Summary
El protocolo presenta una nueva herramienta para simplificar la obtención de imágenes intravitales mediante microscopía confocal invertida.
Abstract
Comprender los comportamientos normales y aberrantes de las células in vivo es necesario para desarrollar intervenciones clínicas que frustren el inicio y la progresión de la enfermedad. Por lo tanto, es fundamental optimizar los enfoques de imagen que faciliten la observación de la dinámica celular in situ, donde la estructura y la composición de los tejidos permanecen inalteradas. La epidermis es la barrera más externa del cuerpo, así como la fuente de los cánceres humanos más prevalentes, a saber, los carcinomas cutáneos de piel. La accesibilidad del tejido cutáneo presenta una oportunidad única para monitorizar el comportamiento de las células epiteliales y dérmicas en animales intactos mediante microscopía intravital no invasiva. Sin embargo, este sofisticado enfoque de imagen se ha logrado principalmente utilizando microscopios multifotónicos verticales, que representan una barrera de entrada significativa para la mayoría de los investigadores. Este estudio presenta un inserto de platina de microscopio impreso en 3D diseñado a medida y adecuado para su uso con microscopios confocales invertidos, lo que agiliza la obtención de imágenes intravitales a largo plazo de la piel del oído en ratones transgénicos vivos. Creemos que esta versátil invención, que puede personalizarse para adaptarse a la marca y el modelo de microscopio invertido de elección y adaptarse a la obtención de imágenes de sistemas de órganos adicionales, resultará invaluable para la comunidad de investigación científica en general al mejorar significativamente la accesibilidad de la microscopía intravital. Este avance tecnológico es fundamental para reforzar nuestra comprensión de la dinámica de las células vivas en contextos normales y de enfermedad.
Introduction
La microscopía intravital es una poderosa herramienta que permite el monitoreo de los comportamientos celulares en sus ambientes in vivo no perturbados. Este método único ha proporcionado información clave sobre el funcionamiento interno de los complejos sistemas de órganos de los mamíferos, incluidos el pulmón1, el cerebro2, el hígado3, la glándula mamaria4, el intestino5 y la piel6. Además, este enfoque ha revelado alteraciones del comportamiento celular durante el desarrollo tumoral7, la cicatrización de heridas8,9, la inflamación10 y otras patologías diversas in situ. En este estudio, nos centramos en mejorar la accesibilidad de la microscopía intravital para obtener imágenes de la dinámica epitelial y estromal en vivo en la piel intacta del ratón. La comprensión del comportamiento celular en la piel de mamíferos es de gran importancia clínica debido a la notable capacidad regenerativa y tumorigénica de este tejido.
La obtención de imágenes intravitales en ratones se ha realizado principalmente utilizando microscopios multifotónicos verticales debido a su capacidad para proporcionar imágenes de alta resolución a profundidades tisulares >100 μm11,12. Sin embargo, estos instrumentos carecen de la versatilidad y la accesibilidad más general de los microscopios confocales invertidos, que son más fáciles de usar y rentables, proporcionan la capacidad de obtener imágenes de células cultivadas, no requieren oscuridad completa durante la adquisición de imágenes y, en general, son más seguros, entre otras ventajas notables13,14. En este estudio, presentamos una nueva herramienta que mejora significativamente la accesibilidad a las imágenes intravitales mediante la adaptación de este enfoque para microscopios confocales invertidos.
Aquí, presentamos un diseño de inserto de platina personalizado impreso en 3D que incorpora varias características clave para facilitar la obtención de imágenes intravitales estables y a largo plazo de la piel del oído de ratón en un microscopio confocal invertido (Figura 1, Figura 2, Figura 3, Figura 4 y Figura 5). Estas características especializadas incluyen un orificio de objetivo desplazado que permite que todo el cuerpo de un ratón adulto quede completamente plano durante la obtención de imágenes. Esto minimiza la interferencia vibratoria de los movimientos del cuerpo del ratón en las imágenes y elimina la necesidad de administrar ketamina y xilacina para amortiguar la respiración, una práctica que a menudo se combina con las imágenes intravitales6. Además, los soportes de las esquinas del inserto colocan correctamente un cono de nariz de isoflurano para alinearlo con la cara del ratón, un clip metálico para la oreja inmoviliza la oreja del ratón a un disco de cubreobjetos hecho a medida, y una placa térmica de biorretroalimentación de circuito cerrado desmontable opcional se encuentra al ras del inserto para soportar la temperatura corporal del ratón durante las largas sesiones de imágenes. El disco de cubreobjetos personalizado, que proporciona una superficie plana esencial para que la cabeza y la oreja del ratón queden planas, se generó en un taller mecánico quitando las paredes de una placa de cultivo celular genérica que contenía cubreobjetos. El uso de una lente de inmersión en aceite de silicona de 40x (apertura numérica de 1,25 [N.A.], distancia de trabajo de 0,3 mm) junto con el disco de cubreobjetos y el inserto de platina personalizado proporciona imágenes de alta resolución a >50 μm de profundidad en la dermis del oído.
Para probar la funcionalidad de este nuevo inserto de platina de microscopio invertido, capturamos pilas z que abarcan todas las capas epiteliales epidérmicas durante un curso de tiempo de 3 h en el oído de un ratón adulto transgénico vivo K14-H2B-mCherry15 (los núcleos epiteliales de esta línea de ratones contienen una etiqueta fluorescente roja) (Figura 6A-A'). También capturamos pilas z que abarcan varias capas de fibroblastos dentro de la dermis de la piel durante un curso de tiempo de 3 h en el oído de un Pdgfra-rtTA16 transgénico vivo; Ratón adulto pTRE-H2B-GFP17 (los núcleos de fibroblastos de esta línea de ratones contienen una etiqueta fluorescente verde tras la inducción de doxiciclina) (Figura 6B-D'). Nuestros datos de alta resolución demuestran una estabilidad constante por falta de deriva en los planos x, y y z, lo que demuestra la eficacia de esta nueva herramienta de imágenes intravitales para su uso en microscopios invertidos. Es importante destacar que las dimensiones de este inserto de platina impreso en 3D se pueden ajustar, como se describe en el Archivo Suplementario 1, el Archivo Suplementario 2 y el Archivo Suplementario 3, para adaptarse a cualquier microscopio invertido, y la posición de la abertura del objetivo se puede mover a ubicaciones alternativas dentro del inserto para adaptarse mejor a la obtención de imágenes de un tejido particular y/o modelo animal de interés. Por lo tanto, esta invención puede capacitar a los laboratorios individuales, o a los investigadores con acceso confocal a las instalaciones básicas, para adaptar esta herramienta a sus necesidades únicas de imágenes intravitales, agilizando así la evaluación de la biología celular in vivo diversa.
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Protocol
Esta investigación se realizó de acuerdo con las pautas de cuidado y uso de animales de la Universidad de Emory y el Centro Médico de Asuntos de Veteranos de Atlanta y ha sido aprobada por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC).
1. Instalación del inserto de imágenes en vivo en la platina del microscopio invertido
- Construya la inserción utilizando archivos .stl (Archivo Suplementario 1, Archivo Suplementario 2 y Archivo Suplementario 3) especificando las dimensiones y el diseño 3D (consulte la Figura 1 y la Figura 2A), una impresora 3D y ácido poliláctico (PLA).
- Coloque con cuidado el inserto (Figura 2B, C) en la ranura de la platina grande del microscopio (Figura 2C y Figura 3A). Utilice tornillos para asegurar el inserto a través de cuatro orificios para tornillos ubicados en cada esquina del inserto (Figura 2B-C).
NOTA: El inserto es bidireccional y se puede girar 180° dependiendo de la orientación de la platina del microscopio y del aparato de anestesia. - Deslice la placa calefactora en el tapón de inserción con el lado hacia abajo (Figura 2D) de modo que la unidad quede encima de las ranuras de inserción inferiores con el puerto de enchufe pasando por debajo de la platina (Figura 3B).
- Alinee la abertura circular ranurada en el inserto con un objetivo de inmersión en aceite de silicona 40x (Figura 3C) y aplique aceite de silicona en el centro del objetivo.
- Si toma imágenes durante períodos de tiempo más largos (>1 h), aplique una generosa cucharada de aceite que persistirá en la interfaz cubreobjetos/objetivo durante la toma de imágenes. No permita que el aceite se derrame sobre los bordes de la lente.
- Use una jeringa para aplicar una pequeña cantidad de grasa de vacío a lo largo de la abertura circular ranurada y coloque el disco de cubreobjetos encima para sellar el inserto (Figura 3D).
NOTA: El disco de cubreobjetos se crea quitando las paredes de una placa de cultivo celular con fondo de vidrio de 35 mm x 10 mm (realizada por un taller mecánico). - Levante el objetivo 40x hasta que el aceite bese el fondo del cubreobjetos de vidrio.
2. Configuración del isoflurano y preparación del ratón
- Coloque los componentes del vaporizador electrónico de bajo flujo (cámara de anestesia, tubo, vaporizador, recipiente de carbón) para permitir que el cono de la nariz y el tubo adjunto lleguen al inserto (Figura 3A).
PRECAUCIÓN: El isoflurano es un anestésico inhalatorio y debe manipularse con cuidado para evitar derrames y minimizar la exposición humana. - Mida el peso del frasco de isoflurano antes de usarlo y regístrese. Coloque la tapa del vaporizador electrónico en la botella de isoflurano.
- Conecte el cable de alimentación al vaporizador electrónico. Cierre las pinzas azules del cono de la nariz y abra las pinzas blancas de la cámara de inducción para permitir el flujo de aire a través de la cámara hacia el recipiente de carbón. Retire la tapa roja de aire ambiente del lado izquierdo de la máquina para permitir el flujo de aire.
- Deje que el sistema se caliente durante 5 minutos a 200 ml/min (flujo bajo) e isoflurano al 2%.
NOTA: Aunque se selecciona la configuración del cono de la nariz, la línea del cono de la nariz azul debe permanecer cerrada y la línea blanca de la cámara de inducción debe permanecer abierta. - Una vez que el sistema esté correctamente equilibrado, purgue las líneas para eliminar el isoflurano restante de la cámara.
- Coloque el ratón en la cámara de inducción y seleccione High Flow. Complete toda la preparación del ratón (es decir, depilación, administración tópica de medicamentos, aplicación de ungüento para los ojos, etc.) antes de colocar el cuerpo del animal sobre el inserto. Confirme que el ratón está completamente anestesiado utilizando el método del reflejo de pellizco de los dedos de los pies.
- Con la pierna extendida, use una uña para pellizcar firmemente el dedo del pie sin causar daño físico. Si el ratón muestra una reacción positiva al estímulo (es decir, retracción de las patas, contracción de los pies, etc.), continúe administrando anestésico dentro de la cámara hasta que no se observe ninguna reacción. Una vez anestesiado adecuadamente, la frecuencia respiratoria del ratón debe disminuir a ~55-65 respiraciones por minuto18.
- Cuando el ratón esté completamente anestesiado, vuelva a seleccionar High Flow para detener la administración de isoflurano. Purgue la cámara antes de abrirla y ajuste los clips (azul: abierto; blanco: cerrado) para administrar isoflurano a través del cono de la nariz. Seleccione Low Flow (Flujo bajo) mientras el cono de la nariz está conectado al mouse para continuar con la administración de isoflurano.
- Pase el tubo de isoflurano con el cono de la nariz adjunto a través del soporte del tubo de esquina en el inserto (Figura 3A y Figura 5).
3. Colocación del ratón en el inserto para la obtención de imágenes intravitales
- Conecte la placa calefactora al controlador (que contiene una sonda anal adjunta), enciéndala y deje que la placa alcance los 36 °C (Figura 4A).
- Retire el ratón anestesiado de la cámara de inducción y colóquelo sobre la placa calefactora (Figura 4B y Figura 5A). Realice la transferencia de la cámara a la inserción rápidamente para minimizar el tiempo que el ratón está activo sin anestesia inhalante.
- Fije el cono de la nariz en el ratón (Figura 4B, C y Figura 5). Si es necesario, use cinta adhesiva para asegurar aún más el ángulo y la posición del cono de la nariz.
- Inserte la sonda anal y ajuste la temperatura del controlador hasta que la temperatura corporal del mouse sea estable a ~36 °C (Figura 4A, B). Una vez que el mouse esté colocado correctamente, use una envoltura adhesiva de plástico para atrapar el calor, si es necesario, para mantener aún más la temperatura corporal adecuada (Figura 4C).
- Coloque el mouse de manera que la cabeza se alinee con el disco de cubreobjetos e inmovilice la oreja en el centro del cubreobjetos de vidrio con un clip metálico para la oreja (Figura 5A, B) o cinta adhesiva (Figura 5C).
NOTA: La presión de la pinza metálica sobre la oreja se puede ajustar aflojando el tornillo que fija la pinza al inserto. Se puede agregar un resorte de metal para aumentar la flexibilidad de apriete del clip.- Para cambiar la ubicación de la pinza para la oreja, desenrosque el perno con una llave Allen de 2,5 mm y transfiéralo al sitio secundario (Figura 2B, C). Al volver a montar el clip para la oreja, colóquelo contra el inserto, seguido de la arandela en la parte superior. Use un perno para sujetar firmemente el clip con una ligera fuerza para pivotar el clip.
- Ajuste la posición z del objetivo hasta que las celdas estén dentro del lugar focal (Figura 6A, D). Establezca los parámetros de pila z y lapso de tiempo de acuerdo con los objetivos experimentales y comience la adquisición de imágenes.
NOTA: Si se logra la configuración correcta, se pueden obtener imágenes de la oreja del ratón durante al menos 3 h consecutivas (Figura 6A', D').- Una vez establecidos los límites de la pila z, ajuste la potencia y la ganancia del láser para asegurarse de que ningún plano z esté sobresaturado para minimizar el fotoblanqueo. Determine los parámetros de lapso de tiempo utilizando el grosor total de la pila z, los números de paso (se recomienda el muestreo de Nyquist) y los intervalos de tiempo.
- Determine los parámetros de imagen (intervalos de tiempo, tiempo total de obtención de imágenes, etc.) utilizando múltiples factores, incluida la viabilidad de los animales bajo anestesia, el fotoblanqueo/fototoxicidad inducido por láser y el objetivo de las imágenes en vivo (es decir, la dinámica de la división celular, las interacciones célula-célula, etc.).
4. Terminación de la imagen
- Encienda la almohadilla térmica de circulación de agua y configúrela en Ciclo continuo y 35 °C durante al menos 30 minutos antes de finalizar la adquisición de la imagen.
- Al finalizar la obtención de imágenes, seleccione Low Flow en el vaporizador electrónico para detener la administración de isoflurano y mueva el mouse a una almohadilla térmica hasta que sea ambulatorio.
- Una vez despierto, mueva el mouse de regreso al recipiente de transferencia mientras continúa manteniéndolo en una almohadilla térmica hasta que esté completamente ambulatorio. Supervise constantemente el mouse mientras está en el panel térmico hasta que responda.
- En el vaporizador electrónico, haga clic en Seleccionar menú > Control anestésico > vacío. Retire el frasco de isoflurano del sistema y vuelva a colocar la tapa del fabricante en el frasco.
- Mida el peso de la botella de isoflurano y el recipiente de carbón e ingrese los pesos en el registro. Una vez que el recipiente de carbón pese 50 g por encima de la medición de referencia, deseche el recipiente y reemplácelo por una unidad nueva. Regrese el isoflurano a la caja de seguridad.
- Retire el disco deslizante y límpielo con papel para lentes y solución para lentes. Almacenar adecuadamente para evitar arañazos para su reutilización.
- Retire el tubo de anestesia del soporte del inserto y desenrosque el inserto de la platina del microscopio.
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Representative Results
El ensamblaje adecuado del inserto de imágenes en vivo en un microscopio confocal invertido y la orientación apropiada de un ratón transgénico sobre el inserto se validan mediante la adquisición de pilas z de tejido auditivo vivo marcado con fluorescencia durante un curso de tiempo ≥1 h con evidencia mínima de deriva en los ejes x, y y z. Las imágenes deben capturarse a intervalos constantes (el tiempo del intervalo dependerá de la cuestión biológica, la intensidad de la señal de fluorescencia, etc.) para que la dinámica celular y la deriva de la imagen puedan rastrearse a lo largo del tiempo. A lo largo del curso de tiempo, el monitoreo de los planos z individuales para asegurarse de que permanezcan enfocados revela si el movimiento de los animales interfiere con la estabilidad de las imágenes. En la Figura 6 se muestra un ejemplo de planos z individuales que permanecen enfocados durante un curso de tiempo prolongado utilizando el inserto de imágenes en vivo.
Las imágenes de cuatro puntos de tiempo de 60 minutos que se muestran en la Figura 6A' se seleccionaron de una película de lapso de tiempo de 3 h de células epidérmicas mCherry+ en el oído de un ratón K14-H2B-mCherry macho adulto de 3 meses de edad (~30 g) capturado a intervalos de 2 minutos utilizando un paso z de 0,246 μm para lograr el muestreo de Nyquist a través de una profundidad z total de 24 μm (99 imágenes de pila z adquiridas por punto de tiempo).
Las imágenes de cuatro puntos de tiempo de 60 minutos que se muestran en la Figura 6D' se seleccionaron de una película de lapso de tiempo de 3 h de fibroblastos dérmicos GFP+ en el oído de una hembra adulta de 8 meses de edad Pdgfra:rtTA; pTRE:H2B-GFP ratón (~30 g; Figura 6B). Estos se capturaron a intervalos de 5 minutos utilizando un paso z de 2 μm para lograr un muestreo de Nyquist a través de una profundidad z total de 54 μm (28 imágenes de pila z adquiridas por punto de tiempo). Este ratón fue tratado con 2 mg de doxiciclina cada dos días durante 6 días (cuatro tratamientos, 8 mg en total) antes de la obtención de imágenes (Figura 6C).
Figura 1: Diseño personalizado del inserto de escenario impreso en 3D. (A,B) Diseño y dimensiones de un inserto personalizado impreso en 3D con una abertura de placa térmica (A), así como un soporte inferior de placa térmica (B), que se imprime por separado y luego se atornilla en el inserto (consulte el archivo complementario 1, el archivo complementario 2 y el archivo complementario 3 correspondientes). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: El nuevo inserto de platina agiliza la obtención de imágenes intravitales en microscopios confocales invertidos . (A) Inserto que se está construyendo con una impresora 3D. (B) Modelo de inserto simple sin dispositivo de calentamiento; El inserto de imágenes en vivo contiene cuatro sitios de tornillo (flechas azules) para la fijación de la platina del microscopio. La pinza metálica aplana e inmoviliza la oreja en un disco de plástico de 35 mm de ancho que contiene un cubreobjetos de vidrio de 20 mm de ancho. El inserto contiene dos opciones para la colocación de clips para las orejas para proporcionar flexibilidad con la orientación del mouse. La colocación asimétrica del orificio del objetivo permite que el ratón adulto quede plano. Los soportes laterales alinean e inmovilizan el cono nasal de isoflurano para facilitar la fijación del ratón. El modelo simplificado requiere la colocación de una pequeña almohadilla térmica (o fuente de calor alternativa) debajo del mouse para ayudar a regular la temperatura corporal. (C) Modelo de inserto avanzado con una placa calefactora incorporada. (D) La placa calefactora se instala deslizándola en una abertura ranurada del inserto. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Inserto de imagen intravital instalado en una platina de microscopio invertido. (A) Inserto montado en la platina de un microscopio confocal invertido de barrido láser. La proximidad del vaporizador de isoflurano y la cámara permite enhebrar el tubo del cono de la nariz a través del soporte de inserción. (B) El enchufe de la placa calefactora se extiende por debajo de la platina del microscopio para conectarlo al controlador. (C) El orificio de inserción se alinea con un objetivo de silicona 40x. (D) Se coloca un disco de plástico (35 mm de diámetro) que contiene un cubreobjetos de vidrio (20 mm de diámetro) sobre la abertura ranurada del inserto de la platina y se sella en su lugar con grasa de vacío. El disco de cubreobjetos se creó eliminando las paredes de una placa de cultivo celular con fondo de vidrio de 35 mm x 10 mm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Monitoreo de la temperatura corporal del animal usando un controlador de placa térmica. (A) Controlador de placa térmica, que se puede ajustar para estabilizar la temperatura corporal del ratón en los 36 °C óptimos durante toda la sesión de imágenes intravitales. (B) Se utiliza una sonda anal para controlar la temperatura corporal del ratón una vez que el ratón se coloca sobre la placa térmica. (C) Se puede usar una envoltura adhesiva de plástico para atrapar el calor y elevar aún más la temperatura corporal del ratón. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Posición del ratón en el inserto de imagen intravital. (A) El cuerpo del ratón se extiende a lo largo de la parte superior de la placa calefactora, con la oreja centrada en el cubreobjetos de vidrio e inmovilizada con un clip metálico para la oreja. El soporte posiciona el cono nasal de isoflurano para la fijación del ratón. (B) Región ampliada de (A) que muestra la inmovilización de la oreja del ratón con un clip metálico para la oreja en el cubreobjetos de vidrio y la fijación del cono nasal de isoflurano al ratón. (C) La cinta adhesiva se puede utilizar como un método alternativo de inmovilización de oídos en el cubreobjetos de vidrio. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6: El inserto personalizado facilita la obtención de imágenes intravitales estables a largo plazo de la epidermis y los fibroblastos de la oreja de ratón . (A) Un solo plano z capturado a partir de la realización de imágenes intravitales en el epitelio epidérmico del oído de un ratón transgénico K14-H2B-mCherry macho adulto de 3 meses de edad. El cuadro punteado indica la región ampliada que se muestra en (A'). Barra de escala = 50 μm. (A') Región ampliada de (A) que muestra imágenes cada hora durante un vídeo de 3 h. Barra de escala = 10 μm. (B) Esquema del sistema transgénico inducible por doxiciclina utilizado para promover el marcaje in vivo de GFP de núcleos dérmicos de fibroblastos. (C) Cronología de las inyecciones de doxiciclina. (D) Proyección de intensidad máxima (que representa una profundidad z total de 54 μm) de fibroblastos dérmicos capturados mediante la realización de imágenes intravitales en el oído de una hembra de 8 meses de edad inyectada con dox Pdgfra:rtTA; pTRE: Ratón transgénico H2B-GFP. El cuadro de puntos indica la región ampliada que se muestra en (D'). Barra de escala = 50 μm. (D') Región ampliada de (D) que muestra imágenes cada hora durante un vídeo de 3 h. Barra de escala = 10 μm. Estos cursos de tiempo demuestran la estabilidad de las imágenes intravitales a largo plazo utilizando el inserto personalizado impreso en 3D. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Archivo complementario 1: Archivo de diseño para el inserto impreso en 3D con una abertura de placa calefactora. Haga clic aquí para descargar este archivo.
Archivo complementario 2: Archivo de diseño para el soporte inferior de la placa térmica impresa en 3D. Haga clic aquí para descargar este archivo.
Archivo complementario 3: Archivo de diseño para el inserto impreso en 3D sin abertura de placa calefactora. Haga clic aquí para descargar este archivo.
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Discussion
En este estudio, presentamos una nueva herramienta que facilita la obtención de imágenes intravitales estables y a largo plazo de epitelios de piel de ratón intactos en microscopios confocales invertidos. Este invento está hecho de PLA, que es el material imprimible en 3D más común y económico; todos los costes internos de impresión 3D de este inserto ascienden a 5 < dólares. Las dos piezas de inserción separadas (Figura 1, Archivo Suplementario 1 y Lima Suplementaria 2) se pueden ensamblar fácilmente con tornillos de fijación (consulte la Tabla de materiales). Cabe destacar que los archivos .stl proporcionados también se pueden utilizar para pedir este inserto por medios comerciales. Una opción adicional es utilizar una máquina de control numérico por computadora (CNC) para generar el inserto de aluminio anodizado, aunque esto es significativamente más costoso.
Para garantizar la obtención de imágenes fiables y eficientes durante un período de tiempo con esta nueva herramienta, es fundamental dimensionar correctamente el inserto de imágenes en vivo de acuerdo con la etapa del microscopio del usuario. El Archivo Suplementario 1, el Archivo Suplementario 2 y el Archivo Suplementario 3 proporcionados se pueden adaptar para reflejar las dimensiones de plaquita apropiadas que sean compatibles con el microscopio de elección antes de la impresión 3D. Las dimensiones precisas de la plaquita con un disco de cubreobjetos inmovilizado minimizan la deriva posicional (x/y) y focal (z) a lo largo de cada sesión de imágenes. También es importante asegurarse de que la profundidad del inserto sea suficiente para pasar el puerto del enchufe de la placa calefactora por debajo de la platina.
Antes de la toma de imágenes, es esencial confirmar que el ratón está completamente anestesiado, que su temperatura corporal se mantiene estable a ~36 °C medida con la sonda del termómetro anal y que el oído está firmemente inmovilizado para evitar el movimiento debido a la respiración. Al usar la pinza metálica para asegurar la oreja al cubreobjetos, se debe evitar cortar la circulación sanguínea normal asegurándose de que la abrazadera de la oreja no esté atornillada con demasiada fuerza. También es crucial controlar y reponer el ungüento ocular en el ratón cuando sea necesario para mantener la humedad ocular durante largas sesiones de imágenes.
Si bien este diseño de inserto único proporciona un nuevo enfoque para la obtención de imágenes intravitales, tiene algunas limitaciones notables. Debido a la baja posición del inserto en la platina del microscopio, el movimiento de la platina en los planos X e Y debe ser muy limitado después de colocar el objetivo y sellar el disco de cubreobjetos en su lugar. Este movimiento limitado es fundamental para evitar daños al objetivo. Además, hay que tener en cuenta que el disco cubreobjetos de vidrio no está disponible actualmente en el mercado. Para recrear el disco de cubreobjetos utilizado en este estudio, puede ser necesaria la colaboración con un taller mecánico.
Si bien demostramos que este método basado en el confocal puede lograr imágenes estables a largo plazo en lo profundo del tejido intacto, debe tenerse en cuenta que los microscopios multifotónicos causan menos daño fotográfico y penetran a mayores profundidades en comparación con los instrumentos confocales19. Por lo tanto, la utilidad de esta herramienta se basa en la fuerza de la señal de fluorescencia en el modelo animal transgénico de elección, así como en la profundidad del tejido requerida para lograr los objetivos experimentales. Por lo tanto, recomendamos utilizar la menor potencia láser posible para minimizar el fotoblanqueo y lograr la resolución deseada. También es importante que la lente del objetivo utilizada con este inserto tenga un N.A. alto para una resolución óptima, así como una larga distancia de trabajo para que pueda alcanzar el disco de cubreobjetos. Cabe señalar que este enfoque no pretende reemplazar el método de imagen intravital basado en multifotones verticales bien validado descrito en Pineda et al. 6. En cambio, esta nueva herramienta está destinada a proporcionar una alternativa efectiva a los laboratorios que no tienen acceso a equipos multifotónicos, prefieren un sistema menos engorroso y/o poseen un microscopio invertido.
Nuestra nueva herramienta es notablemente personalizable según los requisitos y preferencias experimentales individualizados. Este inserto se puede usar con o sin una placa térmica, ya que algunas opciones alternativas incluyen la colocación de una almohadilla térmica delgada debajo del mouse, envolver un calentador de lentes de objetivo alrededor de su torso y / o atrapar el calor cubriendo el mouse con una envoltura adhesiva de plástico (Figura 4C). Además, se puede usar cinta adhesiva junto con o en lugar de la pinza para la oreja para proporcionar una inmovilización óptima del tejido (Figura 5C). La orientación del inserto de la platina es reversible, por lo que el usuario puede decidir si es óptimo orientar el orificio del objetivo en el lado derecho o izquierdo. Además, el inserto tiene opciones de colocación alternativas incorporadas para el clip auricular y el tubo de isoflurano para proporcionar la máxima flexibilidad en función de la orientación deseada del mouse (imágenes de la oreja derecha frente a la izquierda), la ubicación de la configuración de isoflurano y las configuraciones específicas del microscopio (Figura 2C). El inserto es fácilmente instalable y extraíble, con un diseño simplificado destinado a ser muy fácil de usar, de modo que las imágenes intravitales puedan ser accesibles incluso para microscopistas novatos. Además, el orificio objetivo localizado asimétricamente proporciona la capacidad de obtener imágenes de diversos modelos animales, así como de órganos de diferentes tamaños.
Pretendemos que esta invención mejore la aplicación de la microscopía intravital dentro de laboratorios individuales, así como núcleos de microcopia que contienen instrumentos confocales invertidos. Esta herramienta altamente accesible y personalizable proporcionará a los investigadores la libertad de visualizar la dinámica de las células vivas en diversos sistemas de órganos para revelar información biológica celular significativa.
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Disclosures
Los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.
Acknowledgments
Agradecemos a Valentina Greco por los ratones K14-mCherry-H2B. Agradecemos al Taller de Máquinas del Departamento de Física de la Universidad de Emory por generar los discos de cubreobjetos de vidrio. Este trabajo fue financiado por el Premio al Desarrollo Profesional #IK2 BX005370 del Departamento de Asuntos de Veteranos de EE. UU. BLRD Service to LS, los premios NIH RF1-AG079269 y R56-AG072473 a MJMR, y el premio I3 Emory SOM/GT Computational and Data Analysis Award a MJMR.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3D Printer | Qudi Tech | i-Fast | 3D prints using PLA material |
| 40x 1.25NA silicone objective lens | Nikon | ||
| AxR Laser Scanning Confocal Microscope | Nikon | ||
| Cotton Tipped Swab | VWR | 76337-046 | Cream/ointment application |
| Doxycycline hyclate | Sigma-Aldrich | D9891 | Induces GFP labeling of fibroblast nuclei in Pdgfra-rtTA; pTRE-H2B-GFP mice |
| Flathead Screwdriver (2.5 mm) | Affiix insert to microscope stage | ||
| Flathead Screws x 4 (#6-32) | Nikon | Screw insert into microscope stage | |
| Glass Bottom Culture Dish | chemglass Life Sciences | CLS-1811-002 | Modified by removing walls of dish for use as coverslip disk compatible with live insert; 35 mm wide disk contains 20 mm wide glass coverslip; dish walls were removed by machine shop |
| Heat Plate controller | Physitemp | TCAT-2LV | Animal Temperature Controller - Low Voltage; anal prob attachment for mouse body temperature monitoring |
| Hex Wrench (1.5 mm) | For M3 setscrew adjustments | ||
| Hex Wrench (2.5 mm) | Adjust tension on metal ear clip | ||
| Intravital Imaging Insert | |||
| Isoflurane | Med-Vet International | HPA030782-100uL | Mouse anesthesia |
| Labeling Tape (or Scotch Tape) | VWR | 10127-458 | Alternative to metal ear clip to immobilize ear to coverslip |
| Metal fastener | used as ear clip | ||
| Mouse: C57BL/6-Pdgfraem1(rtTA)Xsun/J | The Jackson Laboratory | RRID: IMSR_JAX:034459 | Fibrroblast-specific promoter driving doxycycline-inducible rtTA expression |
| Mouse: K14-H2BPAmCherry | Courtesy of Dr. Valentina Greco at Yale University | Labels epidermal epithelial cell nuclei with mCherry; referred to in text as "K14-H2B-mCherry" | |
| Mouse: pTRE-H2B-GFP: STOCK Tg(tetO-HIST1H2BJ/GFP)47Efu/J |
The Jackson Laboratory | RRID: IMSR_JAX:005104 | Labels fibroblast nuclei with GFP when combined with Pdgfra-rtTA and induced with doxycycline |
| Multipurpose Sealing Wrap | Glad | Enhance mouse warmth | |
| Optixcare | VWR | MSPP-078932779 | Eye lubricant |
| Set screws x 3 (M3; 6 mm) | Thorlabs | SS3M6 | Attachment for heatplate module |
| Silicone Immersion Oil | Applied to 40x silicone objective | ||
| Small Animal Heating Plate | Physitemp | HP-4M | Provides heat to animal |
| Somnoflow Low-Flow Electronic Vaporizer | Kent Scientific | SF-01 | Mouse anesthesia |
| Vacuum Grease | Flinn Scientific | AP1095 | Seals coverslip disk to insert |
| Veet | hair removal | ||
| Water circulating heat pad | Stryker Medical | TP700 | for mouse revival post-imaging |
References
- Babes, L., Yipp, B. G., Senger, D. L. Intravital microscopy of the metastatic pulmonary environment. Methods in Molecular Biology. , 383-396 (2023).
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