrice dal software di permanenza), l'autofluorescenza del fondo di eccitazione a 488 nm (FAF) e la riflettanza priva di rosso (RF).
    NOTA: L'eccitazione FAF a 787 nm in questo dispositivo è adatta solo occasionalmente perché un beam-splitter riduce la trasmissione luminosa allo SLO. Per questo motivo, viene utilizzato un secondo dispositivo per immagini FAF a 787 nm (vedi punto successivo).
  3. Separatamente, ma con l'occhio ancora nel supporto dell'occhio, visualizzare i globi con 787 nm FAF per rilevare il disturbo RPE36 utilizzando un dispositivo separato che visualizza bene questa modalità.

8. Protocollo di acquisizione delle immagini per OCT/SLO ex vivo (vedi slide in Materiale supplementare 2)

  1. Indicare il muscolo retto superiore con colorante per marcatura tissutale. Accendere il laser (freccia blu, materiale supplementare 2, pagina 1).
  2. Facendo riferimento alla pagina 2 del materiale supplementare 2, posizionare la testa dello PTOM spostando l'intera unità su due assi rispetto alla base (freccia verde) e quindi aumentando l'altezza (y) ruotando il joystick in senso orario/antiorario (cw/ccw, frecce blu). Mettere a fuoco l'immagine ruotando la manopola (freccia arancione), con la leva nera in posizione R (*). Bloccare l'unità fissando la vite a pollice (freccia viola).
  3. Inserire l'occhio nel supporto e stabilizzare dall'aspetto posteriore con distanziatori (materiale supplementare 1, pagina 13). Esercitare la minor pressione possibile per evitare di ammaccare la sclera. Orientare con il segno di tessuto per il muscolo retto superiore rivolto verso l'alto.
    NOTA: la distanza approssimativa dalla parte anteriore del supporto oculare al dispositivo OCT è di 25 mm.
  4. Aprire il software proprietario di visualizzazione e analisi per il dispositivo dello Strumento di personalizzazione di Office. Un elenco di pazienti apparirà nella colonna di sinistra. I donatori di occhi indicizzati da un numero di codice interno sono i "pazienti". Fare riferimento al manuale dell'utente del produttore.
  5. Selezionare l'icona Nuovo paziente . Completare le informazioni sui dati del paziente in base alle esigenze. Selezionare OK. Utilizzare un sistema di numerazione logicamente ordinato per i singoli occhi, come YYYYNNNL,R_agesex. Ad esempio, questo potrebbe essere 2017016R_97F.
  6. Dopo aver continuato l'immissione dei dati nella finestra seguente, premere OK. Selezionare l'operatore e studiare dal menu a discesa.
    NOTA: le informazioni immesse verranno visualizzate nei metadati esportabili.
  7. Dopo aver visualizzato una schermata vuota, toccare il pulsante giallo per avviare l'acquisizione dell'immagine.
  8. Premere IR + OCT (riflettanza nel vicino infrarosso + OCT). Consentire al laser di acquisire un'immagine SLO dal vivo del fondo oculare e della scansione B OCT.
    1. Finalizzare la corretta posizione anatomica in base all'ONH e alla fovea e utilizzare un applicatore di legno per regolare la posizione dell'occhio nel supporto. Sul pannello di controllo, ruotare il pulsante rotondo nero per regolare l'intensità.
    2. Premi lo stesso pulsante per avere una media di 9-100 fotogrammi (frecce rosse; 9 è sufficiente, 100 sembrano cremosi). Se l'unità è orientata correttamente, il fondo oculare dovrebbe essere a fuoco e la scansione B dello Strumento di personalizzazione di Office dovrebbe apparire nel terzo superiore del display (materiale supplementare 2, pagina 9, doppia freccia rossa).
    3. Nell'immagine del fondo oculare, utilizzare il cursore per spostare la linea blu per centrare la fovea (Materiale supplementare 2, pagina 9, freccia bianca). Premere Acquisisci.
      NOTA: altri pulsanti predefiniti sono Retina, EDI (off) e Line Scan.
  9. Premere RF + OCT per la prossima acquisizione. Ricontrolla la posizione per assicurarti che l'immagine non si sia spostata o degradata. Premere il pulsante nero per calcolare la media. Premere Acquisisci.
  10. Commutare il cubo interno per l'imaging ad autofluorescenza alle lunghezze d'onda di eccitazione di 488 nm e 787 nm (Materiale supplementare 2, pagina 10).
    NOTA: la posizione del cubo dopo l'interruttore.
  11. Selezionare la modalità Autofluorescenza . Ricontrollare l'allineamento. Premere Acquisisci.
  12. Per i casi sospetti di interruzione e atrofia RPE, selezionare ICGA (angiografia verde di indocianina) per l'autofluorescenza a 787 nm. Ricontrollare la posizione dell'occhio, quindi premere Acquisisci.
    NOTA: Un'immagine del fondo spesso non appare in questa modalità perché il cubo interno attenua il fascio.
  13. Riportare il cubo interno a R per l'imaging IR e rosso libero per l'acquisizione del volume.
    NOTA: la posizione del cubo dopo l'interruttore è mostrata a pagina 13 del materiale supplementare 2.
  14. Per acquisire i volumi dello Strumento di personalizzazione di Office, selezionare IR e l'impostazione del volume. Abbinare tutte le impostazioni a pagina 14 del materiale supplementare 2 attivando i pulsanti appropriati sul modulo di controllo (cubo di macula di 30°, spaziatura di 30 μm, media a seconda delle esigenze sperimentali).
  15. Si noti che la vista del fondo di riflettanza nel vicino infrarosso è coperta da linee blu di scansione B. Ricontrollare la posizione dello Strumento di personalizzazione di Office nel terzo superiore della finestra di destra. Premere Acquisisci sul modulo di controllo e attendere 5 minuti per il completamento della scansione del volume. Al termine dell'acquisizione dell'imaging, selezionare EXIT. Le immagini verranno salvate (freccia rossa).
    NOTA: le linee blu delimitano in micrometri le distanze mostrate nella vista precedente. Le scansioni iniziano la numerazione dal basso (inferiore) e procedono verso l'alto. Notare la progressione della linea rossa.
  16. Consentire al computer di elaborare le immagini acquisite, che appariranno sullo schermo (Materiale supplementare 2, pagina 16).
  17. Quando si esegue l'imaging degli occhi di un donatore, non modificare la posizione della staffa di montaggio tra gli occhi. Se l'occhio sinistro viene fotografato per primo, i risultati verranno visualizzati nella colonna OD (occhio destro). Fare clic con il pulsante destro del mouse per selezionare tutte le immagini, quindi selezionare Exchange OS/OD. Le immagini verranno spostate nella colonna del sistema operativo.
  18. Premere Seleziona > finestra > database. Lo schermo predefinito è il pannello 6 con l'aggiunta dell'occhio donatore ripreso nella colonna di destra (materiale supplementare 2, pagina 18). Fare clic con il pulsante destro del mouse sul paziente nel menu a discesa, scegliere Batch ed esportare il file E2E.
  19. Individuare la cartella predeterminata creata sul desktop per i trasferimenti di file. Selezionare OK. La cartella contiene i file E2E da copiare su un disco rigido esterno e archiviare.
  20. Portare l'occhio nel suo supporto all'oftalmoscopio laser a scansione, che viene utilizzato principalmente per l'autofluorescenza a 787 nm.
    NOTA: fare riferimento alla guida per l'utente del produttore per l'acquisizione e l'archiviazione delle immagini.
  21. Accendere il computer e il laser.
  22. Selezionare l'icona Nuovo paziente . Completare i dati del paziente secondo necessità.
  23. Per mantenere lo stesso foglio dati dell'occhio, premere OK. Poiché la curva a C rimane la stessa, premere Continua.
  24. Selezionare Modalità studio e immettere la password, se necessario. Mantenere la curva a C a 7,7 mm. Premere OK.
  25. Selezionate Continua (Continue) per verificare la curva a C. Selezionare l'indicatore giallo per avviare la fotocamera.
  26. Selezionare la posizione R . Allineare e orientare il globo. Selezionare la modalità IR per mettere a fuoco e orientare come sopra.
  27. Orientare la testa della telecamera spostando l'intera unità su due assi rispetto alla base (materiale supplementare 2, pagina 28, freccia verde) e quindi sollevando l'altezza (y) dell'unità (frecce blu). Mettere a fuoco l'immagine ruotando la manopola (freccia arancione). La leva nera è in posizione R (*). Dopo che questa testa è in posizione, bloccare l'unità ruotando la vite a pollice (freccia viola).
  28. Si noti che la schermata viene visualizzata come mostrato a pagina 29 del materiale supplementare 2.
  29. Spostare la manopola del selettore da R ad A. Selezionare ICGA (per ottenere un'autofluorescenza di 787 nm) in blu, intensità del 100%, un campo visivo di 30° e imaging monofase.
    NOTA: Come il colorante verde indocianina, la melanina è eccitata dalla luce di lunghezza d'onda di 787 nm.
  30. Si noti che la schermata viene visualizzata come mostrato a pagina 31 del materiale supplementare 2. Premere il disco nero per calcolare la media, quindi selezionare Acquisisci.
  31. Scegliere Finestra > database. Selezionare Importa file E2E dal dispositivo SLO; Questi file vengono memorizzati su un disco rigido esterno e caricati sul desktop.
  32. Seleziona Apri. Verificare che gli indicatori siano quelli predefiniti e selezionare OK.
  33. Si noti che il paziente ha ora due schede: una che mostra le immagini acquisite dallo SLO (freccia blu) e l'altra scheda che mostra le immagini acquisite dal dispositivo OCT (freccia rossa) (materiale supplementare 2, pagina 34).
  34. Fare clic con il pulsante destro del mouse sull'immagine a 786 nm (ICGA) ed esportare l'immagine in un file denominato SLO 786 sul desktop.
  35. Per salvare l'immagine SLO di autofluorescenza a 786 nm, selezionare il paziente e fare clic con il pulsante destro del mouse per esportare le immagini come file RAW (per i file .vol) in una cartella sul desktop.
  36. Per esportare immagini dal dispositivo dello Strumento di personalizzazione di Office per trasferirle al computer di archiviazione, copiate/incollate da RAWEXPORT in una cartella denominata RAW.

9. Revisione dell'imaging

  1. Assemblare le immagini (colore, file .vol, immagini SLO) in cartelle per ciascun donatore con sottocartelle per ciascun occhio e indicizzare le cartelle consecutivamente per ID laboratorio.
  2. Registrare le impronte tissutali (qualità, patologia) in un database per un rapporto standardizzato.
  3. Esaminate i volumi dello Strumento di personalizzazione di Office esportati con un plug-in ImageJ interno.
    1. Trova il centro della fovea, che può essere riconosciuto dal centro del tuffo foveale, dall'aumento verso l'interno delle bande retiniche esterne o dal punto più sottile. Nella maggior parte dei casi, questi coincideranno, ma non sempre, poiché ciò dipende dalla conservazione foveale, dalla variabilità individuale e dalla presenza di patologia.
    2. Trova una scansione standard nella perifovea superiore (2 mm / 67 scansioni B nella direzione superiore, cioè aumentando i numeri di scansione).
    3. Salvate una pila .tif dell'intero volume per una rapida consultazione futura.
    4. Scorrere il volume dello Strumento di personalizzazione di Office nella sua interezza, a partire dalla scansione 1 (inferiore), registrando i numeri di scansione in cui vengono riconosciute le caratteristiche.
    5. Controllare l'area peripapillare oltre alla macula.
      NOTA: L'atrofia corioretinica peripapillare negli occhi più anziani include un caratteristico deposito laminare basale e neovascolarizzazione. Questa è un'area comune di cambiamento pigmentario negli occhi miopi e nel glaucoma, così come nell'invecchiamento e nell'AMD37.
  4. Ispezionare le fotografie a colori e, se possibile, collegare eventuali risultati a quelli visti dallo Strumento di personalizzazione di Office.
    NOTA: in generale, è più facile vedere prima la maggior parte dei risultati per OCT. Le fotografie a colori forniscono un'ampia visione dell'area al di fuori dell'area sullo SLO, pigmentazione coroideale tra cui nevi, presenza di eme ed essudati duri e pigmento nero nell'AMD neovascolare. Il pigmento scuro nella fovea può rappresentare melanosomi sciolti dal segmento anteriore e deve essere lavato via delicatamente con tampone usando una pipetta.
  5. Ispezionare le immagini SLO e, se possibile, collegare eventuali risultati a quelli visualizzati dallo Strumento di personalizzazione di Office.
  6. Salva le scansioni B standard alla fovea e alla perifovea, le scansioni B extra con patologia notevole o altre caratteristiche e le immagini SLO in un rapporto patologico.
  7. Classificare gli occhi come segue: Insignificante, Discutibile, AMD precoce-intermedia, AMD atrofica, AMD neovascolare, Altro, Sconosciuto, Non graduabile, Non registrato. "Discutibile" viene usato se non è chiaro se i cambiamenti sono abbastanza gravi per un'altra categorizzazione. "Not Gradable" è riservato agli occhi privi di utili scansioni OCT, come quelli con retine gravemente distaccate. "Non registrato" è riservato agli occhi che vengono elaborati immediatamente dopo la ricezione senza fotografia.
  8. Utilizzare questi criteri per AMD: grave cambiamento di RPE con depositi di drusenoidi drusen o sottoretinici, con o senza segni di neovascolarizzazione, come fluido o fibrosi, e senza evidenza di altre cause (aggiornato da Curcio et al.10 per accogliere SDD).
    NOTA: La diagnosi finale è confermata dall'analisi istologica.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

La tabella 1 mostra che durante il 2016-2017 sono stati recuperati 184 occhi di 94 donatori bianchi non diabetici di età >80 anni. Il tempo medio di morte alla conservazione è stato di 3,9 ore (intervallo: 2,0-6,4 ore). Dei 184 occhi esaminati, 75 (40,2%) avevano una certa AMD. Sono state identificate le seguenti categorie: Insignificante (39,7%), Discutibile (11,4%), AMD precoce-intermedia (22,8%), Atrofica (7,6%), Neovascolare (9,8%), Altro (8,7%) e Sconosciuta/Non registrata/Non graduabile (<1%). Le Figure 2, Figure 3, Figure 4 e Figure 5 mostrano immagini ex vivo multiscala e multimodali di occhi eccezionalmente ben conservati di questa serie. Gli occhi sono stati esaminati in collaborazione con un oculista specializzato in malattie della retina (J.A.K.). Mentre alcuni occhi mostravano caratteristiche individuali migliori di altri, queste custodie sono state scelte per un'alta qualità a tutto tondo.

Come descritto38, la fotografia a colori ex vivo differisce dalla corrispondente fotografia in vivo . L'edema e/o il distacco della retina possono ridurre la visibilità dei tessuti pigmentati posteriori. Le osservazioni con occhi nuovi indicano che questi cambiamenti si verificano postmortem e non peggiorano marcatamente con una pronta fissazione. Inoltre, i vasi coroideali si svuotano dopo la morte. A causa di uno sfondo ondulato di vasi chiari e tessuto interstiziale scuro, la valutazione delle variazioni pigmentarie nel piano dell'RPE dovrebbe essere assistita da modalità diverse dal colore. Nello PTOM ex vivo , sono disponibili più informazioni che nella fotografia a colori. Ex vivo Anche gli PTOM differiscono significativamente dagli PTOM in vivo . Le principali differenze includono l'aumento complessivo della riflettività del tessuto, specialmente nella retina interna, la riflettività costante di alcune bande (strato di fibre nervose, strato plessiforme interno ed esterno, RPE), la minore visibilità dei dettagli della coroide, specialmente sotto la retina edematosa, e la visibilità dei distacchi dello strato tissutale (vedi sotto). Le bande iperriflettenti retiniche esterne, che coinvolgono i fotorecettori e l'RPE (zona ellissoide, EZ; zona di interdigitazione, IZ), sono visibili in modo incoerente ex vivo e non sono utilizzate come punti di riferimento in questo contesto. Il consenso clinico per l'OCT del dominio spettrale utilizza il termine banda di membrana di RPE-Bruch (BrM). Tuttavia, il termine RPE-banda lamina basale (BL)-BrM è preferito perché accoglie la comparsa di depositi laminari basali in AMD24.

La figura 2 mostra una macula insignificante e grandi vasi coroideali iporiflettenti, con una banda riflettente RPE-BL-BrM tra i due. Un grande vaso nella retina interna proietta un'ombra sugli strati posteriori. L'IPL e l'OPL sono moderatamente riflettenti. Nello SLO NIR sono visibili sia le vascolarature retiniche che quelle coroideali. Lo SLO di riflettanza senza rosso funziona meglio per le caratteristiche della retina interna e delle interfacce vitreoretiniche come le fibre arcuate e il fascio papillomaculare della NFL. Negli occhi normali, l'SLO di autofluorescenza a 488 nm mostra un'area di segnale complessivamente ridotta nella macula centrale a causa della parafovea ispessita e, in alcuni casi, dell'assorbimento da parte del pigmento giallo della xantofilla, nonché dell'iperautofluorescenza che riveste i grandi vasi retinici, che è indicativa di guaine del tessuto connettivo. L'autofluorescenza a 787 nm mostra una piccola regione di aumento del segnale nella macula centrale dall'RPE, un segnale nello stroma coroideale e strisce ipoautofluorescenti corrispondenti ai vasi coroideali.

La Figura 3 mostra una macula con AMD precoce-intermedia. Le caratteristiche visibili includono una drusen morbida (elevazione RPE a forma di cupola vicino alla fovea), SDD (riflettività intermittente con un aspetto dentato interno alla banda RPE-BL-BrM), fuochi iperriflettenti (HRF, materiale riflettente con la stessa riflettività dell'RPE nello strato, situato nella retina) e cambiamento vitelliforme (un'espansione verso l'interno degli organelli RPE, sia intracellulari che extracellulari, in combinazione con depositi laminari basali39). La fotografia a colori mostra una forte pigmentazione corrispondente alla lesione vitelliforme, circondata da ridotta pigmentazione. Né le drusen né gli SDD sono chiaramente visibili per colore. La riflettanza NIR mostra la riflettività nella fovea. L'autofluorescenza all'eccitazione a 488 nm mostra un segnale screziato nella fovea. Gli SDD appaiono occasionalmente sulle modalità SLO; questo è più probabile se gli SDD sono abbondanti e gli SDD sono più facilmente visti come un modello di punteggiatura regolarmente distanziato (vedi Spaide e Curcio19, Figura 6). Il pattern superiore e temporale alla fovea in Figura 3I non è SDD, perché è irregolare e localizzato su un piano focale superficiale. Tutte le modalità en face mostrano pieghe sottili che si irradiano dalla fovea. In occhi meno ben conservati, pieghe simili possono essere abbastanza grandi da essere visibili agli ingrandimenti di visualizzazione più bassi.

La figura 4 mostra una macula con AMD atrofica. La fotografia del fondo oculare a colori mostra aree atrofiche circolari, iperpigmentazione centrale e piccoli punti iperpigmentati nella parafovea che corrispondono nell'OCT alla HRF a livello dello strato di fibra di Henle-strato nucleare esterno (HFL-ONL). Inoltre, nell'OCT, un basso aumento piatto dell'RPE può rappresentare un deposito laminare basale, una neovascolarizzazione di tipo 1 non essudativa o entrambi. L'atrofia nella scansione B foveale è riconoscibile dalla subsidenza dell'HFL-ONL, un'area di ipertrasmissione (luce che brilla attraverso la coroide), un cambiamento vitelliforme con maggiore ombreggiatura nel centro foveale e HRF che proietta ombre. In questo occhio, la riflettanza NIR mostra macchie iperriflettenti nella fovea. L'autofluorescenza all'eccitazione a 787 nm mostra efficacemente un segnale corrispondente all'iperpigmentazione foveale e l'assenza di segnale nelle aree atrofiche circolari. L'autofluorescenza priva di rosso e 488 nm mostra le caratteristiche retiniche interne.

La Figura 5 mostra una macula con atrofia maculare secondaria alla AMD neovascolare. La fotografia del fondo oculare a colori mostra la pigmentazione nera all'interno dell'area atrofica. L'OCT mostra atrofia a causa del rilassamento (subsidenza) di HFL-ONL e dell'aumento dell'ipertrasmissione. La B-scan foveale mostra un tumulo di materiale iperriflettente subfoveale e cisti intraretiniche. La riflettanza del vicino infrarosso mostra riflettività nell'area atrofica a causa della perdita di RPE e vasi coroideali. Una piccola area intensamente riflettente nella fovea non è visibile sul colore. La riflettanza priva di rosso mostra vasi retinici e, all'interno di una zona anulare, vasi coroideali. L'autofluorescenza (488 nm) mostra chiaramente un bordo atrofico approssimativamente circolare e isole di atrofia incipiente. Un'area centrale priva di segnale è circondata da un anello di segnale moderato e vasi coroideali visibili.

La figura 6 mostra gli artefatti comuni nell'imaging ex vivo dello Strumento di personalizzazione di Office. L'edema può essere prominente nella retina interna, creando rigonfiamenti e pieghe attraverso la fovea (Figura 6A,I). Il danno meccanico può verificarsi con la trazione sul vitreo o per contatto diretto della retina con gli strumenti di dissezione, che provoca la dislocazione del materiale e, talvolta, la perdita di quel materiale (Figura 6F,G). I distacchi possono verificarsi lungo più piani tissutali e possono rappresentare forze di trazione relative tra gli strati che si verificano anche in vivo. Qualsiasi distacco può allargarsi ulteriormente con la successiva elaborazione. Il distacco più comune è retinico (cioè tra i segmenti esterni del fotorecettore e i processi apicali dell'RPE) (Figura 6B-D,F-I). I processi apicali possono staccarsi dai segmenti esterni o rimanere con i corpi cellulari RPE, come determinato dall'istologia. I distacchi di retina possono essere grandi e fluttuanti (Figura 6 B,D,I) o stretti e appena distinguibili (Figura 6C,F,G). Il distacco dello strato bacillare (BALAD40) è stato osservato per la prima volta in laboratorio e poi successivamente trovato nell'OCT clinico. BALAD è attribuito a una scissione attraverso la porzione mioide dei segmenti interni del fotorecettore, che lascia la porzione ellissoide del segmento interno e il segmento esterno attaccati all'RPE (Figura 6A,D,I). BALAD non deve essere confuso con SDD in ex vivo OCT. Un terzo piano di distacco è la membrana limitante interna (ILM), e c'è spesso liquido riflettente residuo tra l'ILM e gli strati retinici rimanenti (Figura 6A,B,I). Il distacco meno comune è tra la coroide e la sclera (Figura 6C). La fovea presenta spesso spazi cistoidi che non dovrebbero essere considerati patologici senza prove a supporto, come segni di neovascolarizzazione (Figura 6H). Nelle singole scansioni B, le ondulazioni dell'RPE possono dare l'impressione di drusen. La vista 3D di un volume OCT chiarisce che questi viaggiano lungo i vasi coroideali (Figura 6E,J). Le ondulazioni possono essere dovute a variazioni di volume differenziali tra i vasi e lo stroma intermedio dopo la morte e durante la fissazione.

Per calibrare le aspettative di qualità ed esplorare i limiti dell'OCT ex vivo, la Figura 7 confronta l'imaging in vivo, l'imaging ex vivo e l'istologia di tre occhi clinicamente documentati con AMD. Questi tre occhi sono stati conservati in modo diverso da quelli in Figura 2, Figura 3, Figura 4 e Figura 5. Per confermare le sorgenti strutturali di riflettività OCT, che sono subcellulari41, gli occhi nella Figura 7 sono stati conservati in glutaraldeide al 2,5% e glutaraldeide all'1% per consentire l'istologia della resina epossidica ad alta risoluzione e la microscopia elettronica correlata. La glutaraldeide aggiunge opacità a questi campioni rispetto a quelli in Figura 2, Figura 3, Figura 4 e Figura 5. L'effetto di un DtoP più breve rispetto a quello più lungo è evidente (Figura 7A-F, 2,1 h vs. Figura 7G-I, 8,9 h). Nell'occhio con un DtoP più lungo, l'edema postmortem ha cambiato il contorno retinico e l'ILM è stato staccato. La patologia di interesse (tubulazione retinica esterna) era sottile nell'imaging ex vivo. È stato trovato perché l'OCT in vivo tracciato oculare ha individuato la scansione B pertinente e i vasi coroideali potrebbero essere abbinati. Nei due occhi con un DtoP più corto, alcune patologie importanti (neovascolarizzazione maculare di tipo 3) sono state immediatamente evidenti (Figura 7A-C). Altri sono stati trovati con l'assistenza del tracciamento oculare (Figura 7D-F).

Figure 1
Figura 1: Asportazione corneale da un occhio di donatore umano per la fissazione ad immersione della retina. In alto a sinistra, l'occhio donatore asportato è tenuto in posizione da una guaina di garza stabilizzata da un emostato; in alto a destra, una trefina di 18 mm viene utilizzata per creare una partitura circolare che include la cornea e un bordo largo 2 mm di sclera; al centro, il cerchio segnato è completato da un taglio con forbici a punta curva caricate a molla, mentre il globo è stabilizzato; in basso a sinistra, la cornea e il bordo sclerale sono sollevati, esponendo l'iride (blu) e il corpo ciliare (marrone-marrone); in basso al centro, la cornea con il bordo viene sollevata completamente; In basso a destra, l'iride viene tagliata perpendicolarmente al margine pupillare per facilitare la penetrazione del conservante nella camera vitreale. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figure 2
Figura 2: Imaging multimodale ex vivo di una macula insignificante. Una macula di una donatrice di 82 anni con un intervallo di morte e conservazione di 1,97 ore. (A) Il fondo dell'occhio destro visto con il segmento anteriore rimosso (epi-illuminazione). (B) Primo piano della macula (epi-illuminazione). (C) Vista ravvicinata della fovea (epi-illuminazione). Le linee verdi indicano le posizioni delle scansioni B degli OCT nei pannelli D ed E. (D,E) OCT B-scansioni attraverso la perifovea (D) superiore (E) e la fovea. Sono visibili la retina (R), la coroide (C) con grandi vasi iporiflettenti e la banda iperriflettente RPE-BL-BrM intermedia. In questo occhio eccezionalmente ben conservato, sono visibili anche l'IPL e l'OPL moderatamente riflettenti. (D) Un grande vaso nella retina interna proietta un'ombra sugli strati posteriori. (E) La separazione tra retina e RPE nel pannello E (punta di freccia gialla) è artefatale. (F) La riflettanza nel vicino infrarosso mostra il dettaglio delle vascolarizzate retiniche e coroideali. (G) La riflettanza priva di rosso mostra le fibre arcuate (freccia curva verde sinistra) e il fascio papillomaculare (freccia verde) dello strato di fibre nervose. (H) L'autofluorescenza a lunghezza d'onda di 488 nm mostra un'area di segnale complessivamente ridotta nella macula centrale a causa di una parafovea edematosa ispessita, nonché anelli e un punto di segnale basso nel centro foveale e iperautofluorescenza che riveste i grandi vasi retinici, che è suggestiva di guaine del tessuto connettivo. (I) L'autofluorescenza a 787 nm mostra una piccola regione di aumento del segnale nella macula centrale dall'RPE, un segnale nello stroma coroideale e strisce ipoautofluorescenti corrispondenti ai vasi coroideali. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figure 3
Figura 3. Imaging multimodale ex vivo di un occhio donatore con AMD intermedia precoce. Occhio del donatore di una donatrice di 97 anni con un intervallo di morte e conservazione di 3,1 ore. (A) Il fondo dell'occhio destro visto con il segmento anteriore rimosso (epi-illuminazione). (B) Primo piano della macula (epi-illuminazione). Le linee verdi indicano le posizioni delle scansioni B dello Strumento di personalizzazione di Office nei pannelli D, E e F. (C) Vista ravvicinata della fovea che mostra iperpigmentazione (freccia, illuminazione flash). (D) Un SDD nella perifovea superiore (frecce arancioni) è visto su OCT. I Vitelliformi cambiano nell'RPE sotto la fovea (frecce bianche). (F) Inferiore alla fovea è una drusen morbida con una linea iporiflettente alla base (freccia gialla) e un fuoco iperriflettente sopra (freccia azzurra). (G-I) Le immagini dell'oftalmoscopio laser a scansione mostrano pieghe stellate molto sottili nella fovea (viste anche in C). (G) La riflettanza nel vicino infrarosso mostra materiale riflettivo nella fovea corrispondente in parte al materiale vitelliforme. (H) La riflettanza senza rosso mostra la superficie retinica. (I) L'autofluorescenza a lunghezza d'onda di 488 nm mostra un'area di segnale complessivamente ridotta nella macula centrale a causa di una parafovea leggermente ispessita. Gli SDD non sono chiaramente visibili. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figure 4
Figura 4: Imaging multimodale ex vivo di una RPE completa e di un'atrofia retinica nella degenerazione maculare legata all'età. Occhio donatore di una donna di 97 anni con un intervallo di morte e conservazione di 2,33 ore. (A) Fondo dell'occhio sinistro visto con illuminazione trans. (B) Primo piano della macula (epi-illuminazione). Le linee verdi indicano le posizioni delle scansioni B degli OCT nei pannelli D ed E. (C) Primo piano della fovea (epi-illuminazione) che mostra iperpigmentazione centrale (punta di freccia verde) e piccoli punti iperpigmentati (punte di freccia gialle). Il punto centrale è marrone intenso perché la retina sovrastante è molto sottile. I punti appaiono desaturati perché la retina sovrastante è spessa. Sono indicate aree atrofiche circolari (punte di freccia bianche). (D,E) OCT B-scansioni attraverso la (D) perifovea (E) e fovea. La retina (R) e la coroide sottile (C) sono visibili. (D) I fuochi iperriflettenti (punte di freccia gialle) a livello dell'HFL-ONL corrispondono ai punti iperpigmentati in C. La bassa elevazione piatta dell'RPE sotto di loro può rappresentare un deposito laminare basale, una neovascolarizzazione non essudativa di tipo 1 o entrambi. (E) La scansione B attraverso la fovea mostra atrofia riconoscibile dalla subsidenza dell'HFL-ONL (punta di freccia rossa), un'area di ipertrasmissione, un cambiamento vitelliforme con maggiore ombreggiatura nel centro foveale (asterisco verde) e fuochi iperriflettenti (punta di freccia verde acqua) con ombreggiatura. Lo spazio iporiflettente tra la retina e la banda RPE può rappresentare il liquido sottoretinico. (F) La riflettanza del vicino infrarosso mostra macchie iperriflettenti nella fovea. (G) L'immagine senza rosso mostra le fibre arcuate della NFL e le fioriture riflettenti sulla superficie retinica. (H) L'autofluorescenza a 488 nm focalizzata sulla retina mostra un segnale associato ai vasi retinici, nessun segnale associato all'RPE e deboli macchie autofluorescenti nell'area maculare centrale. (I) L'autofluorescenza a 787 nm mostra un segnale corrispondente alla pigmentazione in C. Le aree atrofiche circolari sono evidenti. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figure 5
Figura 5: Imaging multimodale ex vivo della neovascolarizzazione di tipo 1 e dell'atrofia maculare nella degenerazione maculare legata all'età. Un occhio donatore di una donatrice di 86 anni con un intervallo di morte a conservazione di 3,5 ore. (A) Il fondo dell'occhio sinistro visto con il segmento anteriore rimosso (trans-illuminazione). (B) Primo piano della macula che dettaglia i bordi atrofici (punte di freccia gialle). Le linee verdi indicano le posizioni delle scansioni B degli OCT nei pannelli D ed E. (C) Il primo piano della fovea mostra una pigmentazione nera (punte di freccia verdi) all'interno dell'area atrofica. (D,E) OCT B-Scansioni attraverso la (D) perifovea (E) e fovea. La retina I e la coroide sottile (C) sono visibili. In questo occhio eccezionalmente ben conservato, sono visibili anche l'IPL e l'OPL moderatamente riflettenti. (D) La scansione B perifoveale sfiora il bordo superiore dell'area atrofica. L'atrofia è evidenziata dal rilassamento dell'HFL-ONL e dall'aumento dell'ipertrasmissione (punte di freccia rosse). Sono indicati possibili depositi di drusenoidi sottoretinici (punte di freccia fucsia). (E) La B-scan foveale mostra un tumulo di materiale iperriflettente subfoveale e cisti intraretiniche (asterisco). O = testa del nervo ottico. (F) La riflettanza nel vicino infrarosso mostra un'area riflettente di atrofia e vasi coroideali (punte di freccia verde acqua), inclusa una piccola area intensa nella macula centrale (punta di freccia arancione) non visibile dall'imaging a colori. (G) La riflettanza senza rosso mostra vasi retinici e, all'interno di una zona anulare, vasi coroideali. (H) L'autofluorescenza a 488 nm raffigura un bordo atrofico approssimativamente circolare (punte di freccia gialle) e isole di atrofia incipiente. Un'area centrale priva di autofluorescenza è circondata da un anello di autofluorescenza moderata e vasi coroideali visibili (punte di freccia bianche). L'autofluorescenza a 787 nm non è stata possibile in questo occhio. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figure 6
Figura 6: Artefatti comuni osservati nell'imaging OCT ex vivo degli occhi dei donatori. Questi occhi provengono dalla serie di occhi 2016-2017. La maggior parte delle retine sono iper-riflettenti rispetto alle retine riprese in vivo e gli strati retinici interni sono più riflettenti degli strati retinici esterni. Il distacco bacillare (punte di freccia gialle nei pannelli A, D, G e I) è definito come una scissione a livello del mioide del segmento interno del fotorecettore, che crea una cavità intraretinica distintiva40. Il distacco di retina (punte di freccia verdi nei pannelli B, C, D, F, G e I) descrive una separazione dell'intera retina neurosensoriale dalla sottostante RPE42. I distacchi della membrana limitante interna (ILM) separano l'ILM e lo strato di fibre nervose (punte di freccia rosse nei pannelli A, B e I). Un distacco coroideale (punta di freccia blu nel pannello C) è una separazione all'interno della coroide o tra la coroide e la sclera. I danni meccanici (freccia viola nei pannelli F e G) possono apparire a qualsiasi livello e con qualsiasi dimensione, così come il materiale mancante (freccia verde nel pannello G) e il materiale dislocato (freccia gialla nel pannello G). L'edema retinico (stelle viola nei pannelli A e I) appare come un ispessimento del tessuto retinico con confini scarsamente definiti tra gli strati retinici separati. Un RPE ondulato (frecce blu nei pannelli E e J) appare come un livello RPE irregolare e ondulato. Le lesioni cistoidi (quadrato rosso nel pannello H) sono correlate ad alterazioni iporiflettenti simili a camere all'interno del tessuto retinico, comunemente nella fovea. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figure 7
Grafico 7: La visibilità ex vivo della patologia osservata in vivo dipende dalla qualità della conservazione. (Un-Io) Pannelli Un, Be CPannelli D, Ee Fe pannelli G, He Io rappresentano tre occhi clinicamente documentati di due donatori, ciascuno visto mediante eye-tracking in vivo (Un1-Un2,D1-D2,G1-G2) e ex vivo (B1-B2,E1-E2,H1-H2) l'imaging, seguita dall'istologia (C,F,Io). Le linee verdi sulla riflettanza del vicino infrarosso (NIR, Un1,B1,D1,E1,G1,H1) rappresentano i livelli di tomografia a coerenza ottica (OCT) B-scans e istologia panoramica. Pannelli Un, Be C e pannelli D, Ee F, presentano rispettivamente l'occhio destro e sinistro di una donatrice di 90 anni. Pannelli G, He Io Mostra l'occhio destro di una seconda donatrice, anche lei di 90 anni. (Un-C) Il tessuto oculare ben conservato (DtoP: 2,1 h) consente una buona visibilità della patologia principale. (Un) Una neovascolarizzazione maculare intraretinica iperriflessiva (tipo 3 MNV, punta di freccia verde) è circondata da liquido intraretinico 17 mesi prima della morte (Un2). Il complesso di membrana di RPE/Bruch è diviso da materiale iporiflettente e appare come un segno "a doppio strato" (Un2). A sinistra c'è un altro segno a doppio strato con ipertrasmissione del codice a barre nella coroide (punta di freccia arancione). Su ex vivo OCT (B2), l'MNV di tipo 3 e l'ipertrasmissione dei codici a barre sono chiaramente visibili e delineati. La retina è artificiosamente staccata, come mostrato dalla punta della freccia bianca. L'istologia panoramica mostra una lesione di tipo 3 MNV orientata verticalmente (punta di freccia verde, C1). Vedi ricerche precedenti43,44 per i dettagli del caso originale. (D-F) Un tessuto oculare ben conservato (DtoP: 2,1 ore) può portare a una trasparenza ridotta ma comunque sufficiente per rilevare patologie importanti. Il PTOM (D2) mostra una pila di focolai iperriflettenti intraretinici (HRF, punta di freccia fucsia) in un occhio seguito per essudativo tipo 3 MNV. Nessuna cisti intraretinica è visibile a 11 mesi prima della morte. Su ex vivo OCT (E2), la pila di HRF è compressa verticalmente (punta di freccia fucsia) ma chiaramente delineata. Sull'istologia panoramica (F1), una torre dell'epitelio pigmentato retinico (punta di freccia fucsia) si innalza verso l'alto da una morbida dusa. (G-Io) Un tessuto oculare meno ben conservato (DtoP: 8,9 ore) si traduce in una ridotta visibilità della patologia maggiore. L'OCT indica una tubulazione retinica esterna (ORT, punta di freccia gialla) a 48 mesi prima della morte (G2). Sul ex vivo OCT, l'ORT appare come un sottile disturbo, e questo sarebbe stato difficile da discernere senza una conoscenza preliminare (H2). La membrana limitante interna è artificiosamente staccata (punta di freccia bianca). L'edema ha distorto il contorno retinico. L'analisi istologica mostra il lume ORT delimitato dalla membrana limitante esterna e dai fotorecettori che sporgono in essa (Io1). Vedi ricerche precedenti26,45 per i dettagli del caso originale. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Numeri Percentuali
Categoria diagnostica Occhi Giusti Occhi sinistri Totale Occhi Giusti Occhi sinistri Totale
Irrilevante 39 34 73 41.50% 37.80% 39.70%
AMD discutibile 10 11 21 10.60% 12.20% 11.40%
I primi AMD 20 22 42 21.30% 24.40% 22.80%
AMD atrofica 6 8 14 6.40% 8.90% 7.60%
AMD neovascolare 11 7 18 11.70% 7.80% 9.80%
Altro 7 8 15 7.40% 8.90% 8.20%
Sconosciuto 0 0 0 0.00% 0.00% 0.00%
Non registrato 1 0 1 1.10% 0.00% 0.50%
Totale 94 90 184 100.00% 100.00% 100.00%
Alcuni AMD 37 37 75 39.40% 41.10% 40.20%
Possibile AMD 47 48 95 50.00% 53.30% 51.60%
Gli occhi sono stati accesi durante il periodo 17/06/16 - 14/09/17. Criteri: ≥ 80 anni, bianco, non diabetico, ≤6 ore di morte-conservazione. Target: 184 occhi (180 occhi di 90 donatori, conservati; 4 occhi di 4 donatori, conservati) Tempo di morte per conservazione (media, massimo, minimo): 3,9 h, 6,4 h, 2,0 h

Tabella 1: recupero dell'occhio del donatore dal 2016-2017.

Materiale supplementare 1: Panoramica della dissezione, fotografia del fondo oculare a colori e imaging multimodale basato su OCT. Clicca qui per scaricare questo file.

Materiale supplementare 2: Dettagli dell'imaging multimodale basato su PTOM per illustrare le fasi nelle sezioni 5-8. Clicca qui per scaricare questo file.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Utilizzando un approccio di screening basato sulla popolazione durante un periodo di 16 mesi nell'era pre-COVID, è stato possibile procurarsi 75 occhi di donatori con AMD. Tutti sono stati recuperati con un breve DtoP e messi in scena utilizzando MMI ancorato OCT. Il criterio di età (>80 anni) è al di fuori della fascia di età tipica per i recuperi di tessuto destinati a cornee trapiantabili. Nonostante l'età avanzata, i nostri criteri hanno portato gli occhi in tutte le fasi di AMD. Molti fenotipi RPE sono comuni a tutti gli stadi di AMD e alcuni sono esclusivi dell'AMD 3,46 neovascolare. Il confronto diretto tra imaging ex vivo e in vivo (Figura 7) ha confermato che il DtoP breve è un fattore critico, insieme alla manipolazione esperta (Figura 1), nella produzione di immagini ex vivo della retina esterna sufficienti per la classificazione diagnostica di alto livello, e alcuni di questi campioni erano adatti per correlazioni dirette tra imaging e istologia4,35, 47. Non tutte le patologie sono visibili ex vivo. Tuttavia, molto di più è visibile quando si utilizza l'OCT rispetto ai metodi basati sulla fotografia a colori10, in particolare quelli che coinvolgono la separazione della retina dall'RPE / coroide27. Inoltre, il tracciamento oculare dall'OCT clinico dirige l'attenzione su caratteristiche focali e talvolta piccole (Figura 7).

Questo sistema di conservazione prevede procedure e strumenti tipici della banca degli occhi per la rimozione della cornea, seguita dall'immersione di un occhio aperto in un conservante fornito in anticipo. In questo modo, il personale della banca degli occhi può recuperare continuamente i tessuti di ricerca (24 ore su 24, 7 giorni su 7). Quest'ultima caratteristica è critica, poiché i tessuti destinati a dissezioni complesse immediate27,32 richiedono personale ventiquattr'ore su ventiquattro da parte degli investigatori, della banca degli occhi o di entrambi. Altri stabilizzatori che consentirebbero il recupero dei tessuti a qualsiasi ora seguito da dissezione specializzata ed estrazioni durante l'orario di lavoro, come il PAXgene Tissue System e Hibernate-A, potrebbero essere utili in futuro se questi sono compatibili con l'imaging OCT.

Questo approccio produce retine che rimangono in gran parte attaccate all'RPE e sono, quindi, in grado di generare dati traducibili nell'imaging OCT. La localizzazione precisa è essenziale perché la macula è piccola (<3% dell'area retinica). Inoltre, la progressione AMD guidata dal deposito si allinea con la topografia di coni e bastoncelli48, e l'esordio precoce e i difetti visivi più persistenti si verificano in un luogo specifico (cioè la parafovea contenente bastoncelli accanto alla fovea a tutto cono)49. Per il confronto con l'OCT, l'immunoistochimica con coloranti colorimetrici è compatibile con la microscopia completa (ad esempio, campo luminoso) per tenere conto di tutti gli elementi tissutali, sia marcati che non etichettati4. Saggi molecolari non mirati basati su array di campionamento possono sfruttare l'allineamento orizzontale dei fotorecettori compartimentati verticalmente e dell'RPE per aumentare efficacemente la risoluzione. La spettrometria di massa per immagini con impulsi laser ionizzanti di 8 μm di diametro e 10-15 μm di distanza può localizzare dozzine di lipidi nei compartimenti subcellulari delle cellule retiniche esterne50. La trascrittomica a risoluzione spaziale utilizza una serie prestabilita di primer di trascrizione inversa con codice a barre su vetrini, a cui vengono applicate sezioni di tessuto51. Questa tecnologia è attualmente limitata alla cattura di 55 μm di diametro e alla spaziatura di 100 μm; sono previsti miglioramenti nella risoluzione che renderebbero questa tecnologia adatta alla ricerca AMD.

Questo protocollo ha delle limitazioni. Il criterio di recupero omette le diagnosi di diabete (30% tra i destinatari di Medicare in Alabama)52 a causa dell'importanza della coroide in entrambe le malattie. Questa esclusione riduce il pool complessivo di donatori e allunga il tempo necessario per raccogliere abbastanza occhi per uno studio. Per ragioni storiche, i criteri 2016-2017 hanno omesso i donatori neri, che ora rappresentano il 14% dei donatori di occhi a livello statale, e i donatori neri sono ora inclusi negli attuali progetti futuri. Il registro delle direttive anticipate per le persone che desiderano essere donatori di occhi è ampio, ma non include ancora una comoda registrazione presso gli studi locali specializzati in retina che si prendono cura dei pazienti affetti da AMD; Questo progetto è attualmente in fase di sviluppo. Durante uno screening basato sulla popolazione come questo, appariranno occhi con condizioni che si sovrappongono nel fenotipo con AMD e devono essere riconosciuti in consultazione con la letteratura clinica in evoluzione e un oftalmologo specializzato in malattie della retina. Ad esempio, questa serie di occhi includeva nevi con drusen53 e una linea di disturbo RPE su un vaso pachicolico (un vaso spesso nella coroide interna)54. Infine, AMD precoce e intermedia sono stati combinati a causa della mancanza di un sistema di classificazione basato su OCT per AMD, che è in fase di sviluppo dal gruppo55 della classificazione dell'atrofia. Tuttavia, l'ottimizzazione del recupero tissutale e della caratterizzazione basata sull'OCT consente alla ricerca AMD di concentrarsi sullo sfruttamento dell'elemento temporale dell'MMI ancorato all'OCT tracciato dall'occhio da pianificare, alimentare, programmare e preventivare nelle applicazioni di finanziamento.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

C.A.C. riceve supporto alla ricerca da Heidelberg Engineering e fornisce consulenza per Apellis, Astellas, Boehringer Ingelheim, Character Bioscience e Osanni. T.A. riceve supporto per la ricerca da Novartis e fornisce consulenza per Roche, Novartis, Bayer, Nidek e Apellis. K.B.F. è consulente di Genentech, Zeiss, Heidelberg Engineering, Allergan, Bayer e Novartis.

Acknowledgments

Ringraziamo Heidelberg Engineering per la strumentazione e il design del titolare oculare originale, Richard F. Spaide MD per l'introduzione all'imaging multimodale basato su OCT, Christopher Girkin MD per aver facilitato l'accesso ai dispositivi di imaging clinico e David Fisher per la Figura 1. Il recupero degli occhi dei donatori umani per la ricerca è stato sostenuto dalle sovvenzioni del National Institutes of Health (NIH) R01EY06019 (C.A.C.), P30 EY003039 (Pittler), R01EY015520 (Smith) R01EY027948 (C.A.C., T.A.) R01EY030192 (Li), R01EY031209 (Stambolian) e U54EY032442 (Spraggins), IZKF Würzburg (N-304, T.A.), EyeSight Foundation of Alabama, International Retinal Research Foundation (C.A.C.), Arnold and Mabel Beckman Initiative for Macular Research (C.A.C.) e Research to Prevent Blindness AMD Catalyst (Schey).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Beakers, 250 mL Fisher # 02-540K
Bottles, 1 L, Pyrex  Fisher # 10-462-719 storage for preservative
Bunsen burner or heat source Eisco # 17-12-818 To melt wax
Camera, digital Nikon D7200 D7200
Computer and storage Apple iMac Pro; 14 TB external hard drive Image storage
Container, insulated Fisher # 02-591-45 For wet ice
Containers, 2 per donor, 40 mL Fisher Sameco Bio-Tite  40 mL # 13-711-86 For preservative
Crucible, quartz 30 mL Fisher # 08-072D Hold globe for photography
Cylinder, graduate, 250 mL Fisher # 08-549G
Disinfectant cleaning supplies   https://www.cardinalhealth.com/en/product-solutions/medical/infection-control/antiseptics.html
Eye holder with lens and mounting bracket contact J. Messinger jeffreymessinger@uabmc.edu custom modification of Heidelberg Engineering original design
Face Protection Masks Fisher # 19-910-667
Forceps, Harmon Fix Roboz  # RS-8247
Forceps, Micro Adson Roboz  # RS-5232
Forceps, Tissue Roboz # RS-5172
Glass petri dish, Kimax Fisher # 23064
Gloves Diamond Grip Fisher # MF-300
Gowns GenPro Fisher # 19-166-116
Image editing software Adobe Photoshop 2021, Creative Suite
KimWipes Fisher # 06-666
Lamps, 3 goosenecks Schott Imaging # A20800
Microscope, stereo Nikon SMZ 1000 for dissection
Microscope, stereo Olympus  SZX9 color fundus photography
Paraformaldehyde, 20%  EMS # 15713-S for preservative; dilute for storage
pH meter Fisher  # 01-913-806
Phosphate buffer, Sorenson’s, 0.2 M pH 7.2  EMS # 11600-10
Ring flash B & H Photo Video Sigma EM-140 DG 
Ruby bead, 1 mm diameter Meller Optics # MRB10MD
Safety Glasses 3M Fisher # 19-070-940
Scanning laser ophthalmoscope Heidelberg Engineering HRA2
Scissors, curved spring Roboz # RS-5681
Sharps container Fisher # 1482763
Shutter cord, remote Nikon MC-DC2
Spectral Domain OCT device Heidelberg Engineering Spectralis HRA&OCT https://www.heidelbergengineering.com/media/e-learning/Totara-US/files/pdf-tutorials/2238-003_Spectralis-Training-Guide.pdf
Stainless steel ball bearing, 25.4 mm diameter McMaster-Carr # 9529K31
Tissue marking dye, black Cancer Diagnostics Inc # 0727-1
Tissue slicer blades Thomas Scientific # 6767C18
Trephine, 18-mm diameter Stratis Healthcare # 6718L
TV monitor (HDMI) and cord for digital camera B&H Photo Video BH # COHD18G6PROB for live viewing and remote camera display features
Wax, pink dental EMS  # 72670
Wooden applicators Puritan # 807-12

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Spaide, R. F., et al. Consensus nomenclature for reporting neovascular age-related macular degeneration data: Consensus on neovascular age-related macular degeneration nomenclature study group. Ophthalmology. 127 (5), 616-636 (2020).
  2. Spaide, R. F., Ooto, S., Curcio, C. A. Subretinal drusenoid deposits a.k.a. pseudodrusen. Survey of Ophthalmology. 63 (6), 782-815 (2018).
  3. Curcio, C. A., Zanzottera, E. C., Ach, T., Balaratnasingam, C., Freund, K. B. Activated retinal pigment epithelium, an optical coherence tomography biomarker for progression in age-related macular degeneration. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 58 (6), 211-226 (2017).
  4. Cao, D., et al. Hyperreflective foci, OCT progression indicators in age-related macular degeneration, include transdifferentiated retinal pigment epithelium. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 62 (10), 34 (2021).
  5. Zanzottera, E. C., et al. Visualizing retinal pigment epithelium phenotypes in the transition to geographic atrophy in age-related macular degeneration. Retina. 36, S12-S25 (2016).
  6. Edwards, M. M., et al. Subretinal glial membranes in eyes with geographic atrophy. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 58 (3), 1352-1367 (2017).
  7. Zhang, Z., Shen, M. M., Fu, Y. Combination of AIBP, apoA-I, and aflibercept overcomes anti-VEGF resistance in neovascular AMD by inhibiting arteriolar choroidal neovascularization. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 63 (12), 2 (2022).
  8. Jiang, M., et al. Microtubule motors transport phagosomes in the RPE, and lack of KLC1 leads to AMD-like pathogenesis. Journal of Cell Biology. 210 (4), 595-611 (2015).
  9. Collin, G. B., et al. Disruption of murine Adamtsl4 results in zonular fiber detachment from the lens and in retinal pigment epithelium dedifferentiation. Human Molecular Genetics. 24 (24), 6958-6974 (2015).
  10. Curcio, C. A., Medeiros, N. E., Millican, C. L. The Alabama Age-related Macular Degeneration Grading System for donor eyes. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 39 (7), 1085-1096 (1998).
  11. Bastek, J. V., Siegel, E. B., Straatsma, B. R., Foos, R. Y. Chorioretinal juncture. Pigmentary patterns of the peripheral fundus. Ophthalmology. 89 (12), 1455-1463 (1982).
  12. Lewis, H., Straatsma, B. R., Foos, R. Y., Lightfoot, D. O. Reticular degeneration of the pigment epithelium. Ophthalmology. 92 (11), 1485-1495 (1985).
  13. Lewis, H., Straatsma, B. R., Foos, R. Y. Chorioretinal juncture. Multiple extramacular drusen. Ophthalmology. 93 (8), 1098-1112 (1986).
  14. Sarks, J. P., Sarks, S. H., Killingsworth, M. C. Evolution of geographic atrophy of the retinal pigment epithelium. Eye. 2 (5), 552-577 (1988).
  15. Sarks, J. P., Sarks, S. H., Killingsworth, M. C. Evolution of soft drusen in age-related macular degeneration. Eye. 8 (3), 269-283 (1994).
  16. Ghazi, N. G., Dibernardo, C., Ying, H. S., Mori, K., Gehlbach, P. L. Optical coherence tomography of enucleated human eye specimens with histological correlation: Origin of the outer "red line". American Journal of Ophthalmology. 141 (4), 719-726 (2006).
  17. Brown, N. H., et al. Developing SDOCT to assess donor human eyes prior to tissue sectioning for research. Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 247 (8), 1069-1080 (2009).
  18. Helb, H. M., et al. Clinical evaluation of simultaneous confocal scanning laser ophthalmoscopy imaging combined with high-resolution, spectral-domain optical coherence tomography. Acta Ophthalmologica. 88 (8), 842-849 (2010).
  19. Spaide, R. F., Curcio, C. A. Drusen characterization with multimodal imaging. Retina. 30 (9), 1441-1454 (2010).
  20. Naghavi, M., et al. From vulnerable plaque to vulnerable patient: a call for new definitions and risk assessment strategies: Part 1. Circulation. 108 (14), 1664-1672 (2003).
  21. Garcia-Garcia, H. M., Gonzalo, N., Regar, E., Serruys, P. W. Virtual histology and optical coherence tomography: from research to a broad clinical application. Heart. 95 (16), 1362-1374 (2009).
  22. Strouthidis, N. G., et al. Comparison of clinical and spectral domain optical coherence tomography optic disc margin anatomy. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 50 (10), 4709-4718 (2009).
  23. Sarks, S. H. Ageing and degeneration in the macular region: A clinico-pathological study. British Journal of Ophthalmology. 60 (5), 324-341 (1976).
  24. Sura, A. A., et al. Measuring the contributions of basal laminar deposit and Bruch's membrane in age-related macular degeneration. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 61 (13), 19 (2020).
  25. Chen, L., Messinger, J. D., Kar, D., Duncan, J. L., Curcio, C. A. Biometrics, impact, and significance of basal linear deposit and subretinal drusenoid deposit in age-related macular degeneration. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 62 (1), 33 (2021).
  26. Litts, K. M., et al. Clinicopathological correlation of outer retinal tubulation in age-related macular degeneration. JAMA Ophthalmology. 133 (5), 609-612 (2015).
  27. Olsen, T. W., Feng, X. The Minnesota grading system of eye bank eyes for age-related macular degeneration. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 45 (12), 4484-4490 (2004).
  28. Mano, F., Sprehe, N., Olsen, T. W. Association of drusen phenotype in age-related macular degeneration from human eye-bank eyes to disease stage and cause of death. Ophthalmology Retina. 5 (8), 743-749 (2021).
  29. Age-related eye disease study research group. The Age-Related Eye Disease Study system for classifying age-related macular degeneration from stereoscopic color fundus photographs: The Age-Related Eye Disease Study Report Number 6. American Journal of Ophthalmology. 132 (5), 668-681 (2001).
  30. Arnold, J. J., Sarks, S. H., Killingsworth, M. C., Sarks, J. P. Reticular pseudodrusen. A risk factor in age-related maculopathy. Retina. 15 (3), 183-191 (1995).
  31. Olsen, T. W., Bottini, A. R., Mendoza, P., Grossniklausk, H. E. The age-related macular degeneration complex: linking epidemiology and histopathology using the Minnesota grading system (the inaugural Frederick C. Blodi Lecture). Transactions of the American Ophthalmological Society. 113, (2015).
  32. Owen, L. A., et al. The Utah protocol for postmortem eye phenotyping and molecular biochemical analysis. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 60 (4), 1204-1212 (2019).
  33. Wang, J. J., et al. Ten-year incidence and progression of age-related maculopathy: The Blue Mountains Eye Study. Ophthalmology. 114 (1), 92-98 (2007).
  34. Joachim, N., Mitchell, P., Burlutsky, G., Kifley, A., Wang, J. J. The incidence and progression of age-related macular degeneration over 15 years: The Blue Mountains Eye Study. Ophthalmology. 122 (12), 2482-2489 (2015).
  35. Pang, C., Messinger, J. D., Zanzottera, E. C., Freund, K. B., Curcio, C. A. The onion sign in neovascular age-related macular degeneration represents cholesterol crystals. Ophthalmology. 122 (11), 2316-2326 (2015).
  36. Keilhauer, C. N., Delori, F. C. Near-infrared autofluorescence imaging of the fundus: Visualization of ocular melanin. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 47 (8), 3556-3564 (2006).
  37. Curcio, C. A., Saunders, P. L., Younger, P. W., Malek, G. Peripapillary chorioretinal atrophy: Bruch's membrane changes and photoreceptor loss. Ophthalmology. 107 (2), 334-343 (2000).
  38. Curcio, C. A. Imaging maculopathy in the post-mortem human retina. Vision Research. 45 (28), 3496-3503 (2005).
  39. Brinkmann, M., et al. Histology and clinical lifecycle of acquired vitelliform lesion, a pathway to advanced age-related macular degeneration. American Journal of Ophthalmology. 240, 99-114 (2022).
  40. Ramtohul, P., et al. Bacillary layer detachment: Multimodal imaging and histologic evidence of a novel optical coherence tomography terminology. Literature review and proposed theory. Retina. 41 (11), 2193-2207 (2021).
  41. Wilson, J. D., Foster, T. H. Mie theory interpretations of light scattering from intact cells. Optics Letters. 30 (18), 2442-2444 (2005).
  42. Ghazi, N. G., Green, W. R. Pathology and pathogenesis of retinal detachment. Eye. 16 (4), 411-421 (2002).
  43. Berlin, A., et al. Correlation of optical coherence tomography angiography of type 3 macular neovascularization with corresponding histology. JAMA Ophthalmology. 140 (6), 628-633 (2022).
  44. Berlin, A., et al. Histology of type 3 macular neovascularization and microvascular anomalies in anti-VEGF treated age-related macular degeneration. Ophthalmology Science. 3 (3), 100280 (2023).
  45. Schaal, K. B., et al. Outer retinal tubulation in advanced age-related macular degeneration: optical coherence tomographic findings correspond to histology. Retina. 35 (7), 1339-1350 (2015).
  46. Chen, L., et al. Histology and clinical imaging lifecycle of black pigment in fibrosis secondary to neovascular age-related macular degeneration. Experimental Eye Research. 214, 108882 (2022).
  47. Balaratnasingam, C., et al. Histologic and optical coherence tomographic correlations in drusenoid pigment epithelium detachment in age-related macular degeneration. Ophthalmology. 124 (1), 644-656 (2017).
  48. Curcio, C. A., et al. Subretinal drusenoid deposits in non-neovascular age-related macular degeneration: Morphology, prevalence, topography, and biogenesis model. Retina. 33 (2), 265-276 (2013).
  49. Owsley, C., et al. Biologically guided optimization of test target location for rod-mediated dark adaptation in age-related macular degeneration: ALSTAR2 baseline. Ophthalmology Science. 3 (2), 100274 (2023).
  50. Anderson, D. M. G., et al. The molecular landscape of the human retina and supporting tissues by high resolution imaging mass spectrometry. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 31 (12), 2426-2436 (2020).
  51. Lee, J., Yoo, M., Choi, J. Recent advances in spatially resolved transcriptomics: challenges and opportunities. BMB Reports. 55 (3), 113-124 (2022).
  52. Diabetes. Alabama Public Health. , Available from: https://www.alabamapublichealth.gov/healthrankings/diabetes.html (2022).
  53. Francis, J. H., et al. Swept-source optical coherence tomography features of choroidal nevi. American Journal of Ophthalmology. 159 (1), 169-176 (2015).
  54. Inoue, M., Dansingani, K. K., Freund, K. B. Progression of age-related macular degeneration overlying a large choroidal vessel. Retina Cases Brief Reports. 10 (1), 22-25 (2016).
  55. Jaffe, G. J., et al. Imaging features associated with progression to geographic atrophy in age-related macular degeneration: CAM Report 5. Ophthalmology Retina. 5 (9), 855-867 (2021).

Tags

Neuroscienze Numero 195 Banca degli occhi biobanking tomografia a coerenza ottica imaging multimodale degenerazione maculare legata all'età
<em>Ex Vivo</em> Imaging multimodale basato su OCT di occhi di donatori umani per la ricerca sulla degenerazione maculare legata all'età
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Messinger, J. D., Brinkmann, M.,… More

Messinger, J. D., Brinkmann, M., Kimble, J. A., Berlin, A., Freund, K. B., Grossman, G. H., Ach, T., Curcio, C. A. Ex Vivo OCT-Based Multimodal Imaging of Human Donor Eyes for Research into Age-Related Macular Degeneration. J. Vis. Exp. (195), e65240, doi:10.3791/65240 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter