Summary
Protokollen presenterer et nytt verktøy for å forenkle intravital avbildning ved hjelp av invertert konfokalmikroskopi.
Abstract
Forståelse av normal og avvikende in vivo celleatferd er nødvendig for å utvikle kliniske intervensjoner for å hindre sykdomsinitiering og progresjon. Det er derfor viktig å optimalisere bildebehandlingsmetoder som letter observasjonen av celledynamikk in situ, hvor vevsstruktur og sammensetning forblir uforstyrret. Den epidermis er kroppens ytterste barriere, samt kilden til de mest utbredte menneskelige kreftformer, nemlig kutane hudkarsinomer. Tilgjengeligheten av hudvev gir en unik mulighet til å overvåke epitel- og dermale celleadferd hos intakte dyr ved bruk av ikke-invasiv intravital mikroskopi. Likevel har denne sofistikerte bildebehandlingsmetoden primært blitt oppnådd ved hjelp av stående multifotonmikroskoper, som representerer en betydelig barriere for oppføring for de fleste etterforskere. Denne studien presenterer en spesialdesignet, 3D-trykt mikroskopsceneinnsats egnet for bruk med inverterte konfokale mikroskoper, som strømlinjeformer den langsiktige intravitale avbildningen av ørehud i levende transgene mus. Vi tror at denne allsidige oppfinnelsen, som kan tilpasses for å passe til det inverterte mikroskopmerket og den valgte modellen og tilpasset bildet av flere organsystemer, vil vise seg å være uvurderlig for det større vitenskapelige forskningsmiljøet ved å forbedre tilgjengeligheten til intravital mikroskopi betydelig. Denne teknologiske utviklingen er avgjørende for å styrke vår forståelse av levende celledynamikk i normale og sykdomskontekster.
Introduction
Intravital mikroskopi er et kraftig verktøy som gjør det mulig å overvåke celleadferd i deres uforstyrrede in vivo-miljøer. Denne unike metoden har gitt viktig innsikt i den indre driften av komplekse pattedyrs organsystemer, inkludert lunge1, hjerne2, lever3, brystkjertel4, tarm5 og hud6. Videre har denne tilnærmingen avslørt celleadferdsendringer under tumorutvikling7, sårheling8,9, betennelse10 og andre forskjellige patologier in situ. I denne studien fokuserer vi på å forbedre tilgjengeligheten til intravital mikroskopi for å avbilde levende epitel- og stromaldynamikk i intakt musehud. Forståelse av celleadferd i pattedyrhud er av høy klinisk betydning på grunn av den bemerkelsesverdige regenerative og tumorigene kapasiteten til dette vevet.
Intravital avbildning hos mus har primært blitt utført ved bruk av stående multifotonmikroskop på grunn av deres evne til å gi høyoppløselig avbildning på vevsdybder >100 μm11,12. Ikke desto mindre mangler disse instrumentene arbeidshestens allsidighet og mer generelle tilgjengelighet av inverterte konfokale mikroskoper, som er mer brukervennlige og kostnadseffektive, gir muligheten til å avbilde dyrkede celler, krever ikke fullstendig mørke under bildeopptak, og er generelt tryggere, blant andre bemerkelsesverdige fordeler13,14. I denne studien presenterer vi et nytt verktøy som betydelig forbedrer intravital bildetilgjengelighet ved å tilpasse denne tilnærmingen for inverterte konfokale mikroskoper.
Her presenterer vi en 3D-trykt tilpasset sceneinnsatsdesign som inneholder flere viktige funksjoner for å lette stabil, langsiktig intravital avbildning av museørehud på et invertert konfokalmikroskop (figur 1, figur 2, figur 3, figur 4 og figur 5). Disse spesialiserte funksjonene inkluderer et forskjøvet objektivt hull som gjør at hele kroppen til en voksen mus kan ligge helt flatt under avbildning. Dette minimerer vibrasjonsforstyrrelsen av musens kroppsbevegelser på bildebehandling og eliminerer behovet for å administrere ketamin og xylazin for å dempe pusten, en praksis ofte kombinert med intravital avbildning6. I tillegg plasserer hjørnebraketter på innsatsen riktig en isofluran nesekegle for å justere seg med musens ansikt, en metalløreklemme immobiliserer museøret til en spesialbygd dekselskive, og en valgfri avtakbar biofeedback-varmeplate med lukket sløyfe ligger flush i innsatsen for å støtte musens kroppstemperatur under lange bildebehandlingsøkter. Den tilpassede coverslip-disken, som gir en flat overflate som er avgjørende for at musehodet og øret skal ligge flatt, ble generert i et maskinverksted ved å fjerne veggene i en generisk dekkslipholdig cellekulturfat. Bruken av en 40x silikonolje nedsenkingslinse (1,25 numerisk blenderåpning [N.A.], 0,3 mm arbeidsavstand) sammen med coverslip-disken og tilpasset sceneinnsats gir bilder med høy oppløsning >50 μm dypt inn i øredermis.
For å teste funksjonaliteten til denne nye inverterte mikroskopsceneinnsatsen, fanget vi z-stabler som spenner over alle epidermale epitellag over et 3-timers tidsforløp i øret til en levende transgen K14-H2B-mCherry15 voksen mus (epitelkjerner i denne muselinjen inneholder en rød fluorescerende etikett) (figur 6A-A'). Vi fanget også z-stabler som spenner over flere fibroblastlag i huden dermis over et 3 timers tidsforløp i øret til en levende transgen Pdgfra-rtTA16; pTRE-H2B-GFP17 voksen mus (fibroblastkjerner i denne muselinjen inneholder en grønn fluorescerende etikett etter doksysyklininduksjon) (figur 6B-D'). Våre høyoppløselige data viser konsistent stabilitet ved mangel på drift i x-, y- og z-planene, og viser dermed effektiviteten til dette nye intravitale bildeverktøyet for bruk på inverterte mikroskoper. Det er viktig at dimensjonene til denne 3D-printede sceneinnsatsen kan justeres, som beskrevet i tilleggsfil 1, tilleggsfil 2 og tilleggsfil 3, for å passe til ethvert omvendt mikroskop, og plasseringen av objektivåpningen kan flyttes til alternative steder i innsatsen for å bedre passe til avbildning av en bestemt vevs- og/eller dyremodell av interesse. Denne oppfinnelsen kan dermed gi individuelle laboratorier, eller etterforskere med konfokal tilgang til kjernefasiliteter, mulighet til å tilpasse dette verktøyet for deres unike intravitale bildebehov, og dermed strømlinjeforme evalueringen av ulike in vivo cellebiologi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denne undersøkelsen ble utført i samsvar med Emory University og Atlanta Veterans Affairs Medical Center retningslinjer for dyrepleie og bruk og er godkjent av Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC).
1. Installere live imaging innsatsen på det inverterte mikroskopstadiet
- Konstruer innsatsen ved hjelp av STL-filer (tilleggsfil 1, tilleggsfil 2 og tilleggsfil 3) som angir 3D-dimensjoner og utforming (se figur 1 og figur 2A), en 3D-skriver og polylaktinsyre (PLA).
- Plasser innsatsen (figur 2B,C) forsiktig i sporet i det store mikroskoptrinnet (figur 2C og figur 3A). Bruk skruer til å feste innsatsen via fire skruehull i hvert hjørne av innsatsen (figur 2B-C).
MERK: Innsatsen er toveis og kan roteres 180 ° avhengig av retningen til mikroskoptrinnet og anestesiapparatet. - Skyv varmeplaten inn i innsatspluggen med siden ned (figur 2D) slik at enheten legger seg oppå de nedre innsatssporene med pluggporten som passerer under trinnet (figur 3B).
- Juster den rillede sirkulære åpningen i innsatsen med et 40x nedsenkingsmål for silikonolje (figur 3C) og påfør silikonolje i midten av målet.
- Ved avbildning over lengre tidsperioder (>1 timer), påfør en sjenerøs klatt olje som vil vedvare ved dekselet/objektivgrensesnittet gjennom hele avbildningen. Ikke la olje spyle over kantene på objektivet.
- Bruk en sprøyte til å påføre en liten mengde vakuumfett langs den rillede sirkulære åpningen, og legg dekkskiven oppå for å forsegle den på innsatsen (figur 3D).
MERK: Dekkskiven lages ved å fjerne veggene i en 35 mm x 10 mm cellekulturskål med glassbunn (utført av et maskinverksted). - Løft 40x målet til oljen kysser bunnen av glassdekselet.
2. Isofluran konfigurasjon og museforberedelse
- Plasser de elektroniske fordamperkomponentene med lav strømning (anestesikammer, slange, fordamper, kullbeholder) slik at nesekjeglen og det vedlagte slangen når innsatsen (figur 3A).
FORSIKTIG: Isofluran er et inhalasjonsbedøvelsesmiddel og bør håndteres med forsiktighet for å unngå søl og minimere eksponering for mennesker. - Mål vekten av isofluran flasken før bruk og logg. Fest korken fra den elektroniske fordamperen til isofluran flasken.
- Koble strømledningen til den elektroniske fordamperen. Lukk de blå nesekjegleklemmene og åpne de hvite induksjonskammerklemmene for å tillate luftstrøm gjennom kammeret inn i kullbeholderen. Fjern den røde omgivelsesluftkappen fra venstre side av maskinen for å tillate luftstrøm.
- La systemet varmes opp i 5 minutter ved 200 ml/min (lav strømning) og 2 % isofluran.
MERK: Selv om innstillingen for nesekjegle er valgt, bør den blå nesekjeglelinjen forbli lukket, og den hvite induksjonskammerlinjen skal forbli åpen. - Når systemet er riktig balansert, rens linjene for å fjerne gjenværende isofluran fra kammeret.
- Plasser musen i induksjonskammeret og velg High Flow. Fullfør all museforberedelse (dvs. hårfjerning, aktuell legemiddellevering, øyesalveapplikasjon, etc.) før du legger dyrets kropp på toppen av innsatsen. Bekreft at musen er fullstendig bedøvet ved hjelp av tåklemmerefleksmetoden.
- Med benet forlenget, bruk en negl for å klemme tåen fast uten å forårsake fysisk skade. Hvis musen viser en positiv reaksjon på stimulansen (dvs. tilbaketrekning av ben, fotrykninger osv.), Fortsett å gi bedøvelse i kammeret til ingen reaksjon blir observert. Når den er riktig bedøvet, bør musens pustefrekvens sakte til ~ 55-65 pust per minutt18.
- Når musen er fullstendig bedøvet, velger du High Flow igjen for å stoppe leveringen av isofluran igjen. Rens kammeret før åpning og juster klipsene (blå: åpen; hvit: lukket) for å føre isofluran gjennom nesekjeglen. Velg Low Flow mens nesekjeglen er festet til musen for å fortsette leveringen med isofluran.
- Gjengeisofluranslange med den påfestede nesekjeglen gjennom hjørneslangebraketten på innsatsen (figur 3A og figur 5).
3. Museplassering på innsatsen for intravital avbildning
- Koble varmeplaten til kontrolleren (som inneholder en påmontert analsonde), slå på og la platen nå 36 °C (figur 4A).
- Fjern den bedøvede musen fra induksjonskammeret og legg deg over varmeplaten (figur 4B og figur 5A). Utfør overføringen fra kammeret til innsettingen raskt for å minimere tiden musen er aktiv uten inhalasjonsbedøvelse.
- Fest nesekjeglen på musen (figur 4B, C og figur 5). Bruk om nødvendig tape for ytterligere å sikre vinkelen og plasseringen av nesekeglen.
- Sett inn analsonden og juster temperaturen på kontrolleren til musens kroppstemperatur er stabil ved ~36 °C (figur 4A,B). Etter at musen er riktig plassert, bruk plastplastfolie for å fange varme, om nødvendig, for ytterligere å støtte riktig kroppstemperatur (figur 4C).
- Plasser musen slik at hodet er på linje med dekkskiven, og immobiliser øret på midten av glassdekselet ved hjelp av en øreklemme av metall (figur 5A,B) eller tape (figur 5C).
MERK: Trykket på metalløreklemmen på øret kan justeres ved å løsne skruen som fester klipsen til innsatsen. En metallfjær kan legges til for økt klipsstrammingsfleksibilitet.- For å endre øreklemmeplasseringen, skru løs bolten med en 2,5 mm unbrakonøkkel og overfør til sekundærstedet (figur 2B,C). Når du monterer øreklemmen igjen, plasserer du klipsen mot innsatsen, etterfulgt av skiven på toppen. Bruk en bolt til å feste klipsen sikkert med liten kraft for å dreie klipsen.
- Juster den objektive z-posisjoneringen til cellene er innenfor fokusstedet (figur 6A, D). Angi parameterne z-stack og time-lapse i henhold til eksperimentelle mål, og start bildeopptak.
MERK: Hvis riktig oppsett oppnås, kan museøret avbildes i minst 3 påfølgende timer (figur 6A', D').- Når grensene for z-stakken er angitt, justerer du lasereffekten og forsterkningen for å sikre at ingen z-plan er overmettet for å minimere fotobleking. Bestem intervallparametrene ved hjelp av den totale tykkelsen på z-stakken, trinntall (Nyquist-utvalg anbefales) og tidsintervaller.
- Bestem bildebehandlingsparametrene (tidsintervaller, total bildetid, etc.) ved hjelp av flere faktorer, inkludert dyrs levedyktighet under anestesi, laserindusert fotobleking / fototoksisitet, og målet med levende bildebehandling (dvs. celledelingsdynamikk, celle-celle-interaksjoner, etc.).
4. Avslutning av bildebehandling
- Slå på den vannsirkulerende varmeputen og sett den på Kontinuerlig syklus og 35 °C i minst 30 minutter før bildeopptaket avsluttes.
- Når avbildningen er fullført, velger du Low Flow på den elektroniske fordamperen for å stoppe leveringen av isofluran og flytte musen til en varmepute til den er ambulerende.
- Når den er våken, flytt musen tilbake til overføringsbeholderen mens du fortsetter å vedlikeholde på en varmepute til den er helt ambulerende. Overvåk musen konsekvent mens den er på varmeputen til den reagerer.
- På den elektroniske fordamperen klikker du på Velg meny > Bedøvelseskontroll > Tom. Ta isofluran flasken ut av systemet og sett produsentens kork tilbake på flasken.
- Mål vekten av isofluran flaske og kullbeholder og skriv inn vekter i loggen. Når kullbeholderen veier 50 g over grunnlinjemålingen, kast beholderen og erstatt den med en ny enhet. Sett isofluran tilbake i låseboksen.
- Fjern dekselskiven og tørk av med linsepapir og linseoppløsning. Oppbevares riktig for å unngå riper for gjenbruk.
- Fjern anestesirøret fra innsatsbraketten og skru av innsatsen fra mikroskoptrinnet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Riktig montering av live-bildeinnsatsen på et invertert konfokalmikroskop og passende orientering av en transgen mus på toppen av innsatsen valideres ved å anskaffe z-stabler av fluorescerende merket, levende ørevev over et tidsforløp ≥1 time med minimal bevis på drift i x-, y- og z-aksene. Bilder bør tas med jevne intervaller (intervalltiden vil avhenge av det biologiske spørsmålet, styrken til fluorescenssignalet, etc.) slik at celledynamikk og bildedrift kan spores over tid. Gjennom hele tidsforløpet avslører overvåking av individuelle z-plan for å sikre at de forblir i fokus, om dyrs bevegelse forstyrrer bildestabiliteten. Et eksempel på enkle z-plan som forblir i fokus over et lengre tidsforløp ved hjelp av live imaging insert, er vist i figur 6.
Bilder fra fire 60 minutters tidsperioder vist i figur 6A' ble valgt fra en 3-timers time-lapse-film av mCherry+ epidermale celler i øret til en 3 måneder gammel voksen mannlig K14-H2B-mCherry-mus (~30 g) tatt med 2 minutters mellomrom med et z-trinn på 0,246 μm for å oppnå Nyquist-sampling over en total z-dybde på 24 μm (99 z-stack-bilder tatt per tidspunkt).
Bilder fra fire 60 min tidsperioder vist i figur 6D 'ble valgt fra en 3 timers time-lapse-film av GFP + dermale fibroblaster i øret til en 8 måneder gammel voksen kvinnelig Pdgfra: rtTA; pTRE: H2B-GFP mus (~ 30 g; Figur 6B). Disse ble tatt med 5 minutters mellomrom med et z-trinn på 2 μm for å oppnå Nyquist-sampling over en total z-dybde på 54 μm (28 z-stack-bilder tatt per tidspunkt). Denne musen ble behandlet med 2 mg doksysyklin annenhver dag i 6 dager (fire behandlinger, 8 mg totalt) før avbildning (figur 6C).
Figur 1: Tilpasset 3D-printet sceneinnsatsdesign. (A,B) Design og dimensjoner på en tilpasset, 3D-printet innsats med varmeplateåpning (A), samt en bunnholder for varmeplaten (B), som skrives ut separat og deretter skrus inn i innsatsen (se tilsvarende tilleggsfil 1, tilleggsfil 2 og tilleggsfil 3). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Ny sceneinnsats effektiviserer intravital avbildning på inverterte konfokale mikroskoper . (A) Sett inn som konstrueres ved hjelp av en 3D-skriver. (B) Enkel innsatsmodell uten varmeenhet; Live Imaging Insert inneholder fire skrueplasser (blå piler) for mikroskoptrinnfeste. Øreklemmen i metall flater ut og immobiliserer øret på en 35 mm bred plastskive som inneholder et 20 mm bredt glassdeksel. Innsatsen inneholder to alternativer for plassering av øreklips for å gi fleksibilitet med museretning. Asymmetrisk plassering av objektivhullet gjør at den voksne musen kan ligge flatt. Sidebraketter justerer og immobiliserer isoflurannesekjeglen for å lette musefesting. Den forenklede modellen krever plassering av en liten varmepute (eller alternativ varmekilde) under musen for å regulere kroppstemperaturen. (C) Avansert innsatsmodell med innebygd varmeplate. (D) Varmeplaten installeres ved å skyve inn i en riflet åpning av innsatsen. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Intravital avbildningsinnsats installert på et invertert mikroskopstadium . (A) Sett inn montert på scenen av et laserskanning invertert konfokalmikroskop. Nærheten til isofluran fordamper og kammer tillater tring av nesekeglerøret gjennom innsatsbraketten. (B) Varmeplatepluggen strekker seg under mikroskoptrinnet for å koble til kontrolleren. (C) Innsatshullet justeres med et 40x silikonmål. (D) En plastskive (35 mm diameter) som inneholder et glassdeksel (20 mm diameter) legges på toppen av den rillede åpningen på sceneinnsatsen og forsegles på plass med vakuumfett. Coverslip-disken ble opprettet ved å fjerne veggene i en 35 mm x 10 mm glassbunncellekulturfat. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Overvåking av dyrs kroppstemperatur ved hjelp av en varmeplatekontroller . (A) Varmeplatekontroller, som kan justeres for å stabilisere musens kroppstemperatur ved optimal 36 °C gjennom hele den intravitale bildebehandlingen. (B) En analsonde brukes til å overvåke musens kroppstemperatur når musen legges på toppen av varmeplaten. (C) Plastplastfolie kan brukes til å fange varme for å heve musens kroppstemperatur ytterligere. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Museposisjonering på intravital bildeinnsats. (A) Musekroppen er spredt langs toppen av varmeplaten, med øret sentrert på glassdekselet og immobilisert med en øreklemme av metall. Braketten plasserer isofluran nesekjegle for musefeste. (B) Innzoomet område av (A) som viser museøreimmobilisering med en øreklemme av metall på glassdekselet og isofluran nesekjeglefeste til musen. (C) Tape kan brukes som en alternativ metode for øreimmobilisering på glassdekselet. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 6: Tilpasset innsats muliggjør stabil langsiktig intravital avbildning av øreepidermis og fibroblaster fra mus . (A) Et enkelt z-plan fanget fra å utføre intravital avbildning på øreepidermal epitel av en 3 måneder gammel voksen mannlig K14-H2B-mCherry transgen mus. Den stiplede boksen angir det innzoomede området som vises i (A'). Skalalinje = 50 μm. (A') Innzoomet område for (A) som viser bilder hver time over en film på 3 timer. Skalastang = 10 μm. (B) Skjematisk fremstilling av det doksysyklininduserbare transgene systemet som brukes til å fremme in vivo GFP-merking av dermal fibroblastkjerner. (C) Tidslinje for doksysyklininjeksjoner. (D) Maksimal intensitetsprojeksjon (som representerer en 54 μm total z-dybde) av dermale fibroblaster fanget ved å utføre intravital avbildning på øret til en dox-injisert 8 måneder gammel kvinnelig Pdgfra: rtTA; pTRE: H2B-GFP transgen mus. Den stiplede boksen angir det innzoomede området som vises i (D'). Skalalinje = 50 μm. (D') Innzoomet område av (D) som viser bilder hver time over en film på 3 timer. Skala bar = 10 μm. Disse tidskursene demonstrerer stabiliteten til langsiktig intravital avbildning ved hjelp av 3D-trykt tilpasset innsats. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Tilleggsfil 1: Designfil for det 3D-printede innlegget med varmeplateåpning. Klikk her for å laste ned denne filen.
Tilleggsfil 2: Designfil for den 3D-printede varmeplatebunnholderen. Klikk her for å laste ned denne filen.
Tilleggsfil 3: Designfil for det 3D-printede innlegget uten varmeplateåpning. Klikk her for å laste ned denne filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I denne studien presenterer vi et nytt verktøy som muliggjør stabil, langsiktig intravital avbildning av intakt musehudepitel på inverterte konfokale mikroskoper. Denne oppfinnelsen er laget av PLA, som er det vanligste og billigste 3D-utskrivbare materialet; alle interne 3D-utskriftskostnader for denne innsatsen utgjør < $ 5. De to separate innsatsstykkene (figur 1, tilleggsfil 1 og tilleggsfil 2) kan enkelt settes sammen ved hjelp av settskruer (se materialfortegnelse). Spesielt kan de medfølgende .stl-filene også brukes til å bestille dette innlegget kommersielt. Et ekstra alternativ er å bruke en datamaskin numerisk kontroll (CNC) maskin for å generere innsatsen ut av anodisert aluminium, selv om dette er betydelig dyrere.
For å sikre pålitelig og effektiv avbildning over en tidsperiode ved hjelp av dette nye verktøyet, er det avgjørende å dimensjonere live-bildeinnsatsen riktig i henhold til brukerens mikroskoptrinn. Den medfølgende tilleggsfil 1, tilleggsfil 2 og tilleggsfil 3 kan tilpasses for å gjenspeile passende innsatsdimensjoner som er kompatible med mikroskopet du velger før 3D-utskrift. Nøyaktige innsatsdimensjoner med en immobilisert dekkskive minimerer posisjonell (x/y) og fokal (z) drift gjennom hver bildeøkt. Det er også viktig å sikre at innsatsdybden er tilstrekkelig til å passere varmeplatepluggporten under scenen.
Før avbildning er det viktig å bekrefte at musen er fullt bedøvet, kroppstemperaturen forblir stabil ved ~ 36 ° C målt med analtermometersonden, og øret er fast immobilisert for å unngå bevegelse på grunn av pust. Når man bruker øreklemmen i metall for å feste øret til dekselet, bør man forhindre å kutte normal blodsirkulasjon ved å sørge for at øreklemmen ikke skrus for hardt ned. Det er også viktig å overvåke og etterfylle øyesalve på musen når det er nødvendig for å opprettholde okulær fuktighet under lange bildebehandlingsøkter.
Selv om denne unike innsatsdesignen gir en ny tilnærming til intravital avbildning, har den noen bemerkelsesverdige begrensninger. På grunn av innsatsens lave posisjonering i mikroskoptrinnet, bør scenebevegelsen i x- og y-planet være svært begrenset etter at objektivet er plassert og dekkskiven er forseglet på plass. Denne begrensede bevegelsen er avgjørende for å unngå skade på målet. Videre bør det bemerkes at glassdekselskiven for øyeblikket ikke er kommersielt tilgjengelig. For å gjenskape coverslip-disketten som ble brukt i denne studien, kan det være nødvendig med et maskinverksted.
Mens vi demonstrerer at denne konfokalbaserte metoden kan oppnå stabil langsiktig avbildning dypt inn i intakt vev, bør det bemerkes at multifotonmikroskoper forårsaker mindre fotoskade og trenger inn i større dybder sammenlignet med konfokale instrumenter19. Derfor er bruken av dette verktøyet avhengig av styrken av fluorescenssignalet i den transgene dyremodellen som er valgt, samt vevsdybden som kreves for å oppnå de eksperimentelle målene. Vi anbefaler derfor å bruke lavest mulig lasereffekt for å minimere fotobleking samtidig som du oppnår ønsket oppløsning. Det er også viktig at objektivlinsen som brukes med denne innsatsen har en høy N.A. for optimal oppløsning, samt en lang arbeidsavstand slik at den kan nå dekselskiven. Det skal bemerkes at denne tilnærmingen ikke er ment å erstatte den godt validerte oppreist multifotonbaserte intravitale bildebehandlingsmetoden beskrevet i Pineda et al. 6. I stedet er dette nye verktøyet ment å gi et effektivt alternativ til laboratorier som ikke har tilgang til multifoton utstyr, foretrekker et mindre tungvint system, og / eller eier et omvendt mikroskop.
Vårt nye verktøy er bemerkelsesverdig tilpassbart til individuelle eksperimentelle krav og preferanser. Denne innsatsen kan brukes med eller uten varmeplate, da noen alternative alternativer inkluderer plassering av en tynn varmepute under musen, innpakning av en objektivlinsevarmer rundt overkroppen og / eller fangstvarme ved å dekke musen med plastfolie (figur 4C). Videre kan tape brukes sammen med eller i stedet for øreklemmen for å gi optimal vevsimmobilisering (figur 5C). Retningen til sceneinnsatsen er reversibel, slik at brukeren kan bestemme om det er optimalt å orientere det objektive hullet på høyre eller venstre side. Videre har innsatsen innebygde alternative plasseringsalternativer for øreklemmen og isofluranslangen for å gi maksimal fleksibilitet basert på ønsket museretning (avbildning av høyre vs. venstre øre), plassering av isofluran oppsett og spesifikke mikroskopkonfigurasjoner (figur 2C). Innsatsen er enkel å installere og fjerne, med en forenklet design som er ment å være svært brukervennlig, slik at intravital bildebehandling kan gjøres tilgjengelig for selv nybegynnere mikroskopister. I tillegg gir det asymmetrisk lokaliserte objektive hullet kapasitet til å avbilde ulike dyremodeller samt organer av varierende størrelse.
Vi har til hensikt at denne oppfinnelsen skal forbedre anvendelsen av intravital mikroskopi i individuelle laboratorier, samt mikrokopikjerner som inneholder inverterte konfokale instrumenter. Dette svært tilgjengelige og tilpassbare verktøyet vil gi etterforskere friheten til å visualisere levende celledynamikk på tvers av ulike organsystemer for å avsløre betydelig cellebiologisk innsikt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter å opplyse.
Acknowledgments
Vi takker Valentina Greco for K14-mCherry-H2B-musene. Vi er takknemlige for Emory University Physics Department Machine Shop for å generere glassdekselskivene. Dette arbeidet ble finansiert av Career Development Award #IK2 BX005370 fra US Department of Veterans Affairs BLRD Service til LS, NIH Awards RF1-AG079269 og R56-AG072473 til MJMR, og I3 Emory SOM / GT Computational and Data Analysis Award til MJMR.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3D Printer | Qudi Tech | i-Fast | 3D prints using PLA material |
| 40x 1.25NA silicone objective lens | Nikon | ||
| AxR Laser Scanning Confocal Microscope | Nikon | ||
| Cotton Tipped Swab | VWR | 76337-046 | Cream/ointment application |
| Doxycycline hyclate | Sigma-Aldrich | D9891 | Induces GFP labeling of fibroblast nuclei in Pdgfra-rtTA; pTRE-H2B-GFP mice |
| Flathead Screwdriver (2.5 mm) | Affiix insert to microscope stage | ||
| Flathead Screws x 4 (#6-32) | Nikon | Screw insert into microscope stage | |
| Glass Bottom Culture Dish | chemglass Life Sciences | CLS-1811-002 | Modified by removing walls of dish for use as coverslip disk compatible with live insert; 35 mm wide disk contains 20 mm wide glass coverslip; dish walls were removed by machine shop |
| Heat Plate controller | Physitemp | TCAT-2LV | Animal Temperature Controller - Low Voltage; anal prob attachment for mouse body temperature monitoring |
| Hex Wrench (1.5 mm) | For M3 setscrew adjustments | ||
| Hex Wrench (2.5 mm) | Adjust tension on metal ear clip | ||
| Intravital Imaging Insert | |||
| Isoflurane | Med-Vet International | HPA030782-100uL | Mouse anesthesia |
| Labeling Tape (or Scotch Tape) | VWR | 10127-458 | Alternative to metal ear clip to immobilize ear to coverslip |
| Metal fastener | used as ear clip | ||
| Mouse: C57BL/6-Pdgfraem1(rtTA)Xsun/J | The Jackson Laboratory | RRID: IMSR_JAX:034459 | Fibrroblast-specific promoter driving doxycycline-inducible rtTA expression |
| Mouse: K14-H2BPAmCherry | Courtesy of Dr. Valentina Greco at Yale University | Labels epidermal epithelial cell nuclei with mCherry; referred to in text as "K14-H2B-mCherry" | |
| Mouse: pTRE-H2B-GFP: STOCK Tg(tetO-HIST1H2BJ/GFP)47Efu/J |
The Jackson Laboratory | RRID: IMSR_JAX:005104 | Labels fibroblast nuclei with GFP when combined with Pdgfra-rtTA and induced with doxycycline |
| Multipurpose Sealing Wrap | Glad | Enhance mouse warmth | |
| Optixcare | VWR | MSPP-078932779 | Eye lubricant |
| Set screws x 3 (M3; 6 mm) | Thorlabs | SS3M6 | Attachment for heatplate module |
| Silicone Immersion Oil | Applied to 40x silicone objective | ||
| Small Animal Heating Plate | Physitemp | HP-4M | Provides heat to animal |
| Somnoflow Low-Flow Electronic Vaporizer | Kent Scientific | SF-01 | Mouse anesthesia |
| Vacuum Grease | Flinn Scientific | AP1095 | Seals coverslip disk to insert |
| Veet | hair removal | ||
| Water circulating heat pad | Stryker Medical | TP700 | for mouse revival post-imaging |
References
- Babes, L., Yipp, B. G., Senger, D. L. Intravital microscopy of the metastatic pulmonary environment. Methods in Molecular Biology. , 383-396 (2023).
- Nal Chen,, et al. Neutrophils promote glioblastoma tumor cell migration after biopsy. Cells. 11 (14), 2196 (2022).
- Courson, J. A., Langlois, K. W., Lam, F. W. Intravital microscopy to study platelet-leukocyte-endothelial interactions in the mouse liver. Journal of Visualized Experiments. 188 (188), (2022).
- Rios, A. C., van Rheenen, J., Scheele, C. L. G. J.
- Fischer, M., Edelblum, K. L. Intravital microscopy to visualize murine small intestinal intraepithelial lymphocyte migration. Current Protocols. 2 (8), (2022).
- Pineda, C. M., et al. Intravital imaging of hair follicle regeneration in the mouse. Nature Protocols. 10 (7), 1116-1130 (2015).
- Entenberg, D., Oktay, M. H., Condeelis, J. S. Intravital imaging to study cancer progression and metastasis. Nature Reviews. Cancer. 23 (1), 25-42 (2023).
- Turk, M., Biernaskie, J., Mahoney, D. J., Jenne, C. N. Intravital microscopy techniques to image wound healing in mouse skin. Methods in Molecular Biology. , 165-180 (2022).
- Pal Arndt,, et al. A quantitative 3D intravital look at the juxtaglomerular renin-cell-niche reveals an individual intra/extraglomerular feedback system. Frontiers in Physiology. 13, 980787 (2022).
- Oal Yam, A., et al. Neutrophil conversion to a tumor-killing phenotype underpins effective microbial therapy. Cancer Research. 83 (8), 1315-1328 (2023).
- Huang, S., Rompolas, P. Two-photon microscopy for intracutaneous imaging of stem cell activity in mice. Experimental Dermatology. 26 (5), 379-383 (2017).
- Durr, N. J., Weisspfennig, C. T., Holfeld, B. A., Ben-Yakar, A. Maximum imaging depth of two-photon autofluorescence microscopy in epithelial tissues. Journal of Biomedical Optics. 16 (2), 026008 (2011).
- Tauer, U. Advantages and risks of multiphoton microscopy in physiology. Experimental Physiology. 87 (6), 709-714 (2002).
- Yoshitake, T., et al. Direct comparison between confocal and multiphoton microscopy for rapid histopathological evaluation of unfixed human breast tissue. Journal of Biomedical Optics. 21 (12), 126021 (2016).
- Mesa, K., Rompolas, P., Zito, G., et al. Niche-induced cell death and epithelial phagocytosis regulate hair follicle stem cell pool. Nature. 522, 94-97 (2015).
- Ral Li,, et al. Pdgfra marks a cellular lineage with distinct contributions to myofibroblasts in lung maturation and injury response. eLife. 7, (2018).
- Tal Tumbar,, et al. Defining the epithelial stem cell niche in skin. Science. 303 (5656), 359-363 (2004).
- Ewald, A. J., Werb, Z., Egeblad, M. Monitoring of vital signs for long-term survival of mice under anesthesia. Cold Spring Harbor Protocols. 2 (2), 5563 (2011).
- Sanderson, J.
