Summary
Laboratorieanalyser kan utnyttja prognostiskt värde från longitudinell optisk koherenstomografi (OCT) -baserad multimodal avbildning av åldersrelaterad makuladegeneration (AMD). Mänskliga donatorögon med och utan AMD avbildas med OCT, färg, nära infraröd reflektansskanning av laseroftalmoskopi och autofluorescens vid två excitationsvåglängder före vävnadssnittning.
Abstract
En progressionssekvens för åldersrelaterad makuladegeneration (AMD) inlärd från optisk koherenstomografi (OCT) -baserad multimodal (MMI) klinisk avbildning kan ge prognostiskt värde till laboratoriefynd. I detta arbete applicerades ex vivo OCT och MMI på mänskliga donatorögon före snittning av näthinnans vävnad. Ögonen återfanns från icke-diabetiska vita donatorer i åldern ≥80 år, med en döds-till-konserveringstid (DtoP) på ≤6 timmar. Globerna återfanns på plats, skårades med en 18 mm trefin för att underlätta borttagning av hornhinnan och nedsänktes i buffrad 4% paraformaldehyd. Färgfundusbilder förvärvades efter borttagning av främre segment med ett dissekeringsomfång och en SLR-kamera med trans-, epi- och blixtbelysning vid tre förstoringar. Globerna placerades i en buffert i en specialdesignad kammare med en 60 dioptrilins. De avbildades med spektraldomän OCT (30 ° makula kub, 30 μm avstånd, medelvärde = 25), nära infraröd reflektans, 488 nm autofluorescens och 787 nm autofluorescens. AMD-ögonen visade en förändring i retinalt pigmentepitel (RPE), med drusen eller subretinal drusenoidavlagringar (SDD), med eller utan neovaskularisering och utan tecken på andra orsaker. Mellan juni 2016 och september 2017 återfanns 94 högra ögon och 90 vänstra ögon (DtoP: 3,9 ± 1,0 timmar). Av de 184 ögonen hade 40,2% AMD, inklusive tidig mellanliggande (22,8%), atrofisk (7,6%) och neovaskulär (9,8%) AMD och 39,7% hade obemärkta makulas. Drusen, SDD, hyperreflekterande foci, atrofi och fibrovaskulära ärr identifierades med hjälp av OCT. Artefakter inkluderade vävnadsopacifiering, avlossningar (bacillär, retinal, RPE, koroidal), foveal cystisk förändring, en böljande RPE och mekanisk skada. För att vägleda kryosnittningen användes OCT-volymer för att hitta fovea och optiska nervhuvudmärken och specifika patologier. Ex vivo-volymerna registrerades med in vivo-volymerna genom att välja referensfunktionen för eyetracking. Patologins synlighet ex vivo som ses in vivo beror på bevarandekvaliteten. Inom 16 månader återfanns 75 snabba DtoP-donatorögon i alla stadier av AMD och iscensattes med kliniska MMI-metoder.
Introduction
Femton års hantering av neovaskulär åldersrelaterad makuladegeneration (AMD) med anti-VEGF-terapi under ledning av optisk koherenstomografi (OCT) har gett nya insikter i progressionssekvensen och mikroarkitekturen för denna vanliga orsak till synförlust. Ett viktigt erkännande är att AMD är en tredimensionell sjukdom som involverar den neurosensoriska näthinnan, retinalt pigmentepitel (RPE) och koroid. Som ett resultat av OCT-avbildning av försökspatienter och andra ögon hos behandlade klinikpatienter erkänns nu patologins egenskaper utöver de som ses av färgfundusfotografering, en klinisk standard i årtionden. Dessa inkluderar intraretinal neovaskularisering (typ 3 makulär neovaskularisering1, tidigare angiomatös proliferation), subretinala drusenoidavlagringar (SDD, även kallad retikulär pseudodrusen)2, flera vägar för RPE-öde3,4 och intensivt gliotiska Müller-celler i atrofi 5,6.
Modellsystem som saknar makulor (celler och djur) återskapar några skivor av denna komplexa sjukdom 7,8,9. Ytterligare framgång med att förbättra AMD: s börda kan komma från upptäckten och utforskningen av primär patologi i mänskliga ögon, förstå den unika cellulära sammansättningen av makula, följt av översättning till modellsystem. Denna rapport skildrar ett tre decennium av samarbete mellan ett akademiskt forskningslaboratorium och en ögonbank. Målen med de vävnadskarakteriseringsmetoder som beskrivs här är tvåfaldiga: 1) att informera utvecklande diagnostisk teknik genom att demonstrera grunden för fundusutseende och bildsignalkällor med mikroskopi, och 2) att klassificera AMD-prover för riktade (immunohistokemi) och oriktade molekylära upptäcktstekniker (avbildande masspektrometri, IMS och rumslig transkriptomik) som bevarar kon-bara fovea och stavrika para- och perifovea. Sådana studier kan påskynda översättningen till klinisk OCT, för vilken en progressionssekvens och longitudinell uppföljning är möjlig genom ögonspårning. Denna teknik, som är utformad för att övervaka behandlingseffekter, registrerar skanningar från ett klinikbesök till nästa med hjälp av retinala kärl. Att koppla ögonspårad OCT till laboratorieresultat erhållna med destruktiva tekniker kan ge en ny nivå av prognostiskt värde för molekylära fynd.
År 1993 fångade forskningslaboratoriet färgfotografier av postmortem fundus på film10. Denna ansträngning inspirerades av den fantastiska fotomikroskopin och histologin hos den mänskliga perifera näthinnan av Foos och kollegor 11,12,13 och de omfattande AMD-klinopitopatologiska korrelationerna av Sarks et al.14,15. Från och med 2009 antogs ex vivo multimodal imaging (MMI) förankrad på spektraldomän OCT. Denna övergång inspirerades av liknande ansträngningar från andra 16,17 och särskilt av insikten att så mycket av den ultrastruktur som beskrivs av Sarks var tillgänglig i tre dimensioner, över tiden, i kliniken 18,19. Målet var att förvärva ögon med bifogade makulor inom en rimlig tidsram för väldrivna studier av fenotyper på cellulär nivå i näthinnan, RPE och choroid. Avsikten var att gå bortom "per öga" -statistik till "per lesionstyp", en standard som påverkas av "sårbara plack" -koncepten från hjärt-kärlsjukdom20,21.
Protokollet i denna rapport återspeglar erfarenheter med nästan 400 par donatorögon anslutna i flera strömmar. Under 2011-2014 skapades Project MACULA-webbplatsen för AMD-histopatologi, som innehåller skikttjocklekar och anteckningar från 142 arkiverade exemplar. Dessa ögon bevarades från 1996-2012 i ett glutaraldehyd-paraformaldehydfixeringsmedel för högupplöst epoxihartshistologi och elektronmikroskopi. Alla fundi hade fotograferats i färg när de mottogs och reimagedes av OCT strax före histologi. En ögonhållare som ursprungligen utformades för optiska nervstudier22 användes för att rymma en 8 mm diameter fulltjocklek vävnadstans centrerad på fovea. OCT B-skanningar genom fovealcentret och en plats 2 mm överlägsen, motsvarande histologi på samma nivåer, laddades upp på webbplatsen, plus ett färgfundusfotografi. Valet av OCT-planen dikterades av AMD-patologins framträdande under fovea23 och framträdandet av SDD i stavrika områden överlägsna fovea24,25.
Från och med 2013 var ögon avbildade med OCT-förankrad MMI under livet tillgängliga för direkta kliniskopatologiska korrelationer. De flesta (7 av 10 donatorer) involverade patienter vid en retina-remisspraxis (författare: K.B.F.), som erbjöd ett avancerat direktivregister för patienter som var intresserade av att donera sina ögon efter döden för forskningsändamål. Ögonen återfanns och bevarades av den lokala ögonbanken, överfördes till laboratoriet och förbereddes på samma sätt som Project MACULA-ögonen. Pre-mortem kliniska OCT-volymer lästes sömlöst i laboratoriet, vilket anpassade de patologiska egenskaperna som ses under livet med de funktioner som ses under mikroskopet26.
Från och med 2014 började prospektiv ögoninsamling genom screening för AMD i donatorögon utan klinisk historia men bevarad under en definierad tidsgräns (6 timmar). För detta ändamål modifierades ögonhållaren för att rymma en hel jordklot. Detta minskade risken för lossning runt de skurna kanterna på den tidigare använda 8 mm stansen. Ögonen bevarades i 4% buffrad paraformaldehyd för immunhistokemi och överfördes till 1% nästa dag för långtidsförvaring. Under 2016-2017 (före pandemin) återhämtades 184 ögon från 90 givare. Statistiken och bilderna i denna rapport genereras från denna serie. Under pandemitiden (2020 lockdowns och efterdyningar) fortsatte prospektiva samlingar för transkriptomik och IMS-samarbeten i minskad takt, i huvudsak med 2014-metoderna.
Andra metoder för bedömning av donatorögon finns tillgängliga. Minnesota Grading System (MGS)27,28 är baserat på AREDS kliniska system för färgfundusfotografering 29. Begränsningarna av denna metod innefattar kombinationen av atrofisk och neovaskulär AMD i ett stadium av "sen AMD". Vidare innebär MGS avlägsnande av den neurosensoriska näthinnan före fotodokumentationen av RPE-koroid. Detta steg avlägsnar SDD i varierande grad30,31 och tar bort den yttre näthinnans rumsliga korrespondens och dess stödsystem. Således kan ansträngningar att koppla metabolisk efterfrågan och signalering från näthinnan till patologi i RPE-choroid hindras. Utah-systemet implementerade MMI med ex vivo-färgfotografering och OCT för att kategorisera ögon avsedda för dissektion i regioner för RNA- och proteinextraktioner32. Även om det är att föredra framför extraktioner av hela ögonmusslor, representerar området med 3 mm diameter med högsta risk för AMD-progression33,34 endast 25% av en 6 mm diameter fovea-centrerad stans. Således är tekniker som kan lokalisera fynd med hänvisning till fovea, såsom seriesnittning för immunhistokemi, fördelaktiga.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Den institutionella granskningsnämnden vid University of Alabama i Birmingham godkände laboratoriestudierna, som följde god laboratoriesed och biosäkerhetsnivå 2/2+. Alla amerikanska ögonbanker följer 2006 Uniform Anatomical Gifts Act och US Food and Drug Administration. De flesta amerikanska ögonbanker, inklusive Advancing Sight Network, överensstämmer med de medicinska standarderna från Eye Bank Association of America.
Materialförteckningen listar förnödenheter och utrustning. Kompletterande material 1 ger en översikt över dissektionen, färgfundusfotografering och OCT-baserad MMI. Kompletterande material 2 innehåller information om det OCT-baserade MMI.
1. Kriterier för vävnadsinsamling
- För att maximera utbytet av AMD-ögon i en skärm av papperslösa givare, ställ in följande kriterier för acceptabla givare: ålder ≥80 år, vit, icke-diabetiker och ≤6 h död till bevarande (DtoP).
OBS: DtoP definieras som tiden mellan döden och när ögat placeras i ett konserveringsmedel, antingen på sjukhuset eller i laboratoriet.
2. Konserveringsmedium och annan beredning (laboratorium)
- Gör 4% fosfatbuffrad paraformaldehyd från 20% lager (köpt). Bered 1 liter genom att tillsätta 200 ml 20% paraformaldehyd (utspädningsfaktor 5) till 800 ml 0,1 M Sorensons fosfatbuffert. Testa och justera vid behov för att säkerställa att pH-värdet är 7,2. Förvaras vid 4 °C.
- Fördela 30 ml 4% fosfatbuffrad paraformaldehyd i 40 ml burkar.
- Lager märkt 40 ml behållare med konserveringsmedel vid ögonbanken så att vävnaden kan återvinnas när som helst och vilken dag som helst.
- För lagring av bevarade ögon, gör 1% paraformaldehyd från 4% lösningen. Bered 1 liter genom att tillsätta 250 ml 4% paraformaldehyd (utspädningsfaktor 4) till 750 ml 0,1 M Sorensons fosfatbuffert. Testa och justera pH-värdet vid behov. Förvaras vid 4 °C.
- Bered 1 liter av en 0,1 M lösning från 0,2 M lösningen av Sorensons fosfatbuffert, pH 7,2, genom att kombinera 500 ml destillerat vatten och 500 ml Sorensons buffert.
- Justera pH droppe för droppe med 1 N saltsyra eller 1 N natriumhydroxid. Förvaras vid 4 °C.
- Skapa en hållare för att stabilisera ögonen under dissektion. Fyll en petriskål med tandvax uppvärmd tills den är flytande. När det är lite coolt, gör ett halvklotformigt intryck i det med ett stort kullager och frys sedan skålen för att underlätta avlägsnandet av kullagret.
3. Metoder för ögonbank
- För att säkerställa snabb återhämtning av forskningsvävnader, återvinn alla vävnader snabbt, inklusive de som är avsedda för transplantation.
- Ta emot dödshänvisningar, enligt lag, inom 1 h efter dödsfallet och spåra varje givare med ett remisssekvensnummer som följer vävnaden.
- För att hitta fall med potentiell klinisk dokumentation, ställ AMD- och ögonsjukdomsspecifika frågor i forskningsintervjun för riskbedömning av donatorer.
- För att minimera restiden, återställ hela glober (till skillnad från endast hornhinnor för transplantation) inom ett kompakt område (dvs. stad och angränsande förortslän).
- Ta med två burkar konserveringsmedel (buffrad 4% paraformaldehyd) till decedentens sjukhusrum för vävnadsåtervinning (i motsats till att vänta på att kroppen ska flyttas till ett bårhus).
- Före och under återhämtning, kommunicera med utredarna för att bekräfta leverans och tidpunkt.
- Återställ globerna på plats på sjukhuset, öppna dem med konsekventa hanteringsmetoder och sänk ner det öppnade ögat i konserveringsmedel (figur 1).
- Håll det utskurna givarögat på plats med hjälp av en mantel av gasväv stabiliserad av en hemostat.
- För att underlätta avlägsnandet av hornhinnan med en 2 mm bred kant av sclera, använd en 18 mm diameter trefin för att göra jordklotet.
- För att frigöra hornhinnan med en medföljande kant av sclera, skär längs den skårade cirkeln med fjäderbelastad sax med böjda spetsar medan du stabiliserar jordklotet med den hemostatklippta gasväven.
- Lyft hornhinnan från sclera, exponera iris och ciliary kropp.
- För att underlätta penetreringen av konserveringsmedlet i glaskroppen, gör en 2 mm lång slits i iris vinkelrätt mot pupillmarginalen. Placera ögonen i provburkar med 30 ml konserveringsmedel vid 4 °C och överför till laboratoriet på våt is.
- Överför avidentifierad donatorinformation elektroniskt från ögonbanken till forskningslaboratoriets databas.
OBS: Databasen behåller remissnumret, ögonbankens vävnadsnummer och laboratoriets ID-nummer för spårning, plus annan relevant information.
4. Vävnadsberedning för ex vivo color fundusfotografering
- Använd två stereomikroskop, ett för dissektion och ett för färgfundusfotografering.
OBS: För transillumination för att visualisera pigmentförändringar, använd en bas för mörkfältsmikroskopi. - Ta bort de främre segmentresterna (iris och lins). För att stabilisera ögat under dissektion, placera det i petriskålen fylld med vax (kompletterande material 1, bilder 7-8). För att förhindra att ciliärkroppen och den bifogade näthinnan kollapsar i glaskroppen, minimera störningen av ringen av tjockt glaskropp som är fäst vid ciliärkroppen (glaskroppsbasen).
- Markera den överlägsna polen för orientering. Lägg jordklotet med den främre sidan nedåt i skålen. Hitta insättningssenorna i överlägsen rectus och överlägsen sned muskler. Använd en träapplikator och applicera sparsamt en markeringsfärg i en 10 mm linje i en främre till bakre riktning (dvs. vinkelrätt mot den tendinösa insättningen av den övre rektusmuskeln).
- Innan fotografering fyller du fundus med kall Sorensens fosfatbuffert.
- Sätt in en 1 mm rubinsträng i ögonbotten som en intern skalstång som ska visas i varje bild27.
- Ta färgbilder med en reflexkamera med en lins monterad på ett stereomikroskop utrustat med en ringblixt. Använd trans-, epi- och blixtbelysning vid var och en av tre standardförstoringar för att ta bilder avsedda att markera specifika områden (kompletterande material 1, bild 11): 1) fundus till ekvatorn, 2) den bakre polen (vaskulära arkader, optiskt nervhuvud, fovea) och 3) fovea inom macula lutea (gul fläck).
5. Förberedelse för ex vivo color fundusfotografering
- Slå på kameran och bildskärmen. Anslut fjärrslutaren och släpp ställdonet i HDMI-kamerans/TV:ns (HD) kamera-/TV-skärm och bildskärmskabel.
- Ställ in kamerainställningarna på manuell ISO-funktion och spegellåsningsläge (låst på plats för att minska vibrationer).
Se tillverkarens användarhandbok för inställningarna på den kamera som används. Lär dig av kameran, visa inställningarna för över-/underexponering i förhållande till histogrammet och exponeringsavläsningarna. - Ordna två ljuskällor, var och en med två flexibla ljusledare placerade vinkelrätt mot varandra, för belysning i de fyra kardinalriktningarna på mikroskopsteget (kompletterande material 1, sidan 10).
- Slå på epi-belysningsljuskällorna till full effekt.
OBS: Det är bra men inte nödvändigt att ha ett svart filthölje runt scenen för att begränsa ljus / blixtspridning för fotografen. - Vid dissekeringsmikroskopet, använd pincett för att sätta in den bakre polen i en 30 ml kvartsdegel fylld med buffert. Låt vävnaden sjunka till botten. Sätt in en stag, t.ex. en vävnadssvamp, mellan ögat och degeln för att förhindra rörelse. Sätt in 1 mm rubinsträngen i den bakre stolpen.
OBS: Pärlan kan falla i synnervskoppen. - Placera försiktigt jordklotet i degeln på stereomikroskopscenen och observera den inre okulära fundusen genom mikroskopokularet. Använd den lägsta förstoringen, orientera ögat genom att identifiera vävnadsmärket vid klockan 12, det optiska nervhuvudet (ONH) och fovea 5 ° under ONH. Rotera ögat så att fovea faller under en linje genom ONH med 5 °.
OBS: Om det är ett höger öga är ONH till höger om fovea, sett genom mikroskopets okular. Om det är ett vänster öga är ONH till vänster om fovea. - Slå på fjärrmonitorn från kameran. Se till att skjutreglaget för mikroskopstråldelare är inställt på att observera genom fotoporten och inte genom porten för kikaren. Beroende på ljus- och spegelvägen, var beredd att rotera vävnaden 180 ° på scenen för korrekt orientering.
6. Bildförvärv med ex vivo färgfundusfotografering
- Med epibelysningen påslagen, ställ in förstoringen så att hela 18 mm trefinsnittet upptar hela synfältet. Öka förstoringen så att det är möjligt att fokusera på botten av fovealgropen. Minska förstoringen till föregående inställning.
- Justera ISO-inställningarna i intervallet 1 600-3 000 så att exponeringstiderna faller inom mätarens mittområde på kameran.
- Tryck på fjärravtryckaren. Lyssna efter spegeln för att låsa i uppfällt läge. Tryck på avtryckaren igen för exponering.
- Observera bilden på monitorn, med de förinställda metadata som visar rött, grönt, blått (RGB) och ett färghistogram för korrekt exponering. Om exponeringen är acceptabel, fortsätt; Om inte, ta bort, omvärdera parametrarna och avbilda igen.
- Stäng av svanhalslamporna för epibelysning för att markera drusen och slå på blixten med en exponering på 1/4 s, en slutartid på 1/250 s och en ISO på 100-320. Ställ in blixthastigheten till standard eller ändra den under den första installationen av kameran. Skaffa en bild och kontrollera histogrammet för korrekt exponering.
- Stäng av blixten och slå på ljuskällan för transbelysning. Återställ ISO till över 5 000 och se till att exponeringstiden inte går under 1/30 s på grund av potentiell vibration i det fotografiska systemet. Skaffa en bild och kontrollera histogrammet för korrekt exponering.
- Öka förstoringen för att visa både ONH och fovea i synfältet. Slå på epibelysningslamporna. Ställ in ISO-intervallet på 1 600–3 000. Se till att exponeringstiderna ligger inom kamerans mittområde.
- Stäng av epibelysningslamporna och slå på blixten med en exponering på 1/4 s, kamerans förinställda slutartid inställd på 1/250 s och ISO inställd på 400-800. Skaffa en bild och kontrollera histogrammet för korrekt exponering.
- Stäng av blixten och slå på transbelysningen med hjälp av mörkfältsbasen. Återställ ISO till över 5 000. Se till att exponeringstiden inte är långsammare än 1/30 s på grund av potentiell vibration i det fotografiska systemet. Skaffa en bild och kontrollera om det finns ett korrekt histogram.
- Stäng av transilluminationen och slå på epibelysningslamporna igen.
- Öka förstoringen till den som användes i steg 6.7. Fokusera om vid behov.
- Öka ISO inom intervallet 3 000-6 000 och justera exponeringstiden så att den hamnar inom rätt exponeringsområde för kameran. Hämta en bild.
OBS: Rubinsträngen kanske inte längre visas i synfältet. Om så är fallet, ta separata bilder av pärlan vid denna förstoring som referens. - Stäng av epibelysningslamporna. Slå på blixten med en exponering på 1/4 s och med kamerans slutartid till 1/250 s. Ställ in blixthastigheten till standard, eller ändra den under den första installationen av kameran och ställ in ISO till 500-1 000. Hämta bilden. Kontrollera histogrammet för korrekt exponering.
- Stäng av blixten och slå på transbelysningslamporna. Återställ ISO till över 8 000 för att möjliggöra en snabbare exponeringstid med en känsligare bildsensor. Se till att exponeringstiden inte går under 1/30 s på grund av potentiell vibration i det fotografiska systemet. Hämta en bild.
- Exportera bilderna från kameran till en dator. Granska bilderna innan du tar bort provet från mikroskopsteget om några behöver fångas igen.
7. Bildförvärvsöversikt för ex vivo OCT och skanningslaseroftalmoskopi (SLO)
- För spektraldomän OCT, placera globerna i fosfatbuffert i en anpassad ögonhållare med en kammare med en 60 dioptrilins35. Montera ögonhållaren på ett fäste på en klinisk OCT-bildbehandlingsenhet och fäst den där en patient skulle vila pannan. OCT-enheten infogar automatiskt en skalstapel i varje bild.
- Samtidigt, med samma enhet och med ögat fortfarande i hållaren, avbilda globerna med ett skanningslaseroftalmoskop (SLO) med hjälp av nära infraröd reflektans (NIR, som används som lokaliseringsbild av den kvarliggande programvaran), 488 nm excitation fundus autofluorescens (FAF) och rödfri (RF) reflektans.
OBS: 787 nm excitation FAF i denna enhet är endast ibland lämplig eftersom en stråldelare minskar ljustransmittansen till SLO. Av denna anledning används en andra enhet för 787 nm FAF-bilder (se nästa punkt). - Separat, men med ögat fortfarande i ögonhållaren, avbilda globerna med 787 nm FAF för att detektera RPE-störning36 med en separat enhet som visar denna modalitet väl.
8. Bildinsamlingsprotokoll för ex vivo OCT / SLO (se bilder i kompletterande material 2)
- Ange den överlägsna rektusmuskeln med vävnadsmarkeringsfärgämne. Slå på lasern (blå pil, Kompletterande material 2, sida 1).
- Se sidan 2 i Kompletterande material 2, placera OCT-huvudet genom att flytta hela enheten i två axlar i förhållande till basen (grön pil) och sedan höja höjden (y) genom att vrida joysticken medurs/moturs (cw/ccw, blå pilar). Fokusera bilden genom att vrida på ratten (orange pil), med den svarta spaken i läge R (*). Lås enheten genom att fästa tumskruven (lila pil).
- För in ögat i hållaren och stabilisera från den bakre delen med distanser (Kompletterande material 1, sidan 13). Utöva så lite tryck som möjligt för att undvika att buckla sclera. Orientera med vävnadsmärket för den överlägsna rektusmuskeln uppåt.
OBS: Det ungefärliga avståndet från ögonhållarens framsida till OCT-enheten är 25 mm. - Öppna den proprietära visualiserings- och analysprogramvaran för OCT-enheten. En patientlista visas i den vänstra kolumnen. De ögondonatorer som indexeras med ett internt kodnummer är "patienterna". Se användarhandboken från tillverkaren.
- Välj ikonen Ny patient . Fyll i patientdatainformationen efter behov. Välj OK. Använd ett logiskt ordnat numreringssystem för enskilda ögon, till exempel YYYYNNNL,R_agesex. Detta kan till exempel vara 2017016R_97F.
- När du har fortsatt datainmatningen i följande fönster trycker du på OK. Välj operatör och studie från rullgardinsmenyn.
OBS: Den angivna informationen kommer att visas i exporterbara metadata. - När du har tittat på en tom skärm trycker du på den gula knappen för att starta bildförvärvet.
- Tryck på IR + OCT (nära infraröd reflektans + OCT). Låt lasern få en levande SLO-bild av fundus och OCT B-scan.
- Slutför rätt anatomisk position baserat på ONH och fovea och använd en träapplikator för att justera ögonpositionen i hållaren. På kontrollpanelen roterar du den svarta runda knappen för att justera intensiteten.
- Tryck på samma knapp för att i genomsnitt 9-100 bilder (röda pilar; 9 räcker, 100 ser krämiga ut). Om enheten är korrekt orienterad ska fundus vara i fokus och OCT B-skanningen ska visas i den övre tredjedelen av displayen (Kompletterande material 2, sidan 9, dubbel röd pil).
- På fundusbilden använder du markören för att flytta den blå linjen för att centrera fovea (Kompletterande material 2, sidan 9, vit pil). Tryck på Förvärva.
Andra standardknappar är Retina, EDI (av) och Line Scan.
- Tryck på RF + OCT för nästa förvärv. Kontrollera positionen igen för att säkerställa att bilden inte har rört sig eller försämrats. Tryck på den svarta knappen för medelvärde. Tryck på Förvärva.
- Byt den interna kuben för autofluorescensavbildning till 488 nm och 787 nm excitationsvåglängder (kompletterande material 2, sidan 10).
Kubens position efter omkopplaren visas. - Välj Autofluorescensläge . Kontrollera justeringen igen. Tryck på Förvärva.
- För misstänkta fall av RPE-störningar och atrofi, välj ICGA (indocyaningrön angiografi) för 787 nm autofluorescens. Kontrollera ögonpositionen igen och tryck sedan på Anskaffa.
OBS: En fundusbild visas ofta inte i denna modalitet eftersom den inre kuben dämpar strålen. - Växla tillbaka den interna kuben till R för IR och röd fri bildbehandling för volymförvärv.
OBS: Kubens position efter omkopplaren visas på sidan 13 i Kompletterande material 2. - För att hämta OCT-volymerna, välj IR och volyminställningen. Matcha alla inställningar på sidan 14 i Kompletterande material 2 genom att växla lämpliga knappar på kontrollmodulen (30° makulakub, 30 μm avstånd, medelvärde beroende på experimentkraven).
- Observera att den nära infraröda reflektansfundusvyn är täckt av blå B-scan-linjer. Kontrollera OCT-positionen igen i den övre tredjedelen av det högra fönstret. Tryck på Hämta på kontrollmodulen och vänta 5 minuter tills volymsökningen är klar. När bildtagningen är klar väljer du EXIT. Bilderna sparas (röd pil).
OBS: De blå linjerna avgränsar avstånden som visas i föregående vy i mikrometer. Skanningarna börjar numrera från botten (sämre) och fortsätter uppåt. Notera den röda linjens progression. - Låt datorn bearbeta de förvärvade bilderna, som kommer att visas på skärmen (kompletterande material 2, sidan 16).
- När du avbildar en donators andra ögon, ändra inte monteringsfästets position mellan ögonen. Om vänster öga avbildas först visas resultaten i kolumnen OD (höger öga). Högerklicka för att markera alla avbildningar och välj sedan Exchange OS/OD. Bilderna flyttas till OS-kolumnen.
- Tryck på Välj > fönster > databas. Skärmen är som standard panel 6 med tillägg av donatorögat avbildat i den högra kolumnen (Kompletterande material 2, sidan 18). Högerklicka på patienten i rullgardinsmenyn, välj Batch och exportera E2E-filen.
- Bläddra till den förutbestämda mappen som skapats på skrivbordet för filöverföringar. Välj OK. Mappen innehåller E2E-filerna som ska kopieras till en extern hårddisk och arkiveras.
- För ögat i hållaren till skanningslaseroftalmoskopet, som huvudsakligen används för 787 nm autofluorescens.
Se tillverkarens användarhandbok för insamling och arkivering av bilderna. - Slå på datorn och lasern.
- Välj ikonen Ny patient . Fyll i patientuppgifterna efter behov.
- Om du vill att ögondatabladet ska vara detsamma trycker du på OK. Eftersom C-kurvan förblir densamma trycker du på Fortsätt.
- Välj Studieläge och ange lösenordet om det behövs. Håll C-kurvan på 7,7 mm. Tryck på Ok.
- Välj Fortsätt för att verifiera C-kurvan. Välj den gula indikatorn för att starta kameran.
- Välj R-position . Rikta in och orientera världen. Välj IR-läge för att fokusera och orientera enligt ovan.
- Rikta kamerahuvudet genom att flytta hela enheten i två axlar i förhållande till basen (Kompletterande material 2, sidan 28, grön pil) och sedan höja enhetens höjd (y) (blå pilar). Fokusera bilden genom att vrida på ratten (orange pil). Den svarta spaken är i läge R (*). När detta huvud är på plats, lås ner enheten genom att vrida tumskruven (lila pil).
- Observera att skärmen visas som visas på sidan 29 i Kompletterande material 2.
- Flytta väljarratten från R till A. Välj ICGA (för att uppnå 787 nm autofluorescens) i blått, 100 % intensitet, 30° synfält och enfasavbildning.
OBS: Liksom färgämnet indocyaningrönt exciteras melanin av 787 nm våglängdsljus. - Observera att skärmen visas som visas på sidan 31 i Kompletterande material 2. Tryck på den svarta skivan för medelvärde och välj sedan Anskaffa.
- Välj Fönster > databas. Välj Importera E2E-filer från SLO-enheten; Dessa filer lagras på en extern hårddisk och laddas upp till skrivbordet.
- Välj Öppna. Kontrollera att markeringarna är standard och välj OK.
- Observera att patienten nu har två flikar: en som visar bilderna som förvärvats från SLO (blå pil) och den andra fliken som visar bilderna som förvärvats från OCT-enheten (röd pil) (Kompletterande material 2, sidan 34).
- Högerklicka på bilden på 786 nm (ICGA) och exportera bilden till en fil märkt SLO 786 på skrivbordet.
- Om du vill spara 786 nm autofluorescens-SLO-bilden markerar du patienten och högerklickar för att exportera bilder som RAW-filer (för .vol-filer) till en mapp på skrivbordet.
- För att exportera bilder från OCT-enheten för överföring till arkivdatorn, kopiera / klistra in från RAWEXPORT till en mapp märkt RAW.
9. Granskning av bildbehandling
- Montera bilderna (färg, .vol-fil, SLO-bilder) i mappar för varje donator med undermappar för varje öga och indexera mapparna i följd efter laboratorie-ID.
- Registrera vävnadsavtryck (kvalitet, patologi) i en databas för en standardiserad rapport.
- Granska de exporterade OCT-volymerna med ett internt ImageJ-plugin.
- Hitta fovea-centret, som kan kännas igen av mitten av fovealdoppet, den inre ökningen av de yttre näthinnebanden eller den tunnaste punkten. I de flesta fall kommer dessa att sammanfalla, men inte alltid, eftersom detta beror på foveal bevarande, individuell variation och förekomsten av patologi.
- Hitta en standardskanning i den överlägsna perifovea (2 mm/67 B-skanningar bort i överlägsen riktning, dvs. ökande skanningsnummer).
- Spara en .tif stapel av hela volymen för snabb referens i framtiden.
- Bläddra igenom OCT-volymen i sin helhet, från och med skanning 1 (sämre), medan du registrerar skanningsnumren där funktioner känns igen.
- Kontrollera peripapillärområdet utöver makula.
OBS: Peripapillär korioretinalatrofi i äldre ögon inkluderar en distinkt basal laminär avsättning och neovaskularisering. Detta är ett vanligt område med pigmentförändringar i myopiska ögon och glaukom, liksom i åldrande och AMD37.
- Inspektera färgfotografierna och länka eventuella fynd till de som ses av OCT om möjligt.
OBS: I allmänhet är det lättare att se de flesta fynd av OCT först. Färgfotografier ger en stor bild av området utanför området på SLO, koroidal pigmentering inklusive nevi, närvaron av heme och hårda exsudat och svart pigment i neovaskulär AMD. Mörkt pigment i fovea kan representera lösa melanosomer från det främre segmentet och bör tvättas bort försiktigt med buffert med pipett. - Inspektera SLO-bilderna och länka eventuella fynd till de som ses av OCT om möjligt.
- Spara vanliga B-skanningar vid fovea och perifovea, extra B-skanningar med anmärkningsvärd patologi eller andra funktioner och SLO-bilder i en patologirapport.
- Kategorisera ögonen enligt följande: Anmärkningsvärt, tvivelaktigt, tidigt intermediärt AMD, atrofisk AMD, neovaskulär AMD, Övrigt, Okänt, Ej graderbart, Ej registrerat. "Tvivelaktigt" används om det inte är klart om ändringarna är tillräckligt allvarliga för en annan kategorisering. "Inte graderbar" är reserverad för ögon som saknar användbara OCT-skanningar, till exempel de med allvarligt lossnade näthinnor. "Ej inspelad" är reserverad för ögon som behandlas omedelbart efter mottagandet utan fotografering.
- Använd dessa kriterier för AMD: allvarlig RPE-förändring med antingen drusen eller subretinala drusenoidavlagringar, med eller utan tecken på neovaskularisering, såsom vätska eller fibros, och utan tecken på andra orsaker (uppdaterad från Curcio et al.10 för att tillgodose SDD).
OBS: Den slutliga diagnosen bekräftas genom histologisk analys.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Tabell 1 visar att under 2016-2017 återfanns 184 ögon från 94 vita icke-diabetiska donatorer >80 år. Den genomsnittliga tiden för död till konservering var 3,9 timmar (intervall: 2,0-6,4 timmar). Av de 184 granskade ögonen hade 75 (40,2%) viss AMD. Följande kategorier identifierades: Unremarkable (39,7%), tvivelaktig (11,4%), tidig intermediär AMD (22,8%), atrofisk (7,6%), neovaskulär (9,8%), annan (8,7%) och okänd / inte registrerad / inte graderbar (<1%). Figur 2, figur 3, figur 4 och figur 5 visar multiskalig, multimodal ex vivo-avbildning av exceptionellt välbevarade ögon från denna serie. Ögonen granskades i samarbete med en ögonläkare specialiserad på näthinnesjukdom (J.A.K.). Medan vissa ögon visade enskilda funktioner bättre än andra, valdes dessa fodral för allround hög kvalitet.
Som beskrivits38 skiljer sig ex vivo-färgfotografering från motsvarande in vivo-fotografering. Retinalt ödem och / eller avlossning kan minska synligheten av de bakre pigmenterade vävnaderna. Observationer i friska ögon indikerar att dessa förändringar sker efter döden och inte förvärras markant med snabb fixering. Dessutom tömmer koroidala kärl efter döden. På grund av en böljande bakgrund av bleka kärl och mörk interstitiell vävnad bör bedömningen av pigmentvariationer i RPE-planet stödjas av andra modaliteter än färg. I ex vivo OCT finns mer information tillgänglig än vid färgfotografering. Ex vivo OCT skiljer sig också avsevärt från in vivo OCT. De största skillnaderna inkluderar den övergripande ökade reflektiviteten hos vävnad, särskilt i den inre näthinnan, den konsekventa reflektiviteten hos vissa band (nervfiberskikt, inre och yttre plexiformskikt, RPE), den lägre synligheten av choroiddetaljerna, särskilt under den edematösa näthinnan, och synligheten av vävnadsskiktavskiljningar (se nedan). De yttre retinala hyperreflekterande banden, som involverar fotoreceptorer och RPE (ellipsoidzon, EZ; interdigitationszon, IZ), är inkonsekvent synliga ex vivo och används inte som landmärken i detta sammanhang. Den kliniska konsensusen för spektraldomän OCT använder termen RPE-Bruchs membranband (BrM). Termen RPE-basal lamina (BL)-BrM-band föredras dock eftersom den rymmer utseendet på basala laminära avlagringar i AMD24.
Figur 2 visar en obemärkt makula och hyporeflekterande stora koroidala kärl, med ett reflekterande RPE-BL-BrM-band mellan de två. Ett stort kärl i den inre näthinnan kastar en skugga på de bakre skikten. IPL och OPL är måttligt reflekterande. I NIR-SLO är både retinala och koroidala vaskulaturer synliga. SLO för rödfri reflektans fungerar bäst för funktioner i den inre näthinnan och vitreoretinala gränssnitt som de bågformiga fibrerna och NFL: s papillomakulära bunt. I normala ögon visar 488 nm autofluorescens SLO ett område med övergripande reducerad signal i centrala makula på grund av förtjockad parafovea och i vissa fall absorption av det gula xantofyllpigmentet, liksom hyperautofluorescens som fodrar de stora retinala kärlen, vilket tyder på bindvävsmantlar. Autofluorescensen vid 787 nm visar ett litet område med ökad signal i centrala makula från RPE, en signal i koroidalt stroma och hypoautofluorescerande ränder som motsvarar koroidala kärl.
Figur 3 visar en makula med tidig mellanliggande AMD. De synliga egenskaperna inkluderar en mjuk drusen (kupolformad RPE-höjd nära fovea), SDD (intermittent reflektivitet med ett dentatutseende internt i RPE-BL-BrM-bandet), hyperreflekterande foci (HRF, reflekterande material med samma reflektivitet som RPE i lagret, beläget i näthinnan) och vitelliform förändring (en inåtgående expansion av RPE-organellerna, både intracellulära och extracellulära, i samband med basala laminära avlagringar39). Färgfotograferingen visar stark pigmentering motsvarande vitelliformskadan, omgiven av minskad pigmentering. Varken drusen eller SDD är tydligt synliga med färg. NIR-reflektansen visar reflektiviteten i fovea. Autofluorescensen vid 488 nm excitation visar en fläckig signal i fovea. SDD visas ibland på SLO-modaliteter; detta är mer troligt om SDD är rikliga, och SDD ses lättast som ett regelbundet åtskilt punkteringsmönster (se Spaide och Curcio19, figur 6). Mönstret överlägset och tidsmässigt fovea i figur 3I är inte SDD, eftersom det är oregelbundet och lokaliserat till ett ytligt fokalplan. Alla ansiktsmodaliteter visar fina veck som strålar ut från fovea. I mindre välbevarade ögon kan liknande veck vara tillräckligt stora för att vara synliga vid de lägsta betraktningsförstoringarna.
Figur 4 visar en makula med atrofisk AMD. Färgfundusfotograferingen visar cirkulära atrofiska områden, central hyperpigmentering och små hyperpigmenterade prickar i parafovea som i OCT motsvarar HRF på nivån av Henle fiberlager-yttre kärnskikt (HFL-ONL). Dessutom, i OCT, kan en låg platt RPE-höjning representera en basal laminär avlagring, icke-exsudativ typ 1 neovaskularisering eller båda. Atrofi i foveal B-skanning känns igen av sänkningen av HFL-ONL, ett område med hypertransmission (ljus som skiner igenom till choroid), en vitelliform förändring med ökad skuggning i fovealcentret och HRF som kastar skuggor. I detta öga visar NIR-reflektansen hyperreflekterande fläckar i fovea. Autofluorescensen vid 787 nm excitation visar effektivt en signal som motsvarar foveal hyperpigmentering och frånvaron av en signal i de cirkulära atrofiska områdena. Den röda fria och 488 nm autofluorescensen visar de inre retinala egenskaperna.
Figur 5 visar en gula fläck med makuladetrofi sekundär till neovaskulär AMD. Färgfundusfotograferingen visar svart pigmentering inom det atrofiska området. OCT visar atrofi genom slapp (sänkning) av HFL-ONL och ökad hypertransmission. Den foveala B-skanningen visar en hög av subfovealt hyperreflekterande material och intraretinala cyster. Den nära infraröda reflektansen visar reflektivitet i det atrofiska området på grund av förlusten av RPE och koroidala kärl. Ett litet, intensivt reflekterande område i fovea syns inte på färg. Den rödfria reflektansen visar retinala kärl och, inom en ringformig zon, koroidala kärl. Autofluorescensen (488 nm) visar tydligt en ungefär cirkulär atrofisk kant och öar av begynnande atrofi. Ett centralt område utan signal är omgivet av en ringform av måttlig signal och synliga koroidala kärl.
Figur 6 visar vanliga artefakter vid ex vivo OCT-avbildning. Ödem kan vara framträdande i den inre näthinnan, vilket skapar utbuktningar och veck genom fovea (figur 6A, I). Mekanisk skada kan uppstå med dragkraft på glaskroppen eller genom direkt kontakt av näthinnan med dissekeringsverktygen, vilket resulterar i förskjutning av material och ibland förlust av det materialet (figur 6F, G). Lossningar kan ske längs flera vävnadsplan och kan representera relativa dragkrafter mellan skikten som också förekommer in vivo. Varje lossning kan vidgas ytterligare vid efterföljande bearbetning. Den vanligaste avlossningen är retinal (dvs mellan fotoreceptorns yttre segment och de apikala processerna i RPE) (figur 6B-D, F-I). De apikala processerna kan antingen lossna från de yttre segmenten eller förbli hos RPE-cellkropparna, som bestäms av histologi. Näthinneavlossningar kan vara stora och böljande (figur 6 B,D,I) eller smala och knappt urskiljbara (figur 6C,F,G). Bacillärt skiktavskiljning (BALAD40) sågs först i laboratoriet och hittades senare i klinisk OCT. BALAD tillskrivs en delning genom myoiddelen av fotoreceptorns inre segment, vilket lämnar ellipsoiddelen av det inre segmentet och det yttre segmentet fäst vid RPE (figur 6A, D, I). BALAD ska inte förväxlas med SDD ex vivo OCT. Ett tredje frigöringsplan är det inre begränsande membranet (ILM), och det finns ofta kvarvarande reflekterande vätska mellan ILM och de återstående näthinneskikten (figur 6A, B, I). Den minst vanliga lossningen är mellan choroid och sclera (figur 6C). Fovea uppvisar ofta cystoida utrymmen som inte bör betraktas som patologiska utan stödjande bevis, såsom tecken på neovaskularisering (figur 6H). I enstaka B-skanningar kan vågrörelser av RPE ge intrycket av drusen. 3D-vyn av en OCT-volym klargör att dessa färdas längs de koroidala kärlen (figur 6E,J). Vågrörelser kan bero på differentiella volymförändringar mellan kärlen och mellanliggande stroma efter döden och under fixering.
För att kalibrera förväntningarna på kvalitet och utforska begränsningarna för ex vivo OCT jämför figur 7 in vivo-avbildning, ex vivo-avbildning och histologi hos tre kliniskt dokumenterade ögon med AMD. Dessa tre ögon bevarades annorlunda än de i figur 2, figur 3, figur 4 och figur 5. För att bekräfta de strukturella OCT-reflektivitetskällorna, som är subcellulära41, bevarades ögonen i figur 7 i 2,5% glutaraldehyd och 1% glutaraldehyd för att möjliggöra högupplöst epoxihartshistologi och korrelativ elektronmikroskopi. Glutaraldehyd ger opacitet till dessa prover i förhållande till dem i figur 2, figur 3, figur 4 och figur 5. Effekten av en kortare kontra längre DtoP är uppenbar (figur 7A-F, 2,1 h jämfört med figur 7G-I, 8,9 h). I ögat med en längre DtoP förändrade postmortemödem näthinnans kontur och ILM lossnade. Patologin av intresse (yttre retinal tubulation) var subtil vid ex vivo-avbildning. Det hittades eftersom den ögonspårade in vivo OCT identifierade den relevanta B-skanningen, och de koroidala kärlen kunde matchas. I de två ögonen med en kortare DtoP var några större patologier (typ 3 makulär neovaskularisering) omedelbart uppenbara (figur 7A-C). Andra hittades med hjälp av ögonspårning (figur 7D-F).
Figur 1: Korneal excision från ett mänskligt donatoröga för nedsänkningsfixering av näthinnan. Överst till vänster hålls det utskurna givarögat på plats av en mantel av gasväv stabiliserad av en hemostat; uppe till höger används en 18 mm trefin för att göra en cirkulär poäng inklusive hornhinnan och en 2 mm bred kant av sclera; mitten, den skårade cirkeln avslutas med ett snitt med fjäderbelastad böjd sax, medan jordklotet stabiliseras; längst ner till vänster lyfts hornhinnan och skleralfälgen och exponerar iris (blå) och ciliärkroppen (solbrun); nedre mitten, hornhinnan med fälgen lyfts helt av; Längst ner till höger klipps irisen vinkelrätt mot pupillmarginalen för att underlätta penetreringen av konserveringsmedlet i glaskroppen. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Multimodal ex vivo-avbildning av en oansenlig makula. En gula fläcken från en 82-årig kvinnlig donator med ett intervall mellan död och konservering på 1,97 timmar. (A) Ögonbotten i höger öga sedd med det främre segmentet avlägsnat (epibelysning). (B) Närbild av gula fläcken (epi-belysning). (C) Närbild av fovea (epi-belysning). De gröna linjerna anger placeringen av OCT B-skanningarna i panelerna D och E. (D,E) OCT B-skanningar genom (D) överlägsen perifovea (E) och fovea. Näthinnan (R), åderhinnan (C) med hyporeflekterande stora kärl och det mellanliggande hyperreflekterande RPE-BL-BrM-bandet är synliga. I detta exceptionellt välbevarade öga är även den måttligt reflekterande IPL och OPL synliga. (D) Ett stort kärl i den inre näthinnan kastar en skugga på de bakre skikten. (E) Separationen mellan näthinnan och RPE i panel E (gul pilspets) är artefaktisk. (F) Den nära infraröda reflektansen visar detaljerna i både retinala och koroidala vaskulaturer. (G) Den rödfria reflektansen visar nervfiberskiktets bågformiga fibrer (vänster grön böjd pil) och papillomakularbunten (grön pil). (H) Autofluorescensen på 488 nm våglängd visar ett område med totalt reducerad signal i centrala makula på grund av en förtjockad edematös parafovea, liksom ringar och en punkt med låg signal i fovealcentret och hyperautofluorescens som kantar de stora näthinnekärlen, vilket tyder på bindvävsmantlar. (I) Autofluorescensen vid 787 nm visar ett litet område med ökad signal i centrala gula fläcken från RPE, en signal i koroidalt stroma och hypoautofluorescerande ränder motsvarande koroidala kärl. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3. Multimodal ex vivo-avbildning av ett donatoröga med tidig intermediär AMD. Donatoröga från en 97-årig kvinnlig donator med ett intervall på 3,1 timmar för död. (A) Ögonbotten på höger öga sedd med det främre segmentet borttaget (epibelysning). (B) Närbild av gula fläcken (epi-belysning). De gröna linjerna anger platserna för OCT B-skanningarna i panelerna D, E och F. (C) Närbild av fovea som visar hyperpigmentering (pil, blixtbelysning). (D) En SDD i överlägsen perifovea (orange pilar) ses på OCT. I Vitelliform förändring i RPE under fovea (vita pilar). (F) Sämre än fovea är en mjuk drusen med en hyporeflekterande linje vid basen (gul pil) och ett hyperreflekterande fokus ovanför (ljusblå pil). (G–I) Skanningslaserns oftalmoskopbilder visar mycket fina stellatveck i fovea (ses också i C). (G) Den nära infraröda reflektansen visar reflektivitetsmaterial i fovea som delvis motsvarar vitelliformt material. (H) Den rödfria reflektansen visar näthinnans yta. (I) Autofluorescensen med 488 nm våglängd visar ett område med totalt reducerad signal i centrala makula på grund av en något förtjockad parafovea. SDD är inte tydligt synliga. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Multimodal ex vivo-avbildning av en fullständig RPE och retinalatrofi vid åldersrelaterad makuladegeneration. Donatoröga från en 97-årig kvinna med ett döds-till-bevarande intervall på 2,33 h. (A) Fundus på vänster öga sett med transbelysning. (B) Närbild av gula fläcken (epi-belysning). De gröna linjerna anger placeringen av OCT B-skanningarna i panelerna D och E. (C) Närbild av fovea (epibelysning) som visar central hyperpigmentering (grön pilspets) och små hyperpigmenterade prickar (gula pilspetsar). Den centrala pricken är intensivt brun eftersom den överliggande näthinnan är mycket tunn. Prickarna verkar avmättade eftersom den överliggande näthinnan är tjock. Cirkulära atrofiska områden indikeras (vita pilspetsar). (D,E) OCT B-skanningar genom (D) perifovea (E) och fovea. Näthinnan (R) och tunn choroid (C) är synliga. (D) Hyperreflekterande foci (gula pilspetsar) på nivån för HFL-ONL motsvarar de hyperpigmenterade punkterna i C. Den låga platta RPE-höjden under dem kan representera en basal laminär avlagring, icke-exsudativ typ 1-neovaskularisering eller båda. (E) B-skanningen genom fovea visar atrofi som känns igen genom sänkningen av HFL-ONL (röd pilspets), ett område med hypertransmission, en vitelliform förändring med ökad skuggning i fovealcentret (grön asterisk) och hyperreflekterande foci (krickpilspets) med skuggning. Det hyporeflekterande utrymmet mellan näthinnan och RPE-bandet kan representera subretinal vätska. (F) Den nära infraröda reflektansen visar hyperreflekterande fläckar i fovea. (G) Den rödfria bilden visar NFL: s bågformiga fibrer och reflekterande blommor på näthinnans yta. (H) 488 nm autofluorescens fokuserad på näthinnan visar en signal associerad med näthinnans kärl, ingen signal associerad med RPE och svaga autofluorescerande fläckar i det centrala makulära området. (I) 787 nm autofluorescens visar en signal som motsvarar pigmentering i C. Cirkulära atrofiska områden är uppenbara. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 5: Multimodal ex vivo-avbildning av typ 1 kärlnybildning och makuladetrofi vid åldersrelaterad makuladegeneration. Ett donatoröga från en 86-årig kvinnlig donator med ett intervall på 3,5 timmar för död till konservering. (A) Ögonbotten i vänster öga sedd med det främre segmentet avlägsnat (transbelysning). (B) Närbild av gula fläcken med atrofiska gränser (gula pilspetsar). De gröna linjerna anger placeringen av OCT B-skanningarna i panelerna D och E. (C) Närbild av fovea visar svart pigmentering (gröna pilspetsar) inom det atrofiska området. (D,E) OCT B-Skannar genom (D) perifovea (E) och fovea. Näthinnan I och tunn choroid (C) är synliga. I detta exceptionellt välbevarade öga är även den måttligt reflekterande IPL och OPL synliga. (D) Den perifoveala B-skanningen betar den övre kanten av det atrofiska området. Atrofi framgår av slapp av HFL-ONL och ökad hypertransmission (röda pilspetsar). Möjliga subretinala drusenoidavlagringar indikeras (fuchsia pilspetsar). (E) Foveal B-skanning visar en hög av subfovealt hyperreflekterande material och intraretinala cystor (asterisk). O = synnervshuvud. (F) Den nära infraröda reflektansen visar ett reflekterande område av atrofi och koroidala kärl (krickpilspetsar), inklusive ett litet intensivt område i centrala makula (orange pilspets) som inte syns av färgavbildning. (G) Den rödfria reflektansen visar näthinnans kärl och, inom en ringformig zon, koroidala kärl. (H) Autofluorescensen på 488 nm visar en ungefär cirkulär atrofisk kant (gula pilspetsar) och öar av begynnande atrofi. Ett centralt område utan autofluorescens är omgivet av en annulus av måttlig autofluorescens och synliga koroidala kärl (vita pilspetsar). Autofluorescensen på 787 nm var inte möjlig i detta öga. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 6: Vanliga artefakter som ses vid ex vivo OCT-avbildning av donatorögon. Dessa ögon kommer från ögonserien 2016-2017. De flesta näthinnor är hyperreflekterande i förhållande till näthinnorna avbildade in vivo, och de inre näthinneskikten är mer reflekterande än de yttre näthinnelagren. Bacillär frigöring (gula pilspetsar i panelerna A, D, G och I) definieras som en delning vid nivån av fotoreceptorns inre segment myoid, vilket skapar en distinkt intraretinal hålighet40. Näthinneavlossning (gröna pilspetsar i panelerna B, C, D, F, G och I) beskriver en separation av hela den neurosensoriska näthinnan från den underliggande RPE42. Lossningar av det inre begränsande membranet (ILM) separerar ILM- och nervfiberskiktet (röda pilspetsar i panelerna A, B och I). En koroidal frigöring (blå pilspets i panel C) är en separation i choroid eller mellan choroid och sclera. Mekaniska skador (lila pil i panelerna F och G) kan visas på vilken nivå som helst och med alla dimensioner, vilket gäller saknat material (grön pil i panel G) och förskjutet material (gul pil i panel G). Retinalt ödem (lila stjärnor i panelerna A och I) framträder som en förtjockning av näthinnans vävnad med dåligt definierade gränser mellan de separata näthinneskikten. Ett böljande RPE (blå pilar i panelerna E och J) visas som ett ojämnt, vågigt RPE-lager. Cystoida lesioner (röd fyrkant i panel H) korrelerar med hyporeflekterande kammarliknande förändringar i näthinnans vävnad, vanligtvis i fovea. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 7: Patologins synlighet ex vivo sett in vivo beroende på bevarandekvaliteten. (A-Jag) Paneler A, Boch CPaneler D, Eoch Foch paneler G, Hoch Jag representerar tre kliniskt dokumenterade ögon från två donatorer, var och en sedd genom eyetracking in vivo (A1-A2,D1-D2,G1-G2) och ex vivo (B1-B2,E1-E2,H1-H2) avbildning, följt av histologi (C,F,Jag). De gröna linjerna på den nära infraröda reflektansen (NIR, A1,B1,D1,E1,G1,H1) representerar nivåerna av optisk koherenstomografi (OCT), B-skanningar och panoramahistologi. Paneler A, Boch C och paneler D, Eoch F, presentera höger respektive vänster öga på en kvinnlig donator i 90-årsåldern. Paneler G, Hoch Jag visa det högra ögat hos en andra kvinnlig donator, också i 90-årsåldern. (A-C) Välbevarad okulär vävnad (DtoP: 2,1 h) möjliggör god synlighet av huvudpatologin. (A) En hyperreflekterande intraretinal makulakularisering (typ 3 MNV, grön pilspets) omges av intraretinal vätska 17 månader före döden (A2). RPE/Bruchs membrankomplex delas av hyporeflekterande material och framträder som ett "dubbelskiktstecken" (A2). Till vänster finns en annan dubbelskiktsskylt med streckkodsöverföring i choroid (orange pilspets). På ex vivo ULT (B2) är MNV- och streckkodshypertransmission av typ 3 tydligt synliga och avgränsade. Näthinnan är artefaktiskt fristående, vilket visas av den vita pilspetsen. Panoramahistologin visar en vertikalt orienterad typ 3 MNV-lesion (grön pilspets, C1). Se tidigare forskning43,44 för detaljer om det ursprungliga fallet. (D-F) Välbevarad okulär vävnad (DtoP: 2,1 h) kan resultera i transparens som är reducerad men ändå tillräcklig för att upptäcka större patologi. ULT (D2) visar en stapel intraretinala hyperreflekterande foci (HRF, fuchsia pilspets) i ett öga följt för exsudativ typ 3 MNV. Inga intraretinala cystor är synliga 11 månader före döden. På ex vivo ULT (E2) komprimeras bunten varmvalsade platta stålprodukter vertikalt (fuchsiapilspets) men är tydligt avgränsad. Om panoramahistologi (F1), ett retinalt pigmentepiteltorn (fuchsia pilspets) stiger uppåt från en mjuk druse. (G-Jag) Mindre välbevarad okulär vävnad (DtoP: 8,9 h) resulterar i minskad synlighet av större patologi. OCT indikerar en yttre retinal tubulering (ORT, gul pilspets) 48 månader före döden (G2). På den ex vivo OCT, framstår ORT som en subtil störning, och detta skulle ha varit svårt att urskilja utan förkunskaper (H2). Det inre begränsande membranet är artificiellt avskilt (vit pilspets). Ödem har förvrängt näthinnans kontur. Den histologiska analysen visar ORT-lumen avgränsad av det yttre begränsande membranet och fotoreceptorerna som sticker ut i det (Jag1). Se tidigare forskning26,45 för detaljer om det ursprungliga fallet. Klicka här för att se en större version av denna figur.
| Tal | Procentsatser | |||||
| Diagnostisk kategori | Högra ögon | Vänster ögon | Total | Högra ögon | Vänster ögon | Total |
| Alldaglig | 39 | 34 | 73 | 41.50% | 37.80% | 39.70% |
| Tvivelaktig AMD | 10 | 11 | 21 | 10.60% | 12.20% | 11.40% |
| Tidig AMD | 20 | 22 | 42 | 21.30% | 24.40% | 22.80% |
| Atrofisk AMD | 6 | 8 | 14 | 6.40% | 8.90% | 7.60% |
| Neovaskulär AMD | 11 | 7 | 18 | 11.70% | 7.80% | 9.80% |
| Annan | 7 | 8 | 15 | 7.40% | 8.90% | 8.20% |
| Okänd | 0 | 0 | 0 | 0.00% | 0.00% | 0.00% |
| Ej inspelad | 1 | 0 | 1 | 1.10% | 0.00% | 0.50% |
| Total | 94 | 90 | 184 | 100.00% | 100.00% | 100.00% |
| Vissa AMD | 37 | 37 | 75 | 39.40% | 41.10% | 40.20% |
| Möjlig AMD | 47 | 48 | 95 | 50.00% | 53.30% | 51.60% |
| Ögon anslöts under perioden 6/17/16 - 9/14/17. Kriterier: ≥ 80 år, vit, icke-diabetiker, ≤6 h död till konservering. Mål: 184 ögon (180 ögon av 90 givare, bevarade; 4 ögon av 4 givare, bevarade) Död-till-bevarande tid (medelvärde, maximalt, minimum): 3,9 timmar, 6,4 timmar, 2,0 timmar | ||||||
Tabell 1: Återhämtning från givarögon från 2016–2017.
Kompletterande material 1: Översikt över dissektionen, färgfundusfotografering och OCT-baserad multimodal avbildning. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande material 2: Detaljer om den OCT-baserade multimodala avbildningen för att illustrera stegen i avsnitten 5-8. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Med hjälp av en populationsbaserad screeningmetod under en 16-månadersperiod före COVID-eran var det möjligt att skaffa 75 donatorögon med AMD. Alla återfanns med en kort DtoP och iscensattes med OCT-förankrad MMI. Ålderskriteriet (>80 år) ligger utanför det typiska åldersintervallet för vävnadsåtervinning avsedd för transplanterbara hornhinnor. Trots den höga åldern resulterade våra kriterier i ögon i alla stadier av AMD. Många RPE-fenotyper är gemensamma för alla AMD-stadier, och vissa är exklusiva för neovaskulär AMD 3,46. Den direkta jämförelsen av ex vivo- och in vivo-avbildning (figur 7) bekräftade att kort DtoP är en kritisk faktor, tillsammans med experthantering (figur 1), för att producera ex vivo-bilder av den yttre näthinnan som är tillräckliga för diagnostisk klassificering på toppnivå, och några av dessa prover var lämpliga för direkta korrelationer mellan avbildning och histologi4,35, 47. Inte all patologi är synlig ex vivo. Men mycket mer är synligt när man använder OCT jämfört med färgfotograferingsbaserade metoder10, särskilt de som involverar att separera näthinnan från RPE / choroid27. Vidare riktar ögonspårning från klinisk OCT uppmärksamheten på fokala och ibland små funktioner (figur 7).
Detta konserveringssystem involverar typiska ögonbankprocedurer och verktyg för borttagning av hornhinnan, följt av nedsänkning av ett öppnat öga i ett konserveringsmedel som tillhandahålls i förväg. På så sätt kan ögonbankens personal kontinuerligt återvinna forskningsvävnader (24/7). Den senare egenskapen är kritisk, eftersom vävnader avsedda för omedelbara komplexa dissektioner27,32 kräver dygnet runt bemanning av antingen utredarna, ögonbanken eller båda. Andra stabilisatorer som skulle möjliggöra vävnadsåtervinning när som helst följt av specialiserad dissektion och extraktioner under arbetstid, såsom PAXgene Tissue System och Hibernate-A, kan vara till hjälp i framtiden om dessa är kompatibla med OCT-avbildning.
Detta tillvägagångssätt ger näthinnor som förblir till stor del kopplade till RPE och därmed kan generera data som kan översättas till OCT-avbildning. Exakt lokalisering är avgörande eftersom makula är liten (<3% av näthinnan). Vidare är avinsättningsdriven AMD-progression i linje med topografin hos kottar och stavar48, och de tidigaste debuterande och mest ihållande visuella defekterna uppträder på en specifik plats (dvs. den stavinnehållande parafovea bredvid all-cone fovea)49. För jämförelse med OCT är immunhistokemi med kolorimetriska färgämnen kompatibel med omfattande mikroskopi (t.ex. ljusfält) för att redogöra för alla vävnadselement, både märkta och omärkta4. Oriktade molekylära analyser baserade på provtagningsmatriser kan utnyttja den horisontella inriktningen av vertikalt uppdelade fotoreceptorer och RPE för att effektivt öka upplösningen. Avbildning av masspektrometri med joniserande laserpulser med en diameter på 8 μm och 10-15 μm från varandra kan lokalisera dussintals lipider till subcellulära fack i de yttre näthinnecellerna50. Rumsligt upplöst transkriptomik använder en förutbestämd uppsättning streckkodade primers för omvänd transkription på glasskivor, till vilka vävnadssektioner appliceras51. Denna teknik är för närvarande begränsad till infångning med en diameter på 55 μm och ett avstånd på 100 μm. förbättringar i upplösningen som skulle göra denna teknik lämplig för AMD-forskning förväntas.
Detta protokoll har begränsningar. Återhämtningskriteriet utelämnar diagnoser av diabetes (30% bland Medicare-mottagare i Alabama)52 på grund av betydelsen av choroid vid båda sjukdomarna. Denna uteslutning minskar den totala donatorpoolen och förlänger den tid som behövs för att samla tillräckligt med ögon för en studie. Av historiska skäl utelämnade kriterierna 2016-2017 svarta givare, som nu representerar 14% av statliga ögondonatorer, och svarta givare ingår nu i nuvarande potentiella projekt. Förhandsdirektivregistret för personer som vill bli ögondonatorer är omfattande men inkluderar ännu inte bekväm registrering vid lokala näthinnans specialmottagningar som tar hand om AMD-patienter; Detta projekt är för närvarande under utveckling. Under en populationsbaserad skärm som den här kommer ögon med tillstånd som överlappar i fenotyp med AMD att visas och måste erkännas i samråd med den utvecklande kliniska litteraturen och en ögonläkare som specialiserat sig på näthinnesjukdomar. Till exempel inkluderade denna serie ögon nevi med drusen53 och en linje av RPE-störning över ett pachyvessel (ett tjockt kärl i den inre koroiden)54. Slutligen kombinerades tidig och mellanliggande AMD på grund av bristen på ett OCT-baserat betygssystem för AMD, som är under utveckling av Classification of Atrophy Meeting group55. Ändå tillåter optimeringen av vävnadsåtervinning och OCT-baserad karakterisering AMD-forskning som fokuserar på att utnyttja tidselementet för ögonspårad OCT-förankrad MMI som ska planeras, drivas, schemaläggas och budgeteras för i finansieringsansökningar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
C.A.C. får forskningsstöd från Heidelberg Engineering och konsulterar för Apellis, Astellas, Boehringer Ingelheim, Character Bioscience och Osanni. T.A. får forskningsstöd från Novartis och konsulterar för Roche, Novartis, Bayer, Nidek och Apellis. K.B.F. är konsult till Genentech, Zeiss, Heidelberg Engineering, Allergan, Bayer och Novartis.
Acknowledgments
Vi tackar Heidelberg Engineering för instrumenteringen och utformningen av den ursprungliga ögonhållaren, Richard F. Spaide MD för introduktionen till OCT-baserad multimodal avbildning, Christopher Girkin MD för att underlätta tillgången till kliniska bildenheter och David Fisher för figur 1. Återhämtningen av de mänskliga donatorögonen för forskning stöddes av National Institutes of Health (NIH) bidrag R01EY06019 (CAC), P30 EY003039 (Pittler), R01EY015520 (Smith), R01EY027948 (CAC, TA) R01EY030192 (Li), R01EY031209 (Stambolian) och U54EY032442 (Spraggins), IZKF Würzburg (N-304, T.A.), EyeSight Foundation of Alabama, International Retinal Research Foundation (C.A.C.), Arnold och Mabel Beckman Initiative for Macular Research (CAC) och Research to Prevent Blindness AMD Catalyst (Schey).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Beakers, 250 mL | Fisher | # 02-540K | |
| Bottles, 1 L, Pyrex | Fisher | # 10-462-719 | storage for preservative |
| Bunsen burner or heat source | Eisco | # 17-12-818 | To melt wax |
| Camera, digital | Nikon D7200 | D7200 | |
| Computer and storage | Apple | iMac Pro; 14 TB external hard drive | Image storage |
| Container, insulated | Fisher | # 02-591-45 | For wet ice |
| Containers, 2 per donor, 40 mL | Fisher | Sameco Bio-Tite 40 mL # 13-711-86 | For preservative |
| Crucible, quartz 30 mL | Fisher | # 08-072D | Hold globe for photography |
| Cylinder, graduate, 250 mL | Fisher | # 08-549G | |
| Disinfectant cleaning supplies | https://www.cardinalhealth.com/en/product-solutions/medical/infection-control/antiseptics.html | ||
| Eye holder with lens and mounting bracket | contact J. Messinger | jeffreymessinger@uabmc.edu | custom modification of Heidelberg Engineering original design |
| Face Protection Masks | Fisher | # 19-910-667 | |
| Forceps, Harmon Fix | Roboz | # RS-8247 | |
| Forceps, Micro Adson | Roboz | # RS-5232 | |
| Forceps, Tissue | Roboz | # RS-5172 | |
| Glass petri dish, Kimax | Fisher | # 23064 | |
| Gloves Diamond Grip | Fisher | # MF-300 | |
| Gowns GenPro | Fisher | # 19-166-116 | |
| Image editing software | Adobe | Photoshop 2021, Creative Suite | |
| KimWipes | Fisher | # 06-666 | |
| Lamps, 3 goosenecks | Schott Imaging | # A20800 | |
| Microscope, stereo | Nikon | SMZ 1000 | for dissection |
| Microscope, stereo | Olympus | SZX9 | color fundus photography |
| Paraformaldehyde, 20% | EMS | # 15713-S | for preservative; dilute for storage |
| pH meter | Fisher | # 01-913-806 | |
| Phosphate buffer, Sorenson’s, 0.2 M pH 7.2 | EMS | # 11600-10 | |
| Ring flash | B & H Photo Video | Sigma EM-140 DG | |
| Ruby bead, 1 mm diameter | Meller Optics | # MRB10MD | |
| Safety Glasses 3M | Fisher | # 19-070-940 | |
| Scanning laser ophthalmoscope | Heidelberg Engineering | HRA2 | |
| Scissors, curved spring | Roboz | # RS-5681 | |
| Sharps container | Fisher | # 1482763 | |
| Shutter cord, remote | Nikon | MC-DC2 | |
| Spectral Domain OCT device | Heidelberg Engineering | Spectralis HRA&OCT | https://www.heidelbergengineering.com/media/e-learning/Totara-US/files/pdf-tutorials/2238-003_Spectralis-Training-Guide.pdf |
| Stainless steel ball bearing, 25.4 mm diameter | McMaster-Carr | # 9529K31 | |
| Tissue marking dye, black | Cancer Diagnostics Inc | # 0727-1 | |
| Tissue slicer blades | Thomas Scientific | # 6767C18 | |
| Trephine, 18-mm diameter | Stratis Healthcare | # 6718L | |
| TV monitor (HDMI) and cord for digital camera | B&H Photo Video | BH # COHD18G6PROB | for live viewing and remote camera display features |
| Wax, pink dental | EMS | # 72670 | |
| Wooden applicators | Puritan | # 807-12 |
References
- Spaide, R. F., et al. Consensus nomenclature for reporting neovascular age-related macular degeneration data: Consensus on neovascular age-related macular degeneration nomenclature study group. Ophthalmology. 127 (5), 616-636 (2020).
- Spaide, R. F., Ooto, S., Curcio, C. A. Subretinal drusenoid deposits a.k.a. pseudodrusen. Survey of Ophthalmology. 63 (6), 782-815 (2018).
- Curcio, C. A., Zanzottera, E. C., Ach, T., Balaratnasingam, C., Freund, K. B. Activated retinal pigment epithelium, an optical coherence tomography biomarker for progression in age-related macular degeneration. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 58 (6), 211-226 (2017).
- Cao, D., et al. Hyperreflective foci, OCT progression indicators in age-related macular degeneration, include transdifferentiated retinal pigment epithelium. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 62 (10), 34 (2021).
- Zanzottera, E. C., et al. Visualizing retinal pigment epithelium phenotypes in the transition to geographic atrophy in age-related macular degeneration. Retina. 36, S12-S25 (2016).
- Edwards, M. M., et al. Subretinal glial membranes in eyes with geographic atrophy. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 58 (3), 1352-1367 (2017).
- Zhang, Z., Shen, M. M., Fu, Y. Combination of AIBP, apoA-I, and aflibercept overcomes anti-VEGF resistance in neovascular AMD by inhibiting arteriolar choroidal neovascularization. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 63 (12), 2 (2022).
- Jiang, M., et al. Microtubule motors transport phagosomes in the RPE, and lack of KLC1 leads to AMD-like pathogenesis. Journal of Cell Biology. 210 (4), 595-611 (2015).
- Collin, G. B., et al. Disruption of murine Adamtsl4 results in zonular fiber detachment from the lens and in retinal pigment epithelium dedifferentiation. Human Molecular Genetics. 24 (24), 6958-6974 (2015).
- Curcio, C. A., Medeiros, N. E., Millican, C. L. The Alabama Age-related Macular Degeneration Grading System for donor eyes. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 39 (7), 1085-1096 (1998).
- Bastek, J. V., Siegel, E. B., Straatsma, B. R., Foos, R. Y. Chorioretinal juncture. Pigmentary patterns of the peripheral fundus. Ophthalmology. 89 (12), 1455-1463 (1982).
- Lewis, H., Straatsma, B. R., Foos, R. Y., Lightfoot, D. O.
- Lewis, H., Straatsma, B. R., Foos, R. Y. Chorioretinal juncture. Multiple extramacular drusen. Ophthalmology. 93 (8), 1098-1112 (1986).
- Sarks, J. P., Sarks, S. H., Killingsworth, M. C. Evolution of geographic atrophy of the retinal pigment epithelium. Eye. 2 (5), 552-577 (1988).
- Sarks, J. P., Sarks, S. H., Killingsworth, M. C. Evolution of soft drusen in age-related macular degeneration. Eye. 8 (3), 269-283 (1994).
- Ghazi, N. G., Dibernardo, C., Ying, H. S., Mori, K., Gehlbach, P. L. Optical coherence tomography of enucleated human eye specimens with histological correlation: Origin of the outer "red line". American Journal of Ophthalmology. 141 (4), 719-726 (2006).
- Brown, N. H., et al. Developing SDOCT to assess donor human eyes prior to tissue sectioning for research. Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 247 (8), 1069-1080 (2009).
- Helb, H. M., et al. Clinical evaluation of simultaneous confocal scanning laser ophthalmoscopy imaging combined with high-resolution, spectral-domain optical coherence tomography. Acta Ophthalmologica. 88 (8), 842-849 (2010).
- Spaide, R. F., Curcio, C. A. Drusen characterization with multimodal imaging. Retina. 30 (9), 1441-1454 (2010).
- Naghavi, M., et al. From vulnerable plaque to vulnerable patient: a call for new definitions and risk assessment strategies: Part 1. Circulation. 108 (14), 1664-1672 (2003).
- Garcia-Garcia, H. M., Gonzalo, N., Regar, E., Serruys, P. W. Virtual histology and optical coherence tomography: from research to a broad clinical application. Heart. 95 (16), 1362-1374 (2009).
- Strouthidis, N. G., et al. Comparison of clinical and spectral domain optical coherence tomography optic disc margin anatomy. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 50 (10), 4709-4718 (2009).
- Sarks, S. H. Ageing and degeneration in the macular region: A clinico-pathological study. British Journal of Ophthalmology. 60 (5), 324-341 (1976).
- Sura, A. A., et al. Measuring the contributions of basal laminar deposit and Bruch's membrane in age-related macular degeneration. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 61 (13), 19 (2020).
- Chen, L., Messinger, J. D., Kar, D., Duncan, J. L., Curcio, C. A. Biometrics, impact, and significance of basal linear deposit and subretinal drusenoid deposit in age-related macular degeneration. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 62 (1), 33 (2021).
- Litts, K. M., et al. Clinicopathological correlation of outer retinal tubulation in age-related macular degeneration. JAMA Ophthalmology. 133 (5), 609-612 (2015).
- Olsen, T. W., Feng, X. The Minnesota grading system of eye bank eyes for age-related macular degeneration. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 45 (12), 4484-4490 (2004).
- Mano, F., Sprehe, N., Olsen, T. W. Association of drusen phenotype in age-related macular degeneration from human eye-bank eyes to disease stage and cause of death. Ophthalmology Retina. 5 (8), 743-749 (2021).
- Age-related eye disease study research group. The Age-Related Eye Disease Study system for classifying age-related macular degeneration from stereoscopic color fundus photographs: The Age-Related Eye Disease Study Report Number 6. American Journal of Ophthalmology. 132 (5), 668-681 (2001).
- Arnold, J. J., Sarks, S. H., Killingsworth, M. C., Sarks, J. P. Reticular pseudodrusen. A risk factor in age-related maculopathy. Retina. 15 (3), 183-191 (1995).
- Olsen, T. W., Bottini, A. R., Mendoza, P., Grossniklausk, H. E. The age-related macular degeneration complex: linking epidemiology and histopathology using the Minnesota grading system (the inaugural Frederick C. Blodi Lecture). Transactions of the American Ophthalmological Society. 113, (2015).
- Owen, L. A., et al. The Utah protocol for postmortem eye phenotyping and molecular biochemical analysis. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 60 (4), 1204-1212 (2019).
- Wang, J. J., et al. Ten-year incidence and progression of age-related maculopathy: The Blue Mountains Eye Study. Ophthalmology. 114 (1), 92-98 (2007).
- Joachim, N., Mitchell, P., Burlutsky, G., Kifley, A., Wang, J. J. The incidence and progression of age-related macular degeneration over 15 years: The Blue Mountains Eye Study. Ophthalmology. 122 (12), 2482-2489 (2015).
- Pang, C., Messinger, J. D., Zanzottera, E. C., Freund, K. B., Curcio, C. A. The onion sign in neovascular age-related macular degeneration represents cholesterol crystals. Ophthalmology. 122 (11), 2316-2326 (2015).
- Keilhauer, C. N., Delori, F. C. Near-infrared autofluorescence imaging of the fundus: Visualization of ocular melanin. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 47 (8), 3556-3564 (2006).
- Curcio, C. A., Saunders, P. L., Younger, P. W., Malek, G. Peripapillary chorioretinal atrophy: Bruch's membrane changes and photoreceptor loss. Ophthalmology. 107 (2), 334-343 (2000).
- Curcio, C. A. Imaging maculopathy in the post-mortem human retina. Vision Research. 45 (28), 3496-3503 (2005).
- Brinkmann, M., et al. Histology and clinical lifecycle of acquired vitelliform lesion, a pathway to advanced age-related macular degeneration. American Journal of Ophthalmology. 240, 99-114 (2022).
- Ramtohul, P., et al. Bacillary layer detachment: Multimodal imaging and histologic evidence of a novel optical coherence tomography terminology. Literature review and proposed theory. Retina. 41 (11), 2193-2207 (2021).
- Wilson, J. D., Foster, T. H. Mie theory interpretations of light scattering from intact cells. Optics Letters. 30 (18), 2442-2444 (2005).
- Ghazi, N. G., Green, W. R. Pathology and pathogenesis of retinal detachment. Eye. 16 (4), 411-421 (2002).
- Berlin, A., et al. Correlation of optical coherence tomography angiography of type 3 macular neovascularization with corresponding histology. JAMA Ophthalmology. 140 (6), 628-633 (2022).
- Berlin, A., et al. Histology of type 3 macular neovascularization and microvascular anomalies in anti-VEGF treated age-related macular degeneration. Ophthalmology Science. 3 (3), 100280 (2023).
- Schaal, K. B., et al. Outer retinal tubulation in advanced age-related macular degeneration: optical coherence tomographic findings correspond to histology. Retina. 35 (7), 1339-1350 (2015).
- Chen, L., et al. Histology and clinical imaging lifecycle of black pigment in fibrosis secondary to neovascular age-related macular degeneration. Experimental Eye Research. 214, 108882 (2022).
- Balaratnasingam, C., et al. Histologic and optical coherence tomographic correlations in drusenoid pigment epithelium detachment in age-related macular degeneration. Ophthalmology. 124 (1), 644-656 (2017).
- Curcio, C. A., et al. Subretinal drusenoid deposits in non-neovascular age-related macular degeneration: Morphology, prevalence, topography, and biogenesis model. Retina. 33 (2), 265-276 (2013).
- Owsley, C., et al. Biologically guided optimization of test target location for rod-mediated dark adaptation in age-related macular degeneration: ALSTAR2 baseline. Ophthalmology Science. 3 (2), 100274 (2023).
- Anderson, D. M. G., et al. The molecular landscape of the human retina and supporting tissues by high resolution imaging mass spectrometry. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 31 (12), 2426-2436 (2020).
- Lee, J., Yoo, M., Choi, J. Recent advances in spatially resolved transcriptomics: challenges and opportunities. BMB Reports. 55 (3), 113-124 (2022).
- Diabetes. Alabama Public Health. , Available from: https://www.alabamapublichealth.gov/healthrankings/diabetes.html (2022).
- Francis, J. H., et al. Swept-source optical coherence tomography features of choroidal nevi. American Journal of Ophthalmology. 159 (1), 169-176 (2015).
- Inoue, M., Dansingani, K. K., Freund, K. B. Progression of age-related macular degeneration overlying a large choroidal vessel. Retina Cases Brief Reports. 10 (1), 22-25 (2016).
- Jaffe, G. J., et al. Imaging features associated with progression to geographic atrophy in age-related macular degeneration: CAM Report 5. Ophthalmology Retina. 5 (9), 855-867 (2021).
