Summary
Protokollet presenterar ett nytt verktyg för att förenkla intravital avbildning med hjälp av inverterad konfokalmikroskopi.
Abstract
Att förstå normala och avvikande in vivo-cellbeteenden är nödvändigt för att utveckla kliniska interventioner för att motverka sjukdomsinitiering och progression. Det är därför viktigt att optimera avbildningsmetoder som underlättar observationen av celldynamik in situ, där vävnadsstruktur och sammansättning förblir ostörda. Epidermis är kroppens yttersta barriär, liksom källan till de vanligaste cancerformerna hos människor, nämligen hudcancer. Tillgängligheten av hudvävnad ger en unik möjlighet att övervaka epitel- och dermala cellbeteenden hos intakta djur med hjälp av icke-invasiv intravital mikroskopi. Ändå har denna sofistikerade avbildningsmetod främst uppnåtts med hjälp av upprättstående multifotonmikroskop, som utgör ett betydande inträdeshinder för de flesta utredare. Denna studie presenterar en specialdesignad, 3D-printad mikroskopsteginsats som är lämplig för användning med inverterade konfokalmikroskop, vilket effektiviserar den långsiktiga intravitala avbildningen av öronhud i levande transgena möss. Vi tror att denna mångsidiga uppfinning, som kan skräddarsys för att passa det inverterade mikroskopets varumärke och modell och anpassas för att avbilda ytterligare organsystem, kommer att visa sig vara ovärderlig för det större vetenskapliga forskarsamhället genom att avsevärt förbättra tillgängligheten av intravital mikroskopi. Dessa tekniska framsteg är avgörande för att stärka vår förståelse av levande cellers dynamik i normala och sjukdomssammanhang.
Introduction
Intravital mikroskopi är ett kraftfullt verktyg som gör det möjligt att övervaka cellernas beteende i deras ostörda in vivo-miljöer. Denna unika metod har gett viktiga insikter i hur komplexa däggdjursorgansystem fungerar, inklusive lunga1, hjärna2, lever3, bröstkörtel4, tarm5 och hud6. Dessutom har detta tillvägagångssätt avslöjat cellbeteendeförändringar under tumörutveckling7, sårläkning8,9, inflammation10 och andra olika patologier in situ. I denna studie fokuserar vi på att förbättra tillgängligheten av intravital mikroskopi för att avbilda levande epitel- och stromadynamik i intakt mushud. Att förstå cellbeteenden i däggdjurshud är av stor klinisk betydelse på grund av den anmärkningsvärda regenerativa och tumörframkallande kapaciteten hos denna vävnad.
Intravital avbildning i möss har främst utförts med upprättstående multifotonmikroskop på grund av deras förmåga att ge högupplöst avbildning på vävnadsdjup >100 μm11,12. Ändå saknar dessa instrument arbetshästens mångsidighet och mer allmänna tillgänglighet hos inverterade konfokalmikroskop, som är mer användarvänliga och kostnadseffektiva, ger möjlighet att avbilda odlade celler, inte kräver fullständigt mörker under bildtagning och är i allmänhet säkrare, bland andra anmärkningsvärda fördelar13,14. I denna studie presenterar vi ett nytt verktyg som avsevärt förbättrar tillgängligheten för intravital avbildning genom att anpassa detta tillvägagångssätt för inverterade konfokalmikroskop.
Här presenterar vi en 3D-printad anpassad sceninsatsdesign som innehåller flera nyckelfunktioner för att underlätta stabil, långsiktig intravital avbildning av musöronhud på ett inverterat konfokalmikroskop (Figur 1, Figur 2, Figur 3, Figur 4 och Figur 5). Dessa specialiserade funktioner inkluderar ett förskjutet objektivhål som gör att hela kroppen på en vuxen mus kan ligga helt platt under avbildning. Detta minimerar vibrationsstörningarna av musens kroppsrörelser vid avbildning och eliminerar behovet av att administrera ketamin och xylazin för att dämpa andningen, en praxis som ofta kombineras med intravital avbildning6. Dessutom placerar hörnfästena på insatsen en noskon med isofluran korrekt så att den är i linje med musens framsida, en öronklämma i metall immobiliserar musörat till en specialbyggd täckskiva och en valfri löstagbar biofeedback-värmeplatta med sluten slinga ligger i jämnhöjd med insatsen för att stödja musens kroppstemperatur under långa bildsessioner. Den anpassade täckskivan, som ger en plan yta som är nödvändig för att mushuvudet och örat ska kunna ligga platt, genererades i en maskinverkstad genom att ta bort väggarna på en generisk cellodlingsskål som innehåller täckglas. Användningen av en 40x silikonoljenedsänkningslins (1,25 numerisk bländare [NA], 0,3 mm arbetsavstånd) i kombination med coverslip-skivan och anpassad sceninsats ger högupplösta bilder >50 μm djupt in i örondermis.
För att testa funktionaliteten hos denna nya inverterade mikroskopstegsinsats fångade vi z-stackar som spänner över alla epidermala epitelskikt under en 3 timmars tidsförlopp i örat på en levande transgen K14-H2B-mCherry15 vuxen mus (epitelkärnor i denna muslinje innehåller en röd fluorescerande etikett) (Figur 6A-A'). Vi fångade också z-stackar som spänner över flera fibroblastlager i huddermis under en 3 timmars tidsförlopp i örat på en levande transgen Pdgfra-rtTA16; pTRE-H2B-GFP17 vuxen mus (fibroblastkärnor i denna muslinje har en grön fluorescerande etikett efter doxycyklininduktion) (figur 6B-D'). Våra högupplösta data visar konsekvent stabilitet genom avsaknad av drift i x-, y- och z-planen, vilket bevisar effektiviteten hos detta nya intravitala avbildningsverktyg för användning på inverterade mikroskop. Det är viktigt att notera att måtten på denna 3D-printade sceninsats kan justeras, enligt beskrivningen i Supplementary File 1, Supplementary File 2 och Supplementary File 3, för att passa alla inverterade mikroskop, och placeringen av objektivöppningen kan flyttas till alternativa platser i insatsen för att bättre passa att avbilda en viss vävnads- och/eller djurmodell av intresse. Denna uppfinning kan således göra det möjligt för enskilda laboratorier, eller forskare med konfokal åtkomst till kärnfaciliteten, att anpassa detta verktyg för sina unika intravitala avbildningsbehov, och därigenom effektivisera utvärderingen av olika in vivo-cellbiologi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denna forskning utfördes i enlighet med Emory University och Atlanta Veterans Affairs Medical Center riktlinjer för djurvård och användning och har godkänts av Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC).
1. Installation av livebildsinsatsen på det inverterade mikroskopet stage
- Konstruera insatsen med hjälp av .stl-filer (tilläggsfil 1, tilläggsfil 2 och tilläggsfil 3) som anger 3D-mått och design (se figur 1 och figur 2A), en 3D-skrivare och polymjölksyra (PLA).
- Placera försiktigt insatsen (Figur 2B,C) i det stora mikroskopet stage spår (Figur 2C och Figur 3A). Använd skruvar för att fästa insatsen med fyra skruvhål i varje hörn av insatsen (Figur 2B-C).
OBS: Insatsen är dubbelriktad och kan roteras 180° beroende på orienteringen av mikroskopsteget och anestesiapparaten. - Skjut in värmeplattan i insatspluggen med sidan nedåt (Figur 2D) så att enheten ligger ovanpå de nedre insatsspåren med pluggporten som passerar under stage (Figur 3B).
- Rikta in den räfflade cirkulära öppningen i insatsen med ett 40x silikonoljenedsänkningsobjektiv (Figur 3C) och applicera silikonolja i mitten av objektivet.
- Om du avbildar under längre tidsperioder (>1 timme), applicera en generös klick olja som kommer att finnas kvar vid täckglaset/objektivgränssnittet under hela bilden. Låt inte olja spillas över linsens kanter.
- Använd en spruta för att applicera en liten mängd vakuumfett längs den räfflade cirkulära öppningen och lägg täckglaset ovanpå för att täta på insatsen (Figur 3D).
OBS: Täckskivan skapas genom att ta bort väggarna på en 35 mm x 10 mm cellodlingsskål med glasbotten (utförs av en maskinverkstad). - Höj 40x-objektivet tills oljan kysser botten av glastäcket.
2. Isoflurankonfiguration och musförberedelse
- Placera komponenterna i den elektroniska förångaren med lågt flöde (anestesikammare, slang, förångare, kolbehållare) så att noskonen och den anslutna slangen når insatsen (Figur 3A).
VARNING: Isofluran är ett inhalationsbedövningsmedel och bör hanteras med försiktighet för att undvika spill och minimera mänsklig exponering. - Mät vikten på isofluranflaskan före användning och logga. Fäst locket från den elektroniska vaporizern på isofluranflaskan.
- Anslut nätsladden till den elektroniska vaporizern. Stäng de blå noskonklämmorna och öppna de vita induktionskammarklämmorna för att tillåta luftflöde genom kammaren in i kolbehållaren. Ta bort det röda omgivande luftlocket från maskinens vänstra sida för att tillåta luftflöde.
- Låt systemet värmas upp i 5 minuter vid 200 ml/min (lågt flöde) och 2 % isofluran.
OBS: Även om noskoninställningen är vald, ska den blå noskonlinjen förbli stängd och den vita induktionskammarlinjen ska förbli öppen. - När systemet är korrekt i balans, rensa ledningarna för att ta bort kvarvarande isofluran från kammaren.
- Placera musen i induktionskammaren och välj Högt flöde. Slutför alla musförberedelser (dvs. hårborttagning, topisk läkemedelstillförsel, applicering av ögonsalva, etc.) innan du lägger djurets kropp ovanpå inlägget. Bekräfta att musen är helt bedövad med hjälp av tånypreflexmetoden.
- Med benet utsträckt, använd en nagel för att nypa tån ordentligt utan att orsaka fysisk skada. Om musen uppvisar en positiv reaktion på stimuleringen (t.ex. benindragning, fotryckningar etc.), fortsätt att administrera bedövningsmedel i kammaren tills ingen reaktion observeras. När musens andningsfrekvens är ordentligt bedövad bör den sakta ner till ~55-65 andetag per minut18.
- När musen är helt sövd, välj Högt flöde igen för att stoppa tillförseln av isofluran. Rensa kammaren innan du öppnar den och justera klämmorna (blå: öppen; vit: stängd) för att leverera isofluran genom noskonen. Välj Low Flow medan noskonen är fäst vid musen för att fortsätta tillförseln av isofluran.
- Trä isofluranslangen med den bifogade noskonen genom hörnslangfästet på insatsen (Figur 3A och Figur 5).
3. Musens placering på insatsen för intravital avbildning
- Anslut värmeplattan till styrenheten (som innehåller en ansluten analsond), slå på och låt plattan nå 36 °C (Figur 4A).
- Ta bort den sövda musen från induktionskammaren och lägg den tvärs över värmeplattan (Figur 4B och Figur 5A). Utför överföringen från kammaren för att föra in snabbt för att minimera tiden musen är aktiv utan inhalationsanestesi.
- Fäst noskonen på musen (Figur 4B, C och Figur 5). Använd vid behov tejp för att ytterligare säkra noskonens vinkel och placering.
- Sätt i analsonden och justera kontrolltemperaturen tills musens kroppstemperatur är stabil vid ~36 °C (Figur 4A,B). När musen är korrekt placerad, använd plastfolie för att fånga upp värme, om det behövs, för att ytterligare stödja lämplig kroppstemperatur (Figur 4C).
- Placera musen så att huvudet är i linje med täckglaset och immobilisera örat mot mitten av glasglaset med hjälp av en öronklämma av metall (Figur 5A,B) eller tejp (Figur 5C).
OBS: Trycket på öronklämman i metall på örat kan justeras genom att lossa skruven som håller fast klämman i insatsen. En metallfjäder kan läggas till för ökad flexibilitet vid åtdragning av clipsen.- För att ändra öronklämmans placering, skruva loss bulten med en 2.5 mm insexnyckel och överför till den sekundära platsen (Figur 2B,C). När du sätter ihop öronklämman igen, placera klämman mot insatsen, följt av brickan ovanpå. Använd en bult för att säkert fästa klämman med lätt kraft för att svänga klämman.
- Justera objektivets z-positionering tills cellerna är inom brännpunkten (Figur 6A,D). Ställ in z-stack- och time-lapse-parametrarna enligt de experimentella målen och påbörja bildinsamlingen.
OBS: Om rätt inställning uppnås kan musörat avbildas i minst 3 timmar i följd (Figur 6A',D').- När z-stackgränserna är inställda, justera lasereffekten och förstärkningen för att säkerställa att inget z-plan är övermättat för att minimera fotoblekning. Bestäm time-lapse-parametrarna med hjälp av z-stackens totala tjocklek, stegnummer (Nyquist-sampling rekommenderas) och tidsintervall.
- Bestäm avbildningsparametrarna (tidsintervall, total avbildningstid, etc.) med hjälp av flera faktorer, inklusive djurlivsduglighet under anestesi, laserinducerad fotoblekning/fototoxicitet och målet med levande avbildning (dvs. celldelningsdynamik, cell-cellinteraktioner, etc.).
4. Avbrytande av avbildning
- Slå på den vattencirkulerande värmedynan och ställ in på kontinuerlig cykel och 35 °C i minst 30 minuter innan bildtagningen avslutas.
- När avbildningen är klar, välj Low Flow på den elektroniska vaporizern för att stoppa tillförseln av isofluran och flytta musen till en värmedyna tills den är ambulerande.
- När du är vaken flyttar du musen tillbaka till överföringsbehållaren samtidigt som du fortsätter att hålla den på en värmedyna tills den är helt ambulerande. Övervaka musen konsekvent när du är på värmeplattan tills den svarar.
- På den elektroniska förångaren klickar du på Välj meny > Anestesikontroll > Tom. Ta bort isofluranflaskan från systemet och sätt tillbaka tillverkarens lock på flaskan.
- Mät vikten på isofluranflaskan och kolbehållaren och mata in vikterna i stocken. När kolbehållaren väger 50 g över baslinjemätningen, kassera behållaren och byt ut den mot en ny enhet. Lägg tillbaka isofluranen i låsboxen.
- Ta bort täckglaset och torka rent med linspapper och linslösning. Förvara på rätt sätt för att undvika repor vid återanvändning.
- Ta bort anestesislangen från insatsfästet och skruva loss insatsen från mikroskopetage.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Korrekt montering av live-bildinsatsen på ett inverterat konfokalmikroskop och lämplig orientering av en transgen mus ovanpå insatsen valideras genom att samla in z-stackar av fluorescerande märkt, levande öronvävnad under ett tidsförlopp ≥1 timme med minimala tecken på drift i x-, y- och z-axlarna. Bilder bör tas med jämna mellanrum (intervalltiden beror på den biologiska frågan, fluorescenssignalens styrka, etc.) så att celldynamik och bilddrift kan spåras över tid. Genom att övervaka enskilda z-plan för att säkerställa att de förblir i fokus under hela tidsperioden kan man se om djurens rörelser stör bildstabiliteten. Ett exempel på enstaka z-plan som förblir i fokus under en längre tidsperiod med hjälp av livebildinsatsen visas i figur 6.
Bilder från fyra 60-minuterstidpunkter som visas i figur 6A' valdes ut från en 3-timmars time-lapse-film av mCherry+ epidermala celler i örat på en 3 månader gammal vuxen hane K14-H2B-mCherry-mus (~30 g) fångad med 2 minuters intervall med ett z-steg på 0,246 μm för att uppnå Nyquist-provtagning över ett totalt z-djup på 24 μm (99 z-stackbilder tagna per tidpunkt).
Bilder från fyra 60-minuterstidpunkter som visas i figur 6D' valdes ut från en 3-timmars time-lapse-film av GFP+ dermala fibroblaster i örat på en 8 månader gammal vuxen hona Pdgfra:rtTA; pTRE:H2B-GFP-mus (~30 g; Figur 6B). Dessa fångades med 5 minuters intervall med ett z-steg på 2 μm för att uppnå Nyquist-sampling över ett totalt z-djup på 54 μm (28 z-stackbilder tagna per tidpunkt). Musen behandlades med 2 mg doxycyklin varannan dag i 6 dagar (fyra behandlingar, totalt 8 mg) före bilddiagnostik (Figur 6C).
Figur 1: Anpassad 3D-printad sceninsatsdesign. (A,B) Design och mått på en anpassad, 3D-printad insats med en värmeplatteöppning (A), samt en bottenhållare för värmeplatta (B), som trycks separat och sedan skruvas in i insatsen (se motsvarande tilläggsfil 1, tilläggsfil 2 och tilläggsfil 3). Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Ny steginsats effektiviserar intravital avbildning på inverterade konfokalmikroskop . (A) Insatsen konstrueras med hjälp av en 3D-skrivare. (B) Enkel insatsmodell utan uppvärmningsanordning; Live Imaging-insatsen innehåller fyra skruvställen (blå pilar) för montering av mikroskopsteg. Öronklämman i metall plattar till och immobiliserar örat på en 35 mm bred plastskiva som innehåller en 20 mm bred glasskiva. Insatsen innehåller två alternativ för placering av öronklämmor för att ge flexibilitet med musorientering. Asymmetrisk placering av objektivhålet gör att den vuxna musen kan ligga platt. Sidofästen riktar in och immobiliserar isofluran-noskonen för att underlätta fastsättning av musen. Den förenklade modellen kräver att man placerar en liten värmedyna (eller alternativ värmekälla) under musen för att hjälpa till att reglera kroppstemperaturen. (C) Avancerad insatsmodell med inbyggd värmeplatta. (D) Värmeplattan installeras genom att glida in i en räfflad öppning på insatsen. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Intravital bildinsats installerad på ett inverterat mikroskopsteg . (A) Insats monterad på stage av ett laserskannande inverterat konfokalmikroskop. Närheten mellan isofluranförångaren och kammaren gör det möjligt att trä noskonslangen genom insatsfästet. (B) Värmeplattans kontakt sträcker sig under mikroskopet stage för att ansluta till styrenheten. (C) Insatshålet är i linje med ett 40x silikonobjektiv. (D) En plastskiva (35 mm diameter) som innehåller en glasskiva (20 mm diameter) läggs ovanpå den räfflade öppningen på sceninsatsen och förseglas på plats med vakuumfett. Täckskivan skapades genom att ta bort väggarna i en 35 mm x 10 mm cellodlingsskål med glasbotten. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Övervakning av djurens kroppstemperatur med hjälp av en värmeplatteregulator . (A) Värmeplatteregulator, som kan justeras för att stabilisera musens kroppstemperatur vid optimala 36 °C under hela den intravitala bildsessionen. (B) En analsond används för att övervaka musens kroppstemperatur när musen har lagts ovanpå värmeplattan. (C) Plastfolie kan användas för att fånga värme för att ytterligare höja musens kroppstemperatur. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 5: Muspositionering på den intravitala bildinsatsen . (A) Muskroppen är spridd längs toppen av värmeplattan, med örat centrerat på glastäcket och immobiliserat med en öronklämma av metall. Fästet placerar isoflurannoskonen för musfäste. (B) Inzoomat område av (A) som visar immobilisering av musöron med en öronklämma av metall på glastäcket och isofluran-noskonen som fästs på musen. (C) Tejp kan användas som en alternativ metod för immobilisering av öronen på glastäcket. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 6: Anpassad insats underlättar stabil långtidsintravital avbildning av epidermis och fibroblaster i musöron . (A) Ett enda z-plan fångat genom att utföra intravital avbildning på öronepidermalt epitel hos en 3 månader gammal vuxen hane K14-H2B-mCherry transgen mus. Den prickade rutan anger det inzoomade området som visas i (A'). Skalstapel = 50 μm. (A') Inzoomat område på (A) som visar bilder varje timme under en 3-timmarsfilm. Skalstapel = 10 μm. (B) Schematisk bild av det doxycyklininducerbara transgena system som används för att främja GFP-märkning in vivo av dermala fibroblastkärnor. (C) Tidslinje för doxycyklininjektioner. (D) Projicering med maximal intensitet (motsvarande ett totalt z-djup på 54 μm) av dermala fibroblaster som fångats genom intravital avbildning i örat på en doxinjicerad 8 månader gammal hona av typen Pdgfra:rtTA. pTRE: H2B-GFP transgen mus. Den prickade rutan anger det inzoomade området som visas i (D'). Skalstapel = 50 μm. (D') Inzoomat område av (D) som visar bilder varje timme under en 3 timmars film. Skalstapel = 10 μm. Dessa tidsförlopp visar stabiliteten hos långsiktig intravital avbildning med hjälp av den 3D-printade anpassade insatsen. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Kompletteringsfil 1: Designfil för den 3D-printade insatsen med värmeplatteöppning. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Tilläggsfil 2: Designfil för den 3D-printade bottenhållaren för värmeplattan. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletteringsfil 3: Designfil för den 3D-printade insatsen utan öppning på värmeplattan. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I denna studie presenterar vi ett nytt verktyg som underlättar stabil, långsiktig intravital avbildning av intakt mushudepitel på inverterade konfokalmikroskop. Denna uppfinning är gjord av PLA, som är det vanligaste och billigaste 3D-utskrivbara materialet; alla interna kostnader för 3D-utskrift för denna insats uppgår till < $ 5. De två separata insatsstyckena (Figur 1, Kompletterande File 1 och Supplement File 2) kan enkelt monteras med hjälp av ställskruvar (se Materialförteckning). De medföljande .stl-filerna kan också användas för att beställa denna bilaga på kommersiella sätt. Ett ytterligare alternativ är att använda en CNC-maskin (Computer Numerical Control) för att generera insatsen av anodiserad aluminium, även om detta är betydligt dyrare.
För att säkerställa tillförlitlig och effektiv avbildning under en längre tid med detta nya verktyg är det viktigt att korrekt dimensionera livebildinsatsen enligt användarens mikroskopsteg. Den medföljande tilläggsfilen 1, tilläggsfilen 2 och tilläggsfilen 3 kan anpassas för att återspegla lämpliga insatsmått som är kompatibla med det valda mikroskopet före 3D-utskrift. Exakta skärmått med en immobiliserad täckskiva minimerar positionsavvikelsen (x/y) och fokalavvikelsen (z) under varje bildtagningssession. Det är också viktigt att se till att insatsdjupet är tillräckligt för att passera värmeplattans pluggport under stage.
Före avbildning är det viktigt att bekräfta att musen är helt bedövad, att dess kroppstemperatur förblir stabil vid ~36 °C mätt med analtermometersonden och att örat är ordentligt immobiliserat för att undvika rörelse på grund av andning. När man använder öronklämman i metall för att fästa örat i täckglaset bör man förhindra att normal blodcirkulation skärs av genom att se till att öronklämman inte skruvas fast för hårt. Det är också viktigt att övervaka och fylla på ögonsalva på musen vid behov för att bibehålla ögonfuktigheten under långa bildsessioner.
Även om denna unika skärdesign ger ett nytt tillvägagångssätt för intravital avbildning, har den några anmärkningsvärda begränsningar. På grund av insatsens låga positionering i mikroskopsteget bör stegrörelsen i x- och y-planen vara mycket begränsad efter att objektivet har placerats och täckskivan har förseglats på plats. Denna begränsade rörelse är avgörande för att undvika skador på målet. Det bör dessutom noteras att glasskivan för närvarande inte är kommersiellt tillgänglig. För att återskapa den täckskiva som användes i denna studie kan det krävas samarbete med en mekanisk verkstad.
Även om vi visar att denna konfokala metod kan uppnå stabil långtidsavbildning djupt in i intakt vävnad, bör det noteras att multifotonmikroskop orsakar mindre fotoskador och tränger ner till större djup jämfört med konfokala instrument19. Därför är användbarheten av detta verktyg beroende av styrkan hos fluorescenssignalen i den transgena djurmodell som valts, såväl som det vävnadsdjup som krävs för att uppnå de experimentella målen. Vi rekommenderar därför att du använder lägsta möjliga lasereffekt för att minimera fotoblekning samtidigt som du uppnår önskad upplösning. Det är också viktigt att objektivlinsen som används med denna insats har ett högt NA för optimal upplösning, samt ett långt arbetsavstånd så att det kan nå täckskivan. Det bör noteras att detta tillvägagångssätt inte är avsett att ersätta den välvaliderade upprättstående multifotonbaserade intravitala avbildningsmetoden som beskrivs i Pineda et al. 6. Istället är detta nya verktyg avsett att ge ett effektivt alternativ till laboratorier som inte har tillgång till multifotonutrustning, föredrar ett mindre besvärligt system och/eller äger ett inverterat mikroskop.
Vårt nya verktyg är anmärkningsvärt anpassningsbart till individualiserade experimentella krav och preferenser. Denna insats kan användas med eller utan värmeplatta, eftersom några alternativa alternativ inkluderar placering av en tunn värmedyna under musen, lindning av en objektivlinsvärmare runt bålen och/eller infångande värme genom att täcka musen med plastfolie (Figur 4C). Dessutom kan tejp användas tillsammans med eller i stället för öronklämman för att ge optimal vävnadsimmobilisering (Figur 5C). Sceninsatsens orientering är vändbar, så att användaren kan avgöra om det är optimalt att orientera objektivhålet på höger eller vänster sida. Dessutom har insatsen inbyggda alternativa placeringsalternativ för öronklämman och isofluranslangen för att ge maximal flexibilitet baserat på önskad musorientering (avbildning av höger kontra vänster öra), placering av isofluraninställning och specifika mikroskopkonfigurationer (Figur 2C). Insatsen är lätt att installera och avtagbar, med en förenklad design som är avsedd att vara mycket användarvänlig så att intravital avbildning kan göras tillgänglig även för nybörjare. Dessutom ger det asymmetriskt lokaliserade objektivhålet kapacitet att avbilda olika djurmodeller såväl som organ av varierande storlek.
Vi avser att denna uppfinning ska förbättra tillämpningen av intravital mikroskopi inom enskilda laboratorier samt mikroskopikärnor som innehåller inverterade konfokala instrument. Detta mycket lättillgängliga och anpassningsbara verktyg kommer att ge utredare friheten att visualisera levande celldynamik över olika organsystem för att avslöja betydande cellbiologiska insikter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inga intressekonflikter att redovisa.
Acknowledgments
Vi tackar Valentina Greco för K14-mCherry-H2B-mössen. Vi är tacksamma mot Emory University Physics Department Machine Shop för att ha genererat glasskivorna. Detta arbete finansierades av Career Development Award #IK2 BX005370 från US Department of Veterans Affairs BLRD Service till LS, NIH Awards RF1-AG079269 och R56-AG072473 till MJMR, och I3 Emory SOM/GT Computational and Data Analysis Award till MJMR.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3D Printer | Qudi Tech | i-Fast | 3D prints using PLA material |
| 40x 1.25NA silicone objective lens | Nikon | ||
| AxR Laser Scanning Confocal Microscope | Nikon | ||
| Cotton Tipped Swab | VWR | 76337-046 | Cream/ointment application |
| Doxycycline hyclate | Sigma-Aldrich | D9891 | Induces GFP labeling of fibroblast nuclei in Pdgfra-rtTA; pTRE-H2B-GFP mice |
| Flathead Screwdriver (2.5 mm) | Affiix insert to microscope stage | ||
| Flathead Screws x 4 (#6-32) | Nikon | Screw insert into microscope stage | |
| Glass Bottom Culture Dish | chemglass Life Sciences | CLS-1811-002 | Modified by removing walls of dish for use as coverslip disk compatible with live insert; 35 mm wide disk contains 20 mm wide glass coverslip; dish walls were removed by machine shop |
| Heat Plate controller | Physitemp | TCAT-2LV | Animal Temperature Controller - Low Voltage; anal prob attachment for mouse body temperature monitoring |
| Hex Wrench (1.5 mm) | For M3 setscrew adjustments | ||
| Hex Wrench (2.5 mm) | Adjust tension on metal ear clip | ||
| Intravital Imaging Insert | |||
| Isoflurane | Med-Vet International | HPA030782-100uL | Mouse anesthesia |
| Labeling Tape (or Scotch Tape) | VWR | 10127-458 | Alternative to metal ear clip to immobilize ear to coverslip |
| Metal fastener | used as ear clip | ||
| Mouse: C57BL/6-Pdgfraem1(rtTA)Xsun/J | The Jackson Laboratory | RRID: IMSR_JAX:034459 | Fibrroblast-specific promoter driving doxycycline-inducible rtTA expression |
| Mouse: K14-H2BPAmCherry | Courtesy of Dr. Valentina Greco at Yale University | Labels epidermal epithelial cell nuclei with mCherry; referred to in text as "K14-H2B-mCherry" | |
| Mouse: pTRE-H2B-GFP: STOCK Tg(tetO-HIST1H2BJ/GFP)47Efu/J |
The Jackson Laboratory | RRID: IMSR_JAX:005104 | Labels fibroblast nuclei with GFP when combined with Pdgfra-rtTA and induced with doxycycline |
| Multipurpose Sealing Wrap | Glad | Enhance mouse warmth | |
| Optixcare | VWR | MSPP-078932779 | Eye lubricant |
| Set screws x 3 (M3; 6 mm) | Thorlabs | SS3M6 | Attachment for heatplate module |
| Silicone Immersion Oil | Applied to 40x silicone objective | ||
| Small Animal Heating Plate | Physitemp | HP-4M | Provides heat to animal |
| Somnoflow Low-Flow Electronic Vaporizer | Kent Scientific | SF-01 | Mouse anesthesia |
| Vacuum Grease | Flinn Scientific | AP1095 | Seals coverslip disk to insert |
| Veet | hair removal | ||
| Water circulating heat pad | Stryker Medical | TP700 | for mouse revival post-imaging |
References
- Babes, L., Yipp, B. G., Senger, D. L. Intravital microscopy of the metastatic pulmonary environment. Methods in Molecular Biology. , 383-396 (2023).
- Nal Chen,, et al. Neutrophils promote glioblastoma tumor cell migration after biopsy. Cells. 11 (14), 2196 (2022).
- Courson, J. A., Langlois, K. W., Lam, F. W. Intravital microscopy to study platelet-leukocyte-endothelial interactions in the mouse liver. Journal of Visualized Experiments. 188 (188), (2022).
- Rios, A. C., van Rheenen, J., Scheele, C. L. G. J.
- Fischer, M., Edelblum, K. L. Intravital microscopy to visualize murine small intestinal intraepithelial lymphocyte migration. Current Protocols. 2 (8), (2022).
- Pineda, C. M., et al. Intravital imaging of hair follicle regeneration in the mouse. Nature Protocols. 10 (7), 1116-1130 (2015).
- Entenberg, D., Oktay, M. H., Condeelis, J. S. Intravital imaging to study cancer progression and metastasis. Nature Reviews. Cancer. 23 (1), 25-42 (2023).
- Turk, M., Biernaskie, J., Mahoney, D. J., Jenne, C. N. Intravital microscopy techniques to image wound healing in mouse skin. Methods in Molecular Biology. , 165-180 (2022).
- Pal Arndt,, et al. A quantitative 3D intravital look at the juxtaglomerular renin-cell-niche reveals an individual intra/extraglomerular feedback system. Frontiers in Physiology. 13, 980787 (2022).
- Oal Yam, A., et al. Neutrophil conversion to a tumor-killing phenotype underpins effective microbial therapy. Cancer Research. 83 (8), 1315-1328 (2023).
- Huang, S., Rompolas, P. Two-photon microscopy for intracutaneous imaging of stem cell activity in mice. Experimental Dermatology. 26 (5), 379-383 (2017).
- Durr, N. J., Weisspfennig, C. T., Holfeld, B. A., Ben-Yakar, A. Maximum imaging depth of two-photon autofluorescence microscopy in epithelial tissues. Journal of Biomedical Optics. 16 (2), 026008 (2011).
- Tauer, U. Advantages and risks of multiphoton microscopy in physiology. Experimental Physiology. 87 (6), 709-714 (2002).
- Yoshitake, T., et al. Direct comparison between confocal and multiphoton microscopy for rapid histopathological evaluation of unfixed human breast tissue. Journal of Biomedical Optics. 21 (12), 126021 (2016).
- Mesa, K., Rompolas, P., Zito, G., et al. Niche-induced cell death and epithelial phagocytosis regulate hair follicle stem cell pool. Nature. 522, 94-97 (2015).
- Ral Li,, et al. Pdgfra marks a cellular lineage with distinct contributions to myofibroblasts in lung maturation and injury response. eLife. 7, (2018).
- Tal Tumbar,, et al. Defining the epithelial stem cell niche in skin. Science. 303 (5656), 359-363 (2004).
- Ewald, A. J., Werb, Z., Egeblad, M. Monitoring of vital signs for long-term survival of mice under anesthesia. Cold Spring Harbor Protocols. 2 (2), 5563 (2011).
- Sanderson, J.
