Summary
يقدم البروتوكول أداة جديدة لتبسيط التصوير داخل الجسم باستخدام المجهر المقلوب متحد البؤر.
Abstract
يعد فهم السلوكيات الطبيعية والشاذة في الخلايا الحية أمرا ضروريا لتطوير التدخلات السريرية لإحباط بدء المرض وتطوره. لذلك من الأهمية بمكان تحسين مناهج التصوير التي تسهل مراقبة ديناميكيات الخلايا في الموقع ، حيث تظل بنية الأنسجة وتكوينها غير مضطربة. البشرة هي الحاجز الخارجي للجسم ، وكذلك مصدر السرطانات البشرية الأكثر انتشارا ، وهي سرطان الجلد الجلدي. توفر إمكانية الوصول إلى أنسجة الجلد فرصة فريدة لمراقبة سلوكيات الخلايا الظهارية والجلدية في السليمة باستخدام الفحص المجهري داخل الجسم غير الباضع. ومع ذلك ، فقد تم تحقيق نهج التصوير المتطور هذا في المقام الأول باستخدام المجاهر متعددة الفوتونات المستقيمة ، والتي تمثل حاجزا كبيرا أمام دخول معظم الباحثين. تقدم هذه الدراسة مجهرا مصمما خصيصا ، مطبوعا 3D ، مناسبا للاستخدام مع المجاهر متحدة البؤر المقلوبة ، مما يبسط التصوير داخل الجسم على المدى الطويل لجلد الأذن في الفئران المعدلة وراثيا الحية. نعتقد أن هذا الاختراع متعدد الاستخدامات ، والذي يمكن تخصيصه ليناسب العلامة التجارية للمجهر المقلوب والنموذج المفضل وتكييفه مع أنظمة الأعضاء الإضافية للصورة ، سيثبت أنه لا يقدر بثمن لمجتمع البحث العلمي الأكبر من خلال تعزيز إمكانية الوصول إلى الفحص المجهري داخل الجسم بشكل كبير. هذا التقدم التكنولوجي أمر بالغ الأهمية لتعزيز فهمنا لديناميكيات الخلايا الحية في السياقات الطبيعية والمرضية.
Introduction
الفحص المجهري داخل الجسم هو أداة قوية تسمح بمراقبة سلوكيات الخلايا في بيئاتها غير المضطربة في الجسم الحي. قدمت هذه الطريقة الفريدة رؤى رئيسية حول الأعمال الداخلية لأنظمة أعضاء الثدييات المعقدة ، بما في ذلك الرئة1 والدماغ2 والكبد3 والغدة الثديية4 والأمعاء5 والجلد6. علاوة على ذلك ، كشف هذا النهج عن تغيرات سلوكية للخلايا أثناء تطور الورم7 ، والتئام الجروح 8,9 ، والالتهاب10 ، وغيرها من الأمراض المتنوعة في الموقع. في هذه الدراسة ، نركز على تعزيز إمكانية الوصول إلى الفحص المجهري داخل الجسم لتصوير الديناميكيات الظهارية واللحمية الحية في جلد الفأر السليم. إن فهم سلوكيات الخلايا في جلد الثدييات له أهمية سريرية عالية بسبب القدرة التجديدية والأورام الرائعة لهذا النسيج.
تم إجراء التصوير داخل الجسم في الفئران بشكل أساسي باستخدام المجاهر متعددة الفوتونات المستقيمة نظرا لقدرتها على توفير تصوير عالي الدقة على أعماق الأنسجة >100 ميكرومتر11,12. ومع ذلك ، تفتقر هذه الأدوات إلى تعدد استخدامات العمود الفقري وإمكانية الوصول بشكل عام للمجاهر متحدة البؤر المقلوبة ، والتي تكون أكثر سهولة في الاستخدام وفعالية من حيث التكلفة ، وتوفر القدرة على تصوير الخلايا المستزرعة ، ولا تتطلب ظلاما كاملا أثناء الحصول على الصور ، وهي أكثر أمانا بشكل عام ، من بين مزايا ملحوظة أخرى13,14. في هذه الدراسة ، نقدم أداة جديدة تعزز بشكل كبير إمكانية الوصول إلى التصوير داخل الجسم من خلال تكييف هذا النهج للمجاهر متحدة البؤر المقلوبة.
هنا ، نقدم تصميم إدراج مرحلة مخصص مطبوع ثلاثي الأبعاد يتضمن العديد من الميزات الرئيسية لتسهيل التصوير المستقر والطويل المدى داخل الجسم لجلد أذن الفأر على مجهر متحد البؤر مقلوب (الشكل 1 ، الشكل 2 ، الشكل 3 ، الشكل 4 ، والشكل 5). تتضمن هذه الميزات المتخصصة ثقبا موضوعيا للإزاحة يسمح لجسم الفأر البالغ بالكامل بالاستلقاء تماما أثناء التصوير. هذا يقلل من التداخل الاهتزازي لحركات جسم الفأر على التصوير ويلغي الحاجة إلى إعطاء الكيتامين والزيلازين لتثبيط التنفس ، وهي ممارسة غالبا ما تقترن بالتصوير داخل الجسم6. بالإضافة إلى ذلك ، تضع أقواس الزاوية الموجودة على الملحق مخروط أنف إيزوفلوران بشكل صحيح لمحاذاة وجه الماوس ، ومشبك أذن معدني يجمد أذن الماوس إلى قرص غطاء مصمم خصيصا ، ولوحة حرارية اختيارية مغلقة الحلقة للارتجاع البيولوجي قابلة للفصل تقع داخل الملحق لدعم درجة حرارة جسم الماوس أثناء جلسات التصوير الطويلة. تم إنشاء قرص غطاء مخصص ، والذي يوفر سطحا مستويا ضروريا لرأس الفأر والأذن ليكون مسطحا ، في ورشة آلات عن طريق إزالة جدران طبق زراعة الخلايا العام الذي يحتوي على غطاء الغطاء. يوفر استخدام عدسة غمر زيت السيليكون 40x (فتحة رقمية 1.25 [N.A.] ، مسافة عمل 0.3 مم) جنبا إلى جنب مع قرص غطاء الانزلاق وإدراج المسرح المخصص صورا عالية الدقة >50 ميكرومتر في عمق أدمة الأذن.
لاختبار وظائف إدخال مرحلة المجهر المقلوب الجديد هذا ، التقطنا مداخن z تغطي جميع طبقات ظهارة البشرة على مدار 3 ساعات في أذن فأر بالغ K14-H2B-mCherry15 معدل وراثيا (تحتوي النوى الظهارية في خط الماوس هذا على ملصق فلوري أحمر) (الشكل 6A-A'). لقد التقطنا أيضا مداخن z تمتد على عدة طبقات من الخلايا الليفية داخل الأدمة الجلدية على مدار 3 ساعات في أذن Pdgfra-rtTA16 المعدلة وراثيا الحية. pTRE-H2B-GFP17 فأر بالغ (تحتوي نوى الخلايا الليفية في خط الفأر هذا على ملصق فلوري أخضر بعد تحريض الدوكسيسيكلين) (الشكل 6B-D '). تظهر بياناتنا عالية الدقة استقرارا ثابتا بسبب عدم الانجراف في المستويات x و y و z ، مما يثبت فعالية أداة التصوير الجديدة داخل الجسم هذه للاستخدام على المجاهر المقلوبة. الأهم من ذلك ، يمكن تعديل أبعاد إدراج المرحلة المطبوع ثلاثي الأبعاد ، كما هو موضح في الملف التكميلي 1 والملف التكميلي 2 والملف التكميلي 3 ، لتناسب أي مجهر مقلوب ، ويمكن نقل موضع الفتحة الموضوعية إلى مواقع بديلة داخل الإدراج لتناسب بشكل أفضل تصوير نسيج معين و / أو نموذج حيواني مهم. وبالتالي يمكن لهذا الاختراع أن يمكن المختبرات الفردية ، أو الباحثين الذين لديهم وصول متحد البؤر للمنشأة الأساسية ، من تكييف هذه الأداة مع احتياجات التصوير الفريدة داخل الجسم الحيوي ، وبالتالي تبسيط تقييم بيولوجيا الخلية المتنوعة في الجسم الحي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تم إجراء هذا البحث وفقا لإرشادات رعاية واستخدام بجامعة إيموري والمركز الطبي لشؤون المحاربين القدامى في أتلانتا وتمت الموافقة عليه من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدام (IACUC).
1. تركيب ملحق التصوير الحي على مرحلة المجهر المقلوب
- قم بإنشاء الإدراج باستخدام ملفات .stl (الملف التكميلي 1 والملف التكميلي 2 والملف التكميلي 3) مع تحديد الأبعاد ثلاثية الأبعاد والتصميم (انظر الشكل 1 والشكل 2A) وطابعة ثلاثية الأبعاد وحمض polylactic (PLA).
- ضع الإدراج بعناية (الشكل 2B ، C) في أخدود مرحلة المجهر الكبير (الشكل 2C والشكل 3A). استخدم البراغي لتأمين الملحق عبر أربعة ثقوب لولبية موجودة في كل ركن من أركان الملحق (الشكل 2B-C).
ملاحظة: الملحق ثنائي الاتجاه ويمكن تدويره 180 درجة حسب اتجاه مرحلة المجهر وجهاز التخدير. - حرك لوحة التسخين في جانب قابس الإدخال لأسفل (الشكل 2 د) بحيث توضع الوحدة فوق أخاديد الإدخال السفلية مع مرور منفذ التوصيل أسفل المسرح (الشكل 3 ب).
- قم بمحاذاة الفتحة الدائرية المحززة في الملحق بهدف غمر زيت السيليكون 40x (الشكل 3C) وقم بتطبيق زيت السيليكون على مركز الهدف.
- في حالة التصوير على مدى فترات زمنية أطول (>1 ساعة) ، ضع كمية كبيرة من الزيت الذي سيستمر عند واجهة الغطاء / الهدف طوال التصوير. لا تسمح للزيت بالانسكاب على حواف العدسة.
- استخدم حقنة لتطبيق كمية صغيرة من شحم الفراغ على طول الفتحة الدائرية المحززة ووضع قرص غطاء الانزلاق فوقه لإغلاقه على الملحق (الشكل 3 د).
ملاحظة: يتم إنشاء قرص الغطاء عن طريق إزالة جدران طبق زراعة الخلايا ذات القاع الزجاجي مقاس 35 مم × 10 مم (يتم تنفيذه بواسطة ورشة آلات). - ارفع الهدف 40x حتى يقبل الزيت الجزء السفلي من الغطاء الزجاجي.
2. تكوين الأيزوفلوران وإعداد الماوس
- ضع مكونات المرذاذ الإلكتروني منخفض التدفق (غرفة التخدير ، الأنبوب ، المرذاذ ، علبة الفحم) للسماح لمخروط الأنف والأنابيب المتصلة بالوصول إلى الملحق (الشكل 3 أ).
تنبيه: Isoflurane هو مخدر استنشاق ويجب التعامل معه بحذر لتجنب الانسكابات وتقليل التعرض البشري. - قم بقياس وزن زجاجة الأيزوفلوران قبل الاستخدام والتسجيل. قم بتوصيل الغطاء من المرذاذ الإلكتروني بزجاجة الأيزوفلوران.
- قم بتوصيل سلك الطاقة بالمبخر الإلكتروني. أغلق مشابك مخروط الأنف الزرقاء وافتح مشابك غرفة الحث البيضاء للسماح بتدفق الهواء عبر الحجرة إلى علبة الفحم. قم بإزالة غطاء الهواء المحيط الأحمر من الجانب الأيسر من الماكينة للسماح بتدفق الهواء.
- اترك النظام يسخن لمدة 5 دقائق عند 200 مل / دقيقة (تدفق منخفض) و 2٪ إيزوفلوران.
ملاحظة: على الرغم من تحديد إعداد مخروط الأنف ، يجب أن يظل خط مخروط الأنف الأزرق مغلقا ، ويجب أن يظل خط غرفة الحث الأبيض مفتوحا. - بمجرد موازنة النظام بشكل صحيح ، قم بتطهير الخطوط لإزالة الأيزوفلوران المتبقي من الغرفة.
- ضع الماوس في غرفة الحث وحدد التدفق العالي. أكمل جميع تحضيرات الماوس (أي إزالة الشعر ، وتوصيل الدواء الموضعي ، وتطبيق مرهم العين ، وما إلى ذلك) قبل وضع جسم فوق الملحق. تأكد من تخدير الماوس بالكامل باستخدام طريقة منعكس قرصة إصبع القدم.
- مع تمديد الساق ، استخدم ظفرا لقرص إصبع القدم بإحكام دون التسبب في أضرار جسدية. إذا أظهر الفأر رد فعل إيجابي على التحفيز (أي تراجع الساق ، ارتعاش القدم ، إلخ) ، استمر في إعطاء مخدر داخل الغرفة حتى لا يلاحظ أي تفاعل. بمجرد تخديره بشكل مناسب ، يجب أن يتباطأ معدل تنفس الماوس إلى ~ 55-65 نفسا في الدقيقة18.
- عندما يتم تخدير الماوس بالكامل ، حدد High Flow مرة أخرى لإيقاف توصيل isoflurane. قم بتطهير الحجرة قبل الفتح واضبط المشابك (أزرق: مفتوح ؛ أبيض: مغلق) لتوصيل الأيزوفلوران عبر مخروط الأنف. حدد التدفق المنخفض أثناء توصيل مخروط الأنف بالماوس لمتابعة توصيل الأيزوفلوران.
- أنبوب إيزوفلوران خيطي مع مخروط الأنف المرفق من خلال قوس أنبوب الزاوية على الملحق (الشكل 3 أ والشكل 5).
3. وضع الماوس على إدراج للتصوير داخل الجسم
- قم بتوصيل لوحة الحرارة بوحدة التحكم (التي تحتوي على مسبار شرجي متصل) ، وقم بتشغيلها ، واترك اللوحة تصل إلى 36 درجة مئوية (الشكل 4 أ).
- قم بإزالة الماوس المخدر من غرفة الحث وضعه عبر لوحة الحرارة (الشكل 4B والشكل 5A). قم بإجراء النقل من الحجرة لإدخالها بسرعة لتقليل الوقت الذي يكون فيه الماوس نشطا دون تخدير استنشاقي.
- ثبت مخروط الأنف على الماوس (الشكل 4B و C والشكل 5). إذا لزم الأمر ، استخدم الشريط اللاصق لمزيد من تأمين زاوية مخروط الأنف وموضعه.
- أدخل المسبار الشرجي واضبط درجة حرارة وحدة التحكم حتى تستقر درجة حرارة جسم الماوس عند ~ 36 °C (الشكل 4A ، B). بعد وضع الماوس بشكل صحيح ، استخدم غلاف بلاستيكي لاحتجاز الحرارة ، إذا لزم الأمر ، لدعم درجة حرارة الجسم المناسبة (الشكل 4C).
- ضع الماوس بحيث يحاذي الرأس قرص غطاء الغطاء وشل حركة الأذن على وسط غطاء الغطاء الزجاجي باستخدام مشبك أذن معدني (الشكل 5 أ ، ب) أو شريط (الشكل 5 ج).
ملاحظة: يمكن ضبط ضغط مشبك الأذن المعدني على الأذن عن طريق فك المسمار الذي يثبت المشبك بالإدخال. يمكن إضافة زنبرك معدني لزيادة مرونة شد المشبك.- لتغيير موقع مشبك الأذن ، قم بفك البرغي بمفتاح ألين 2.5 مم وانقله إلى الموقع الثانوي (الشكل 2B ، C). عند إعادة تجميع مشبك الأذن ، ضع المشبك مقابل الملحق ، متبوعا بالغسالة في الأعلى. استخدم مسمارا لربط المشبك بإحكام بقوة طفيفة لتدوير المشبك.
- اضبط موضع z الموضوعي حتى تصبح الخلايا داخل المكان البؤري (الشكل 6A ، D). قم بتعيين معلمات z-stack والفاصل الزمني وفقا للأهداف التجريبية وابدأ في الحصول على الصور.
ملاحظة: إذا تم تحقيق الإعداد الصحيح ، فيمكن تصوير أذن الماوس لمدة 3 ساعات متتالية على الأقل (الشكل 6A '، D').- بمجرد تعيين حدود مكدس z ، اضبط طاقة الليزر والكسب لضمان عدم تشبع مستوى z لتقليل التبييض الضوئي. حدد معلمات الفاصل الزمني باستخدام السماكة الكلية لمكدس z وأرقام الخطوات (يوصى بأخذ عينات Nyquist) والفترات الزمنية.
- تحديد معلمات التصوير (الفترات الزمنية ، إجمالي وقت التصوير ، إلخ) باستخدام عوامل متعددة ، بما في ذلك صلاحية تحت التخدير ، والتبييض الضوئي / السمية الضوئية الناجم عن الليزر ، والهدف من التصوير الحي (أي ديناميكيات انقسام الخلايا ، والتفاعلات بين الخلايا والخلايا ، وما إلى ذلك).
4. إنهاء التصوير
- قم بتشغيل الوسادة الحرارية التي تدور حول الماء واضبطها على دورة مستمرة و 35 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة على الأقل قبل إنهاء التقاط الصورة.
- عند الانتهاء من التصوير ، حدد Low Flow على المرذاذ الإلكتروني لإيقاف توصيل isoflurane وحرك الماوس إلى وسادة حرارية حتى يصبح متنقلا.
- بمجرد الاستيقاظ ، حرك الماوس مرة أخرى إلى حاوية النقل مع الاستمرار في الحفاظ على وسادة حرارية حتى يصبح متنقلا بالكامل. راقب الماوس باستمرار أثناء وجوده على وسادة الحرارة حتى يستجيب.
- على المرذاذ الإلكتروني، انقر فوق تحديد القائمة > التحكم في التخدير > فارغ. قم بإزالة زجاجة الأيزوفلوران من النظام وضع غطاء الشركة المصنعة مرة أخرى على الزجاجة.
- قم بقياس وزن زجاجة الأيزوفلوران وعلبة الفحم وأدخل الأوزان في السجل. بمجرد أن تزن علبة الفحم 50 جم فوق قياس خط الأساس ، تخلص من العلبة واستبدلها بوحدة جديدة. أعد الأيزوفلوران إلى صندوق التأمين.
- قم بإزالة قرص قسيمة الغطاء وامسحه بورق العدسة ومحلول العدسة. تخزينها بشكل صحيح لتجنب الخدوش لإعادة استخدامها.
- قم بإزالة أنبوب التخدير من كتيفة الإدخال وفك الإدخال من مرحلة المجهر.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
يتم التحقق من صحة التجميع الصحيح لإدراج التصوير الحي على مجهر متحد البؤر مقلوب والاتجاه المناسب للماوس المعدل وراثيا فوق الملحق من خلال الحصول على أكوام z من أنسجة الأذن الحية ذات العلامات الفلورية على مدار فترة زمنية ≥1 ساعة مع الحد الأدنى من الأدلة على الانجراف في المحاور x و y و z. يجب التقاط الصور على فترات زمنية متسقة (يعتمد الوقت الفاصل الزمني على السؤال البيولوجي ، وقوة إشارة التألق ، وما إلى ذلك) بحيث يمكن تتبع ديناميكيات الخلية وانجراف الصورة بمرور الوقت. طوال الدورة الزمنية ، تكشف مراقبة الطائرات z الفردية لضمان بقائها في التركيز البؤري ما إذا كانت حركة تتداخل مع استقرار التصوير. يوضح الشكل 6 مثالا على بقاء طائرات z المفردة في التركيز على مدار دورة زمنية ممتدة باستخدام ملحق التصوير المباشر.
تم اختيار الصور من أربع نقاط زمنية مدتها 60 دقيقة معروضة في الشكل 6A 'من فيلم بفاصل زمني مدته 3 ساعات لخلايا البشرة mCherry + في أذن ماوس ذكر بالغ يبلغ من العمر 3 أشهر K14-H2B-mCherry (~ 30 جم) تم التقاطه على فترات زمنية مدتها دقيقتان باستخدام خطوة z تبلغ 0.246 ميكرومتر لتحقيق أخذ عينات Nyquist عبر عمق z إجمالي يبلغ 24 ميكرومتر (99 صورة z-stack تم الحصول عليها لكل نقطة زمنية).
تم اختيار الصور من أربع نقاط زمنية مدتها 60 دقيقة معروضة في الشكل 6D 'من فيلم بفاصل زمني لمدة 3 ساعات من الخلايا الليفية الجلدية GFP + في أذن أنثى بالغة تبلغ من العمر 8 أشهر Pdgfra: rtTA. pTRE: ماوس H2B-GFP (~ 30 جم ؛ الشكل 6 ب). تم التقاطها على فترات 5 دقائق باستخدام خطوة z من 2 ميكرومتر لتحقيق أخذ عينات Nyquist عبر عمق z إجمالي يبلغ 54 ميكرومتر (28 صورة z-stack تم الحصول عليها لكل نقطة زمنية). تم علاج هذا الفأر ب 2 ملغ من الدوكسيسيكلين كل يومين لمدة 6 أيام (أربعة علاجات ، إجمالي 8 ملغ) قبل التصوير (الشكل 6C).
الشكل 1: تصميم إدراج مرحلة مطبوعة 3D مخصصة. (أ ، ب) تصميم وأبعاد ملحق مخصص مطبوع ثلاثي الأبعاد مع فتحة صفيحة حرارية (A) ، بالإضافة إلى حامل سفلي للوحة الحرارة (B) ، والذي تتم طباعته بشكل منفصل ثم تثبيته في الملحق (انظر الملف التكميلي 1 المقابل والملف التكميلي 2 والملف التكميلي 3). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: إدراج المرحلة الجديدة يبسط التصوير داخل الجسم على المجاهر متحدة البؤر المقلوبة . (أ) إدراج يجري إنشاؤها باستخدام طابعة 3D. (ب) نموذج إدراج بسيط بدون جهاز تسخين ؛ يحتوي ملحق التصوير المباشر على أربعة مواقع لولبية (أسهم زرقاء) لربط مرحلة المجهر. يعمل مشبك الأذن المعدني على تسطيح الأذن وشل حركتها على قرص بلاستيكي بعرض 35 مم يحتوي على غطاء زجاجي بعرض 20 مم. يحتوي الملحق على خيارين لوضع مشبك الأذن لتوفير المرونة مع اتجاه الماوس. يسمح الوضع غير المتماثل للفتحة الموضوعية للماوس البالغ بالاستلقاء. تعمل الأقواس الجانبية على محاذاة مخروط الأنف إيزوفلوران وشل حركته لتسهيل تثبيت الماوس. يتطلب النموذج المبسط وضع وسادة تدفئة صغيرة (أو مصدر حرارة بديل) تحت الماوس للمساعدة في تنظيم درجة حرارة الجسم. (C) نموذج إدراج متقدم مع لوحة تسخين مدمجة. (د) يتم تركيب لوحة التسخين عن طريق الانزلاق في فتحة مخددة للملحق. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: ملحق التصوير داخل الجسم مثبت على مرحلة المجهر المقلوب. (أ) ملحق مركب على مرحلة المجهر المقلوب المقلوب المسح بالليزر. يسمح القرب من مبخر وغرفة الأيزوفلوران بخيوط الأنبوب المخروطي للأنف من خلال قوس الإدراج. ( ب) تمتد سدادة الصفيحة الحرارية أسفل مرحلة المجهر لتوصيلها بوحدة التحكم. (ج) محاذاة فتحة الإدخال مع هدف سيليكون 40x. (د) يتم وضع قرص بلاستيكي (قطره 35 مم) يحتوي على غطاء زجاجي (قطر 20 مم) فوق الفتحة المحززة لملحق المرحلة ومختوم في مكانه بشحم مفرغ. تم إنشاء قرص الغطاء عن طريق إزالة جدران طبق زراعة الخلايا ذات القاع الزجاجي 35 مم × 10 مم. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: مراقبة درجة حرارة جسم باستخدام وحدة تحكم في لوحة الحرارة. (أ) جهاز التحكم في لوحة الحرارة ، والذي يمكن تعديله لتثبيت درجة حرارة جسم الفأر عند 36 درجة مئوية المثلى طوال جلسة التصوير داخل الجسم. (ب) يستخدم مسبار شرجي لمراقبة درجة حرارة جسم الفأر بمجرد وضع الفأر فوق لوح الحرارة. (ج) يمكن استخدام غلاف بلاستيكي لاحتجاز الحرارة لرفع درجة حرارة جسم الفأر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: وضع الماوس على ملحق التصوير داخل الجسم . (أ) ينتشر جسم الفأر على طول الجزء العلوي من الصفيحة الحرارية، مع توسيط الأذن على الغطاء الزجاجي وتثبيته بمشبك أذن معدني. يضع القوس مخروط الأنف isoflurane لمرفق الماوس. (B) منطقة مكبرة من (A) تظهر تثبيت أذن الماوس مع مشبك أذن معدني على شريحة الغطاء الزجاجي وملحق مخروط أنف الأيزوفلوران بالماوس. (ج) يمكن استخدام الشريط كطريقة بديلة لتثبيت الأذن على الغطاء الزجاجي. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 6: يسهل الإدراج المخصص التصوير المستقر طويل المدى لبشرة أذن الفأر والخلايا الليفية . (أ) طائرة Z واحدة تم التقاطها من إجراء تصوير داخل الجسم على ظهارة بشرة الأذن لفأر معدل وراثيا يبلغ من العمر 3 أشهر K14-H2B-mCherry . يشير المربع المنقط إلى المنطقة المكبرة الموضحة في (A'). شريط المقياس = 50 ميكرومتر. (A') منطقة مكبرة من (A) تعرض الصور كل ساعة على مدار فيلم مدته 3 ساعات. شريط المقياس = 10 ميكرومتر. (ب) رسم تخطيطي للنظام المعدل وراثيا المحرض بالدوكسيسيكلين المستخدم لتعزيز وضع العلامات GFP في الجسم الحي على نوى الخلايا الليفية الجلدية. ج: الجدول الزمني لحقن الدوكسيسيكلين. (د) إسقاط أقصى كثافة (يمثل عمق z الكلي 54 ميكرومتر) للخلايا الليفية الجلدية التي تم التقاطها عن طريق إجراء تصوير داخل الجسم على أذن أنثى Pdgfra:rtTA البالغة من العمر 8 أشهر عن طريق حقن الدوكس ؛ pTRE: فأر معدل وراثيا H2B-GFP. يشير المربع المنقط إلى المنطقة المكبرة الموضحة في (D'). شريط المقياس = 50 ميكرومتر. (D') منطقة مكبرة من (D) تعرض الصور كل ساعة على فيلم مدته 3 ساعات. شريط المقياس = 10 ميكرومتر. توضح هذه الدورات الزمنية استقرار التصوير داخل الجسم على المدى الطويل باستخدام إدراج مخصص مطبوع 3D. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الملف التكميلي 1: ملف تصميم للإدراج المطبوع 3D مع فتحة لوحة الحرارة. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.
الملف التكميلي 2: ملف تصميم لحامل قاع لوحة الحرارة المطبوعة 3D. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.
الملف التكميلي 3: ملف تصميم للملحق المطبوع ثلاثي الأبعاد بدون فتح لوحة حرارية. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
في هذه الدراسة ، نقدم أداة جديدة تسهل التصوير المستقر والطويل الأمد داخل الجسم لظهارة جلد الفأر السليمة على المجاهر متحدة البؤر المقلوبة. يتكون هذا الاختراع من جيش التحرير الشعبى الصينى, وهو الأكثر شيوعا وغير مكلفة 3D المواد القابلة للطباعة; جميع تكاليف الطباعة ثلاثية الأبعاد الداخلية لهذا الإدراج تصل إلى < 5 دولارات. يمكن تجميع قطعتي الإدراج المنفصلتين (الشكل 1 والملف التكميلي 1 والملف التكميلي 2) بسهولة باستخدام مسامير مثبتة (انظر جدول المواد). والجدير بالذكر أنه يمكن أيضا استخدام ملفات .stl المتوفرة لطلب هذا الإدراج بالوسائل التجارية. خيار إضافي هو استخدام آلة التحكم العددي بالكمبيوتر (CNC) لتوليد إدخال من الألومنيوم المؤكسد ، على الرغم من أن هذا أكثر تكلفة بكثير.
لضمان تصوير موثوق وفعال على مدار فترة زمنية باستخدام هذه الأداة الجديدة ، من الأهمية بمكان تحديد حجم ملحق التصوير المباشر بشكل صحيح وفقا لمرحلة مجهر المستخدم. يمكن تكييف الملف التكميلي 1 والملف التكميلي 2 والملف التكميلي 3 لتعكس أبعاد الإدراج المناسبة المتوافقة مع المجهر المختار قبل الطباعة ثلاثية الأبعاد. تعمل أبعاد الإدخال الدقيقة مع قرص الغطاء الثابت على تقليل الانحراف الموضعي (x / y) والبؤري (z) طوال كل جلسة تصوير. من المهم أيضا التأكد من أن عمق الإدخال كاف لتمرير منفذ توصيل لوحة الحرارة أسفل المسرح.
قبل التصوير ، من الضروري التأكد من أن الفأر قد تم تخديره بالكامل ، وأن درجة حرارة جسمه تظل مستقرة عند ~ 36 درجة مئوية كما تم قياسها باستخدام مسبار مقياس الحرارة الشرجي ، وأن الأذن ثابتة بإحكام لتجنب الحركة بسبب التنفس. عند استخدام مشبك الأذن المعدني لتثبيت الأذن في غطاء الغطاء ، يجب على المرء منع قطع الدورة الدموية الطبيعية عن طريق التأكد من عدم ثمل مشبك الأذن بإحكام شديد. من الضروري أيضا مراقبة وتجديد مرهم العين على الماوس عند الضرورة للحفاظ على رطوبة العين أثناء جلسات التصوير الطويلة.
في حين أن تصميم الإدراج الفريد هذا يوفر نهجا جديدا للتصوير داخل الجسم ، إلا أنه يحتوي على بعض القيود الملحوظة. نظرا لانخفاض موضع الإدخال في مرحلة المجهر ، يجب أن تكون حركة المرحلة في المستويين x و y محدودة للغاية بعد وضع الهدف وإغلاق قرص الغطاء في مكانه. هذه الحركة المحدودة ضرورية لتجنب الإضرار بالهدف. علاوة على ذلك ، تجدر الإشارة إلى أن قرص الغطاء الزجاجي غير متوفر تجاريا حاليا. لإعادة إنشاء قرص قسيمة الغطاء المستخدم في هذه الدراسة ، قد يلزم التعاون مع ورشة الآلات.
بينما نثبت أن هذه الطريقة القائمة على التركيز يمكن أن تحقق تصويرا مستقرا طويل المدى في عمق الأنسجة السليمة ، تجدر الإشارة إلى أن المجاهر متعددة الفوتونات تسبب تلفا ضوئيا أقل وتخترق أعماق أكبر مقارنة بالأدوات متحدة البؤر19. لذلك ، تعتمد فائدة هذه الأداة على قوة إشارة التألق في النموذج الحيواني المعدل وراثيا المختار ، وكذلك عمق الأنسجة المطلوب لتحقيق الأهداف التجريبية. لذلك نوصي باستخدام أقل طاقة ليزر ممكنة لتقليل التبييض الضوئي مع تحقيق الدقة المطلوبة. من المهم أيضا أن تحتوي العدسة الشيئية المستخدمة مع هذا الملحق على N.A. عالية للحصول على دقة مثالية ، بالإضافة إلى مسافة عمل طويلة حتى تتمكن من الوصول إلى قرص الغطاء. وتجدر الإشارة إلى أن هذا النهج لا يقصد به أن يحل محل طريقة التصوير داخل الجسم القائمة على الفوتونات المستقيمة التي تم التحقق من صحتها جيدا والموضحة في Pineda et al. 6. بدلا من ذلك ، تهدف هذه الأداة الجديدة إلى توفير بديل فعال للمختبرات التي لا يمكنها الوصول إلى معدات متعددة الفوتونات ، وتفضل نظاما أقل تعقيدا ، و / أو تمتلك مجهرا مقلوبا.
أداتنا الجديدة قابلة للتخصيص بشكل ملحوظ وفقا للمتطلبات والتفضيلات التجريبية الفردية. يمكن استخدام هذا الملحق مع أو بدون صفيحة حرارية ، حيث تتضمن بعض الخيارات البديلة وضع وسادة تسخين رقيقة أسفل الماوس ، ولف عدسة موضوعية أكثر دفئا حول جذعها ، و / أو حبس الحرارة عن طريق تغطية الماوس بغلاف بلاستيكي (الشكل 4C). علاوة على ذلك ، يمكن استخدام الشريط مع مشبك الأذن أو بدلا منه لتوفير التثبيت الأمثل للأنسجة (الشكل 5C). اتجاه إدراج المرحلة قابل للعكس ، بحيث يمكن للمستخدم أن يقرر ما إذا كان من الأفضل توجيه فتحة الهدف على الجانب الأيمن أو الأيسر. علاوة على ذلك ، يحتوي الملحق على خيارات وضع بديلة مدمجة لمشبك الأذن وأنبوب الأيزوفلوران لتوفير أقصى قدر من المرونة بناء على اتجاه الماوس المطلوب (تصوير الأذن اليمنى مقابل اليسرى) ، وموقع إعداد الأيزوفلوران ، وتكوينات مجهرية محددة (الشكل 2C). الملحق قابل للتثبيت والإزالة بسهولة ، مع تصميم مبسط يهدف إلى أن يكون سهل الاستخدام للغاية بحيث يمكن جعل التصوير داخل الجسم قابلا للوصول حتى إلى المجهريين المبتدئين. بالإضافة إلى ذلك ، يوفر الثقب الموضوعي الموضعي غير المتماثل القدرة على تصوير نماذج حيوانية متنوعة بالإضافة إلى أعضاء ذات أحجام مختلفة.
نعتزم أن يعزز هذا الاختراع تطبيق الفحص المجهري داخل المختبرات الفردية وكذلك نوى النسخ المجهرية التي تحتوي على أدوات متحدة البؤر مقلوبة. ستوفر هذه الأداة التي يمكن الوصول إليها والقابلة للتخصيص للمحققين حرية تصور ديناميكيات الخلايا الحية عبر أنظمة الأعضاء المتنوعة للكشف عن رؤى بيولوجية مهمة للخلايا.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للكشف عنه.
Acknowledgments
نشكر فالنتينا جريكو على الفئران K14-mCherry-H2B. نحن ممتنون لورشة آلات قسم الفيزياء بجامعة إيموري لتوليد أقراص الغطاء الزجاجي. تم تمويل هذا العمل من قبل جائزة التطوير الوظيفي #IK2 BX005370 من خدمة BLRD التابعة لوزارة شؤون المحاربين القدامى الأمريكية إلى LS ، وجوائز NIH RF1-AG079269 و R56-AG072473 إلى MJMR ، وجائزة I3 Emory SOM / GT الحاسوبية وتحليل البيانات إلى MJMR.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3D Printer | Qudi Tech | i-Fast | 3D prints using PLA material |
| 40x 1.25NA silicone objective lens | Nikon | ||
| AxR Laser Scanning Confocal Microscope | Nikon | ||
| Cotton Tipped Swab | VWR | 76337-046 | Cream/ointment application |
| Doxycycline hyclate | Sigma-Aldrich | D9891 | Induces GFP labeling of fibroblast nuclei in Pdgfra-rtTA; pTRE-H2B-GFP mice |
| Flathead Screwdriver (2.5 mm) | Affiix insert to microscope stage | ||
| Flathead Screws x 4 (#6-32) | Nikon | Screw insert into microscope stage | |
| Glass Bottom Culture Dish | chemglass Life Sciences | CLS-1811-002 | Modified by removing walls of dish for use as coverslip disk compatible with live insert; 35 mm wide disk contains 20 mm wide glass coverslip; dish walls were removed by machine shop |
| Heat Plate controller | Physitemp | TCAT-2LV | Animal Temperature Controller - Low Voltage; anal prob attachment for mouse body temperature monitoring |
| Hex Wrench (1.5 mm) | For M3 setscrew adjustments | ||
| Hex Wrench (2.5 mm) | Adjust tension on metal ear clip | ||
| Intravital Imaging Insert | |||
| Isoflurane | Med-Vet International | HPA030782-100uL | Mouse anesthesia |
| Labeling Tape (or Scotch Tape) | VWR | 10127-458 | Alternative to metal ear clip to immobilize ear to coverslip |
| Metal fastener | used as ear clip | ||
| Mouse: C57BL/6-Pdgfraem1(rtTA)Xsun/J | The Jackson Laboratory | RRID: IMSR_JAX:034459 | Fibrroblast-specific promoter driving doxycycline-inducible rtTA expression |
| Mouse: K14-H2BPAmCherry | Courtesy of Dr. Valentina Greco at Yale University | Labels epidermal epithelial cell nuclei with mCherry; referred to in text as "K14-H2B-mCherry" | |
| Mouse: pTRE-H2B-GFP: STOCK Tg(tetO-HIST1H2BJ/GFP)47Efu/J |
The Jackson Laboratory | RRID: IMSR_JAX:005104 | Labels fibroblast nuclei with GFP when combined with Pdgfra-rtTA and induced with doxycycline |
| Multipurpose Sealing Wrap | Glad | Enhance mouse warmth | |
| Optixcare | VWR | MSPP-078932779 | Eye lubricant |
| Set screws x 3 (M3; 6 mm) | Thorlabs | SS3M6 | Attachment for heatplate module |
| Silicone Immersion Oil | Applied to 40x silicone objective | ||
| Small Animal Heating Plate | Physitemp | HP-4M | Provides heat to animal |
| Somnoflow Low-Flow Electronic Vaporizer | Kent Scientific | SF-01 | Mouse anesthesia |
| Vacuum Grease | Flinn Scientific | AP1095 | Seals coverslip disk to insert |
| Veet | hair removal | ||
| Water circulating heat pad | Stryker Medical | TP700 | for mouse revival post-imaging |
References
- Babes, L., Yipp, B. G., Senger, D. L. Intravital microscopy of the metastatic pulmonary environment. Methods in Molecular Biology. , 383-396 (2023).
- Nal Chen,, et al. Neutrophils promote glioblastoma tumor cell migration after biopsy. Cells. 11 (14), 2196 (2022).
- Courson, J. A., Langlois, K. W., Lam, F. W. Intravital microscopy to study platelet-leukocyte-endothelial interactions in the mouse liver. Journal of Visualized Experiments. 188 (188), (2022).
- Rios, A. C., van Rheenen, J., Scheele, C. L. G. J.
- Fischer, M., Edelblum, K. L. Intravital microscopy to visualize murine small intestinal intraepithelial lymphocyte migration. Current Protocols. 2 (8), (2022).
- Pineda, C. M., et al. Intravital imaging of hair follicle regeneration in the mouse. Nature Protocols. 10 (7), 1116-1130 (2015).
- Entenberg, D., Oktay, M. H., Condeelis, J. S. Intravital imaging to study cancer progression and metastasis. Nature Reviews. Cancer. 23 (1), 25-42 (2023).
- Turk, M., Biernaskie, J., Mahoney, D. J., Jenne, C. N. Intravital microscopy techniques to image wound healing in mouse skin. Methods in Molecular Biology. , 165-180 (2022).
- Pal Arndt,, et al. A quantitative 3D intravital look at the juxtaglomerular renin-cell-niche reveals an individual intra/extraglomerular feedback system. Frontiers in Physiology. 13, 980787 (2022).
- Oal Yam, A., et al. Neutrophil conversion to a tumor-killing phenotype underpins effective microbial therapy. Cancer Research. 83 (8), 1315-1328 (2023).
- Huang, S., Rompolas, P. Two-photon microscopy for intracutaneous imaging of stem cell activity in mice. Experimental Dermatology. 26 (5), 379-383 (2017).
- Durr, N. J., Weisspfennig, C. T., Holfeld, B. A., Ben-Yakar, A. Maximum imaging depth of two-photon autofluorescence microscopy in epithelial tissues. Journal of Biomedical Optics. 16 (2), 026008 (2011).
- Tauer, U. Advantages and risks of multiphoton microscopy in physiology. Experimental Physiology. 87 (6), 709-714 (2002).
- Yoshitake, T., et al. Direct comparison between confocal and multiphoton microscopy for rapid histopathological evaluation of unfixed human breast tissue. Journal of Biomedical Optics. 21 (12), 126021 (2016).
- Mesa, K., Rompolas, P., Zito, G., et al. Niche-induced cell death and epithelial phagocytosis regulate hair follicle stem cell pool. Nature. 522, 94-97 (2015).
- Ral Li,, et al. Pdgfra marks a cellular lineage with distinct contributions to myofibroblasts in lung maturation and injury response. eLife. 7, (2018).
- Tal Tumbar,, et al. Defining the epithelial stem cell niche in skin. Science. 303 (5656), 359-363 (2004).
- Ewald, A. J., Werb, Z., Egeblad, M. Monitoring of vital signs for long-term survival of mice under anesthesia. Cold Spring Harbor Protocols. 2 (2), 5563 (2011).
- Sanderson, J.
