Strømlinet intravital billeddannelsesmetode til langsigtet overvågning af epitelvævsdynamik på et inverteret konfokalmikroskop

Summary

Protokollen præsenterer et nyt værktøj til at forenkle intravital billeddannelse ved hjælp af omvendt konfokal mikroskopi.

Abstract

Forståelse af normal og afvigende in vivo-celleadfærd er nødvendig for at udvikle kliniske interventioner for at modvirke sygdomsinitiering og progression. Det er derfor afgørende at optimere billeddannelsesmetoder, der letter observationen af celledynamik in situ, hvor vævsstruktur og sammensætning forbliver uforstyrret. Den epidermis er kroppens yderste barriere, samt kilden til de mest udbredte menneskelige kræftformer, nemlig kutane hud carcinomer. Tilgængeligheden af hudvæv giver en unik mulighed for at overvåge epitel- og dermalcelleadfærd hos intakte dyr ved hjælp af ikke-invasiv intravital mikroskopi. Ikke desto mindre er denne sofistikerede billeddannelsesmetode primært opnået ved hjælp af opretstående multifotonmikroskoper, som udgør en betydelig adgangsbarriere for de fleste efterforskere. Denne undersøgelse præsenterer en specialdesignet, 3D-printet mikroskopindsats, der er egnet til brug med inverterede konfokale mikroskoper, hvilket strømliner den langsigtede intravitale billeddannelse af ørehud hos levende transgene mus. Vi mener, at denne alsidige opfindelse, som kan tilpasses til at passe til det omvendte mikroskopmærke og den valgte model og tilpasses til at afbilde yderligere organsystemer, vil vise sig uvurderlig for det større videnskabelige forskningssamfund ved væsentligt at forbedre tilgængeligheden af intravital mikroskopi. Dette teknologiske fremskridt er afgørende for at styrke vores forståelse af levende celledynamik i normale og sygdomssammenhænge.

Introduction

Intravital mikroskopi er et kraftfuldt værktøj, der tillader overvågning af celleadfærd i deres uforstyrrede in vivo-miljøer. Denne unikke metode har givet vigtig indsigt i de indre funktioner i komplekse pattedyrs organsystemer, herunder lunge¹, hjerne², lever³, brystkirtel⁴, tarm⁵ og hud⁶. Desuden har denne tilgang afsløret celleadfærdsændringer under tumorudvikling⁷, sårheling^8,9, betændelse¹⁰ og andre forskellige patologier in situ. I denne undersøgelse fokuserer vi på at forbedre tilgængeligheden af intravital mikroskopi til billede af levende epitel- og stromaldynamik i intakt musehud. Forståelse af celleadfærd i pattedyrs hud er af høj klinisk betydning på grund af den bemærkelsesværdige regenerative og tumorigene kapacitet af dette væv.

Intravital billeddannelse i mus er primært blevet udført ved hjælp af opretstående multifotonmikroskoper på grund af deres evne til at give billeddannelse i høj opløsning ved vævsdybder >100 μm^11,12. Ikke desto mindre mangler disse instrumenter arbejdshestens alsidighed og mere generelle tilgængelighed af inverterede konfokale mikroskoper, som er mere brugervenlige og omkostningseffektive, giver mulighed for at afbilde dyrkede celler, ikke kræver fuldstændig mørke under billedoptagelse og generelt er sikrere, blandt andre bemærkelsesværdige fordele^13,14. I denne undersøgelse præsenterer vi et nyt værktøj, der signifikant forbedrer intravital billeddannelse tilgængelighed ved at tilpasse denne tilgang til inverterede konfokale mikroskoper.

Her præsenterer vi et 3D-printet brugerdefineret sceneindsatsdesign, der indeholder flere nøglefunktioner for at lette stabil, langsigtet intravital billeddannelse af museørehud på et omvendt konfokalmikroskop (figur 1, figur 2, figur 3, figur 4 og figur 5). Disse specialiserede funktioner omfatter et forskudt objektivt hul, der gør det muligt for hele kroppen af en voksen mus at ligge helt fladt under billeddannelse. Dette minimerer vibrationsinterferensen af musekroppens bevægelser ved billeddannelse og eliminerer behovet for at administrere ketamin og xylazin for at dæmpe vejrtrækningen, en praksis, der ofte kombineres med intravital billeddannelse⁶. Derudover placerer hjørnebeslag på indsatsen korrekt en isofluran næsekegle for at justere med musens overflade, en metaløreclips immobiliserer museøret til en specialbygget coverslip-disk, og en valgfri aftagelig lukket sløjfe biofeedback-varmeplade ligger flush inde i indsatsen for at understøtte musens kropstemperatur under lange billedbehandlingssessioner. Den brugerdefinerede coverslip-disk, som giver en flad overflade, der er afgørende for, at musens hoved og øre kan ligge fladt, blev genereret i et maskinværksted ved at fjerne væggene i en generisk coverslip-holdig cellekulturskål. Brugen af et 40x silikoneolienedsænkningsobjektiv (1,25 numerisk blænde [NA], 0,3 mm arbejdsafstand) sammen med coverslip-disken og brugerdefineret sceneindsats giver billeder i høj opløsning >50 μm dybt ind i øredermis.

For at teste funktionaliteten af denne nye inverterede mikroskopindsats, fangede vi z-stakke, der spænder over alle epidermale epitellag over et 3 timers tidsforløb i øret på en levende transgen K14-H2B-mCherry¹⁵ voksen mus (epitelkerner i denne muselinje indeholder en rød fluorescerende etiket) (figur 6A-A '). Vi fangede også z-stakke, der spænder over flere fibroblastlag i huddermis over et 3 timers tidsforløb i øret på en levende transgen Pdgfra-rtTA¹⁶; pTRE-H2B-GFP¹⁷ voksen mus (fibroblastkerner i denne muselinje indeholder en grøn fluorescerende etiket efter doxycyclininduktion) (figur 6B-D'). Vores data i høj opløsning viser konstant stabilitet ved manglende drift i x-, y- og z-planerne, hvilket beviser effektiviteten af dette nye intravitale billeddannelsesværktøj til brug på inverterede mikroskoper. Det er vigtigt, at dimensionerne på denne 3D-printede trinindsats kan justeres, som beskrevet i Supplementary File 1, Supplementary File 2 og Supplementary File 3, så de passer til ethvert omvendt mikroskop, og placeringen af objektivåbningen kan flyttes til alternative steder i indsatsen for bedre at passe til billeddannelse af et bestemt væv og / eller dyremodel af interesse. Denne opfindelse kan således give individuelle laboratorier eller efterforskere med kernefacilitetskonfokal adgang mulighed for at tilpasse dette værktøj til deres unikke intravitale billeddannelsesbehov og derved strømline evalueringen af forskelligartet in vivo-cellebiologi.

Protocol

Denne forskning blev udført i overensstemmelse med Emory University og Atlanta Veterans Affairs Medical Center retningslinjer for dyrepleje og brug og er blevet godkendt af Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC).

1. Installation af live imaging insertet på det inverterede mikroskop trin

1. Konstruer indsatsen ved hjælp af .stl-filer (supplerende fil 1, supplerende fil 2 og supplerende fil 3) med angivelse af 3D-dimensioner og design (se figur 1 og figur 2A), en 3D-printer og polymælkesyre (PLA).
2. Placer forsigtigt skæret (figur 2B,C) i rillen i det store mikroskoptrin (figur 2C og figur 3A). Brug skruer til at fastgøre skæret via fire skruehuller i hvert hjørne af skæret (figur 2B-C).
   BEMÆRK: Indsatsen er tovejs og kan drejes 180 ° afhængigt af mikroskopets retning og anæstesiapparatet.
3. Skub varmepladen ind i indsatsproppen med siden nedad (figur 2D), så enheden ligger oven på de nederste skærriller med stikporten under trinnet (figur 3B).
4. Juster den rillede cirkulære åbning i indsatsen med et 40x silikoneolienedsænkningsmål (figur 3C), og påfør silikoneolie på midten af målet.
   1. Hvis der tages billeder over længere tidsperioder (>1 time), skal du anvende en generøs klat olie, der forbliver ved dæksel/objektivgrænsefladen under hele billeddannelsen. Lad ikke olie spildes over linsens kanter.
5. Brug en sprøjte til at påføre en lille mængde vakuumfedt langs den rillede cirkulære åbning, og læg dækselskiven oven for at forsegle på indsatsen (figur 3D).
   BEMÆRK: Coverslip-skiven oprettes ved at fjerne væggene i en 35 mm x 10 mm glasbundet cellekulturskål (udført af et maskinværksted).
6. Hæv 40x-målet, indtil olien kysser bunden af glasdækslet.

2. Isoflurankonfiguration og klargøring af mus

1. Placer de elektroniske fordamperkomponenter med lavt flow (anæstesikammer, slange, fordamper, kulbeholder), så næsekeglen og den vedhæftede slange kan nå indsatsen (figur 3A).
   FORSIGTIG: Isofluran er et inhalationsbedøvelsesmiddel og skal håndteres med forsigtighed for at undgå spild og minimere menneskelig eksponering.
2. Isofluranflaskens vægt skal måles før brug og log. Fastgør hætten fra den elektroniske fordamper til isofluranflasken.
3. Tilslut netledningen til den elektroniske fordamper. Luk de blå næsekegleklemmer, og åbn de hvide induktionskammerclips for at lade luft strømme gennem kammeret ind i kulbeholderen. Fjern det røde luftdæksel fra venstre side af maskinen for at tillade luftstrøm.
4. Lad systemet varme op i 5 minutter ved 200 ml/min (lavt flow) og 2% isofluran.
   BEMÆRK: Selvom indstillingen for næsekeglen er valgt, skal den blå næsekeglelinje forblive lukket, og den hvide induktionskammerlinje skal forblive åben.
5. Når systemet er korrekt afbalanceret, renses linjerne for at fjerne resterende isofluran fra kammeret.
6. Placer musen i induktionskammeret, og vælg High Flow. Gennemfør al museforberedelse (dvs. hårfjerning, topisk lægemiddelafgivelse, øjensalveapplikation osv.), Før du lægger dyrets krop oven på indsatsen. Bekræft, at musen er fuldt bedøvet ved hjælp af tåklemmerefleksmetoden.
   1. Med benet strakt ud, brug en negle til at klemme tåen fast uden at forårsage fysisk skade. Hvis musen udviser en positiv reaktion på stimulus (dvs. bentilbagetrækning, fodtræk osv.), Fortsæt med at administrere bedøvelsesmiddel i kammeret, indtil der ikke observeres nogen reaktion. Når den er korrekt bedøvet, skal musens vejrtrækningshastighed sænkes til ~ 55-65 vejrtrækninger pr. Minut¹⁸.
7. Når musen er fuldt bedøvet, skal du vælge High Flow igen for at stoppe isoflurantilføringen. Rens kammeret før åbning, og juster clipsene (blå: åben; hvid: lukket) for at levere isofluran gennem næsekeglen. Vælg Low Flow, mens næsekeglen er fastgjort til musen for at fortsætte isofluranleveringen.
8. Gevind isofluranslangen med den påsatte næsekegle gennem hjørneslangebeslaget på indsatsen (figur 3A og figur 5).

3. Musens placering på indsatsen til intravital billeddannelse

1. Sæt varmepladen i regulatoren (der indeholder en tilsluttet analsonde), tænd den, og lad pladen nå 36 °C (figur 4A).
2. Fjern den bedøvede mus fra induktionskammeret og læg den på tværs af varmepladen (figur 4B og figur 5A). Udfør overførslen fra kammer til indsættelse hurtigt for at minimere den tid, musen er aktiv uden inhalationsbedøvelse.
3. Fastgør næsekeglen på musen (figur 4B, C og figur 5). Brug om nødvendigt tape til yderligere at sikre vinklen og placeringen af næsekeglen.
4. Indsæt analsonden, og juster regulatortemperaturen, indtil musens kropstemperatur er stabil ved ~36 °C (figur 4A,B). Når musen er korrekt placeret, skal du bruge plastfolie til at fange varme, hvis det er nødvendigt, for yderligere at understøtte den passende kropstemperatur (figur 4C).
5. Placer musen, så hovedet flugter med coverslipskiven, og immobiliser øret på midten af glasdækslet ved hjælp af en øreclips af metal (figur 5A, B) eller tape (figur 5C).
   BEMÆRK: Trykket på metaløreclipsen på øret kan justeres ved at løsne skruen, der fastgør clipsen til indsatsen. En metalfjeder kan tilføjes for øget klemmespændingsfleksibilitet.
   1. For at ændre øreclipsens placering skal du skrue bolten af med en 2,5 mm unbrakonøgle og overføre den til det sekundære sted (figur 2B, C). Når du samler øreclipsen igen, skal du placere clipsen mod indsatsen efterfulgt af skiven ovenpå. Brug en bolt til at fastgøre clipsen sikkert med let kraft til at dreje clipsen.
6. Juster objektiv z-positionering, indtil cellerne er inden for brændpunktet (figur 6A, D). Indstil parametrene z-stack og time-lapse i henhold til de eksperimentelle mål, og start hentning af afbildninger.
   BEMÆRK: Hvis den korrekte opsætning opnås, kan museøret afbildes i mindst 3 på hinanden følgende timer (figur 6A',D').
   1. Når z-stack-grænserne er indstillet, skal du justere lasereffekten og forstærkningen for at sikre, at intet z-plan er overmættet for at minimere fotoblegning. Bestem time-lapse-parametrene ved hjælp af den samlede tykkelse af z-stakken, trinnumre (Nyquist-prøveudtagning anbefales) og tidsintervaller.
   2. Bestem billeddannelsesparametrene (tidsintervaller, total billedbehandlingstid osv.) ved hjælp af flere faktorer, herunder dyrs levedygtighed under anæstesi, laserinduceret fotoblegning / fototoksicitet og målet om levende billeddannelse (dvs. celledelingsdynamik, celle-celle-interaktioner osv.).

4. Afslutning af billeddannelse

1. Tænd for den vandcirkulerende varmepude, og indstil den til kontinuerlig cyklus og 35 °C i mindst 30 minutter, før billedoptagelsen afsluttes.
2. Når billeddannelsen er færdig, skal du vælge Low Flow på den elektroniske vaporizer for at stoppe isofluranafgivelsen og flytte musen til en varmepude, indtil den er ambulant.
3. Når du er vågen, skal du flytte musen tilbage til overførselsbeholderen, mens du fortsætter med at opretholde på en varmepude, indtil den er helt ambulant. Overvåg musen konsekvent, mens den er på varmepuden, indtil den reagerer.
4. På den elektroniske fordamper skal du klikke på Vælg menu > Anæstesikontrol > Tøm. Fjern isofluranflasken fra systemet, og sæt producentens hætte tilbage på flasken.
5. Mål vægten af isofluranflasken og kulbeholderen, og indtast lodderne i logbogen. Når kulbeholderen vejer 50 g over basismålingen, skal du bortskaffe beholderen og udskifte den med en ny enhed. Sæt isofluran tilbage i nøgleboksen.
6. Fjern dækslet, og tør det af med objektivpapir og objektivopløsning. Opbevares korrekt for at undgå ridser til genbrug.
7. Fjern anæstesislangen fra indsatsbeslaget, og skru indsatsen ud af mikroskoptrinnet.

Representative Results

Korrekt samling af levende billedindsatsen på et omvendt konfokalmikroskop og passende orientering af en transgen mus oven på indsatsen valideres ved at erhverve z-stakke af fluorescerende mærket, levende ørevæv over et tidsforløb ≥1 time med minimal tegn på drift i x-, y- og z-akserne. Billeder skal tages med ensartede intervaller (intervaltid afhænger af det biologiske spørgsmål, styrken af fluorescenssignalet osv.), Så celledynamik og billeddrift kan spores over tid. Gennem hele tidsforløbet afslører overvågning af individuelle z-planer for at sikre, at de forbliver i fokus, om dyrenes bevægelser forstyrrer billeddannelsesstabiliteten. Et eksempel på enkelte z-planer, der forbliver i fokus over et længere tidsforløb ved hjælp af live imaging insertet, er afbildet i figur 6.

Billeder fra fire 60 minutters tidspunkter vist i figur 6A 'blev valgt fra en 3 timers time-lapse-film af mCherry+ epidermale celler i øret på en 3 måneder gammel voksen K14-H2B-mCherry-mus (~30 g) taget med 2 minutters intervaller ved hjælp af et z-trin på 0,246 μm for at opnå Nyquist-sampling over en samlet z-dybde på 24 μm (99 z-stack-billeder erhvervet pr. Tidspunkt).

Billeder fra fire 60 minutters tidspunkter vist i figur 6D 'blev valgt fra en 3 timers time-lapse-film af GFP + dermale fibroblaster i øret på en 8 måneder gammel voksen kvindelig Pdgfra: rtTA; pTRE:H2B-GFP-mus (~30 g; Figur 6B). Disse blev optaget med 5 minutters intervaller ved hjælp af et z-trin på 2 μm for at opnå Nyquist-sampling over en samlet z-dybde på 54 μm (28 z-stack-billeder erhvervet pr. Tidspunkt). Denne mus blev behandlet med 2 mg doxycyclin hver anden dag i 6 dage (fire behandlinger, 8 mg i alt) før billeddannelse (figur 6C).

Figur 1: Tilpasset 3D-printet sceneindsatsdesign. (A,B) Design og dimensioner af en specialiseret, 3D-printet indsats med en varmepladeåbning (A) samt en varmepladebundholder (B), som udskrives separat og derefter skrues ind i indsatsen (se tilsvarende supplerende fil 1, supplerende fil 2 og supplerende fil 3). Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 2: Ny trinindsats strømliner intravital billeddannelse på inverterede konfokale mikroskoper . (A) Indsats, der konstrueres ved hjælp af en 3D-printer. B) Enkel skærmodel uden varmeanordning; Live Imaging-indsatsen indeholder fire skruesteder (blå pile) til fastgørelse af mikroskoptrin. Øreclipsen af metal flader og immobiliserer øret på en 35 mm bred plastikskive, der indeholder et 20 mm bredt glasdæksel. Indsatsen indeholder to muligheder for placering af øreclips for at give fleksibilitet med musens retning. Asymmetrisk placering af målhullet gør det muligt for den voksne mus at lægge fladt. Sidebeslag justerer og immobiliserer isofluran næsekeglen for at lette musefastgørelsen. Den forenklede model kræver placering af en lille varmepude (eller alternativ varmekilde) under musen for at hjælpe med at regulere kropstemperaturen. (C) Avanceret skærmodel med indbygget varmeplade. (D) Varmepladen monteres ved at glide ind i en rillet åbning af skæret. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 3: Intravital billedindsats installeret på et omvendt mikroskoptrin . (A) Indsæt monteret på scenen af et laserscanningsomvendt konfokalmikroskop. Nærheden af isofluranfordamperen og kammeret tillader gevindskæring af næsekegleslangen gennem skærbeslaget. (B) Varmepladestikket strækker sig under mikroskoptrinnet for at tilslutte til controlleren. (C) Skærhullet flugter med et 40x silikonemål. D) En plastskive (diameter 35 mm) indeholdende et glasdæksel (diameter 20 mm) lægges oven på sceneindsatsens rillede åbning og forsegles på plads med vakuumfedt. Coverslip-disken blev skabt ved at fjerne væggene i en 35 mm x 10 mm glasbundet cellekulturskål. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 4: Overvågning af dyrs kropstemperatur ved hjælp af en varmepladeregulator . (A) Varmepladeregulator, som kan justeres for at stabilisere musens kropstemperatur på de optimale 36 °C under hele den intravitale billeddannelsessession. (B) En analsonde bruges til at overvåge musens kropstemperatur, når musen er lagt oven på varmepladen. (C) Plastfolie kan bruges til at fange varme for yderligere at hæve musens kropstemperatur. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 5: Musens placering på den intravitale billedindsats . (A) Musens krop spredes langs toppen af varmepladen, med øret centreret på glasdækslet og immobiliseret med en øreclips af metal. Beslaget placerer isofluran næsekeglen til fastgørelse af mus. (B) Zoomet område af (A), der viser museøreimmobilisering med en øreclips af metal på glasdækslet og isoflurannæsekeglens fastgørelse til musen. (C) Tape kan bruges som en alternativ metode til øreimmobilisering på glasdækslet. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 6: Brugerdefineret indsats letter stabil langsigtet intravital billeddannelse af museøreepidermis og fibroblaster . (A) Et enkelt z-plan fanget ved udførelse af intravital billeddannelse på øreepidermalt epitel af en 3 måneder gammel voksen K14-H2B-mCherry transgen mus. Den stiplede boks angiver det område, der er zoomet ind på, og som vises i (A'). Skalabjælke = 50 μm. (A') Zoomet område af (A), der viser billeder hver time over en film på 3 timer. Skalabjælke = 10 μm. (B) Skematisk over det doxycyclin-inducerbare transgene system, der anvendes til at fremme in vivo GFP-mærkning af dermale fibroblastkerner. (C) Tidslinje for injektioner med doxycyclin. (D) Maksimal intensitetsprojektion (repræsenterer en 54 μm total z-dybde) af dermale fibroblaster fanget ved at udføre intravital billeddannelse på øret af en dox-injiceret 8 måneder gammel kvindelig Pdgfra:rtTA; pTRE: H2B-GFP transgen mus. Den stiplede boks angiver det område, der er zoomet ind på, og som vises i (D'). Skalabjælke = 50 μm. (D') Zoomet område af (D), der viser billeder hver time over en film på 3 timer. Skalabjælke = 10 μm. Disse tidskurser demonstrerer stabiliteten af langsigtet intravital billeddannelse ved hjælp af den 3D-printede brugerdefinerede indsats. Klik her for at se en større version af denne figur.

Supplerende fil 1: Designfil til det 3D-printede skær med en varmepladeåbning. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende fil 2: Designfil til den 3D-printede bundholder til varmepladen. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende fil 3: Designfil til det 3D-printede skær uden varmepladeåbning. Klik her for at downloade denne fil.

Discussion

I denne undersøgelse præsenterer vi et nyt værktøj, der letter stabil, langsigtet intravital billeddannelse af intakt musehudepitel på inverterede konfokale mikroskoper. Denne opfindelse er lavet af PLA, som er det mest almindelige og billige 3D-printbare materiale; alle interne 3D-printomkostninger for dette skær beløber sig til < $ 5. De to separate skærstykker (figur 1, supplerende fil 1 og supplerende fil 2) kan let samles ved hjælp af sætskruer (se materialetabel). Navnlig kan de medfølgende .stl-filer også bruges til at bestille denne indsats på kommerciel vis. En yderligere mulighed er at bruge en computer numerisk kontrol (CNC) maskine til at generere indsatsen ud af anodiseret aluminium, selvom dette er betydeligt dyrere.

For at sikre pålidelig og effektiv billeddannelse over en varighed ved hjælp af dette nye værktøj er det afgørende at dimensionere live imaging indsatsen korrekt i henhold til brugerens mikroskop fase. Den medfølgende supplerende fil 1, supplerende fil 2 og supplerende fil 3 kan tilpasses, så de afspejler de passende skærdimensioner, der er kompatible med det valgte mikroskop inden 3D-udskrivning. Nøjagtige skærdimensioner med en immobiliseret coverslip-disk minimerer positions- (x/y) og fokal (z) drift under hver billedbehandlingssession. Det er også vigtigt at sikre, at skærdybden er tilstrækkelig til at passere varmepladepropporten under trinnet.

Før billeddannelse er det vigtigt at bekræfte, at musen er fuldt bedøvet, dens kropstemperatur forbliver stabil ved ~ 36 ° C målt med analtermometersonden, og øret er fast immobiliseret for at undgå bevægelse på grund af vejrtrækning. Når du bruger metaløreclipsen til at fastgøre øret til dæksedlen, bør man forhindre afbrydelse af normal blodcirkulation ved at sikre, at øreklemmen ikke skrues for hårdt ned. Det er også afgørende at overvåge og genopbygge øjensalve på musen, når det er nødvendigt for at opretholde okulær fugt under lange billeddannelsessessioner.

Selvom dette unikke skærdesign giver en ny tilgang til intravital billeddannelse, har det et par bemærkelsesværdige begrænsninger. På grund af skærets lave placering i mikroskoptrinnet bør trinbevægelsen i x- og y-planerne være meget begrænset, efter at målet er placeret, og dækslipskiven er forseglet på plads. Denne begrænsede bevægelse er afgørende for at undgå skade på målet. Det skal desuden bemærkes, at glasdækslet i øjeblikket ikke er kommercielt tilgængeligt. For at genskabe den coverslip-disk, der blev brugt i denne undersøgelse, kan det være nødvendigt at samarbejde med et maskinværksted.

Mens vi demonstrerer, at denne konfokale baserede metode kan opnå stabil langsigtet billeddannelse dybt ind i intakt væv, skal det bemærkes, at multifotonmikroskoper forårsager mindre fotoskader og trænger ind i større dybder sammenlignet med konfokale instrumenter¹⁹. Derfor er brugen af dette værktøj afhængig af styrken af fluorescenssignalet i den valgte transgene dyremodel samt den vævsdybde, der kræves for at nå de eksperimentelle mål. Vi anbefaler derfor at bruge den lavest mulige lasereffekt for at minimere fotoblegning og samtidig opnå den ønskede opløsning. Det er også vigtigt, at objektivobjektivet, der bruges med dette skær, har en høj NA for optimal opløsning samt en lang arbejdsafstand, så den kan nå dækslet. Det skal bemærkes, at denne tilgang ikke er beregnet til at erstatte den velvaliderede opretstående multifotonbaserede intravitale billeddannelsesmetode beskrevet i Pineda et al. ⁶. I stedet er dette nye værktøj beregnet til at give et effektivt alternativ til laboratorier, der ikke har adgang til multifotonudstyr, foretrækker et mindre besværligt system og / eller ejer et omvendt mikroskop.

Vores nye værktøj kan tilpasses bemærkelsesværdigt til individualiserede eksperimentelle krav og præferencer. Dette skær kan bruges med eller uden varmeplade, da nogle alternative muligheder omfatter placering af en tynd varmepude under musen, vikling af en objektiv linsevarmer omkring dens torso og / eller fangst af varme ved at dække musen med plastfolie (figur 4C). Desuden kan tape anvendes sammen med eller i stedet for øreclipsen for at give optimal vævsimmobilisering (figur 5C). Sceneindsatsens retning er vendbar, så brugeren kan beslutte, om det er optimalt at orientere målhullet i højre eller venstre side. Desuden har indsatsen indbyggede alternative placeringsmuligheder for øreclipsen og isofluranslangen for at give maksimal fleksibilitet baseret på den ønskede museorientering (billeddannelse af højre vs. venstre øre), placering af isofluranopsætning og specifikke mikroskopkonfigurationer (figur 2C). Indsatsen er let at installere og aftage, med et forenklet design, der er beregnet til at være meget brugervenligt, så intravital billeddannelse kan gøres tilgængelig for selv nybegyndermikroskopister. Derudover giver det asymmetrisk lokaliserede objektivhul kapacitet til at afbilde forskellige dyremodeller såvel som organer af forskellig størrelse.

Vi har til hensigt med denne opfindelse at forbedre anvendelsen af intravital mikroskopi i individuelle laboratorier samt mikrokopikerner, der indeholder inverterede konfokale instrumenter. Dette meget tilgængelige og tilpasselige værktøj vil give efterforskere frihed til at visualisere levende celledynamik på tværs af forskellige organsystemer for at afsløre betydelig cellebiologisk indsigt.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
3D Printer	Qudi Tech	i-Fast	3D prints using PLA material
40x 1.25NA silicone objective lens	Nikon
AxR Laser Scanning Confocal Microscope	Nikon
Cotton Tipped Swab	VWR	76337-046	Cream/ointment application
Doxycycline hyclate	Sigma-Aldrich	D9891	Induces GFP labeling of fibroblast nuclei in Pdgfra-rtTA; pTRE-H2B-GFP mice
Flathead Screwdriver (2.5 mm)			Affiix insert to microscope stage
Flathead Screws x 4 (#6-32)	Nikon		Screw insert into microscope stage
Glass Bottom Culture Dish	chemglass Life Sciences	CLS-1811-002	Modified by removing walls of dish for use as coverslip disk compatible with live insert; 35 mm wide disk contains 20 mm wide glass coverslip; dish walls were removed by machine shop
Heat Plate controller	Physitemp	TCAT-2LV	Animal Temperature Controller - Low Voltage; anal prob attachment for mouse body temperature monitoring
Hex Wrench (1.5 mm)			For M3 setscrew adjustments
Hex Wrench (2.5 mm)			Adjust tension on metal ear clip
Intravital Imaging Insert
Isoflurane	Med-Vet International	HPA030782-100uL	Mouse anesthesia
Labeling Tape (or Scotch Tape)	VWR	10127-458	Alternative to metal ear clip to immobilize ear to coverslip
Metal fastener			used as ear clip
Mouse: C57BL/6-Pdgfraem1(rtTA)Xsun/J	The Jackson Laboratory	RRID: IMSR_JAX:034459	Fibrroblast-specific promoter driving doxycycline-inducible rtTA expression
Mouse: K14-H2BPAmCherry	Courtesy of Dr. Valentina Greco at Yale University		Labels epidermal epithelial cell nuclei with mCherry; referred to in text as "K14-H2B-mCherry"
Mouse: pTRE-H2B-GFP: STOCK Tg(tetO-HIST1H2BJ/GFP)47Efu/J	The Jackson Laboratory	RRID: IMSR_JAX:005104	Labels fibroblast nuclei with GFP when combined with Pdgfra-rtTA and induced with doxycycline
Multipurpose Sealing Wrap	Glad		Enhance mouse warmth
Optixcare	VWR	MSPP-078932779	Eye lubricant
Set screws x 3 (M3; 6 mm)	Thorlabs	SS3M6	Attachment for heatplate module
Silicone Immersion Oil			Applied to 40x silicone objective
Small Animal Heating Plate	Physitemp	HP-4M	Provides heat to animal
Somnoflow Low-Flow Electronic Vaporizer	Kent Scientific	SF-01	Mouse anesthesia
Vacuum Grease	Flinn Scientific	AP1095	Seals coverslip disk to insert
Veet			hair removal
Water circulating heat pad	Stryker Medical	TP700	for mouse revival post-imaging