Summary
Het protocol presenteert een nieuw hulpmiddel om intravitale beeldvorming te vereenvoudigen met behulp van omgekeerde confocale microscopie.
Abstract
Het begrijpen van normaal en afwijkend in vivo celgedrag is noodzakelijk om klinische interventies te ontwikkelen om het ontstaan en de progressie van de ziekte te dwarsbomen. Het is daarom van cruciaal belang om beeldvormingsbenaderingen te optimaliseren die de observatie van celdynamiek in situ vergemakkelijken, waarbij de weefselstructuur en -samenstelling onverstoord blijven. De epidermis is de buitenste barrière van het lichaam en de bron van de meest voorkomende vormen van kanker bij de mens, namelijk huidcarcinomen. De toegankelijkheid van huidweefsel biedt een unieke kans om het gedrag van epitheel- en dermale cellen bij intacte dieren te volgen met behulp van niet-invasieve intravitale microscopie. Desalniettemin is deze geavanceerde beeldvormingsbenadering voornamelijk bereikt met behulp van rechtopstaande multifotonmicroscopen, die voor de meeste onderzoekers een belangrijke toetredingsdrempel vormen. Deze studie presenteert een op maat ontworpen, 3D-geprinte microscooptafel die geschikt is voor gebruik met omgekeerde confocale microscopen, waardoor de intravitale beeldvorming op lange termijn van de oorhuid bij levende transgene muizen wordt gestroomlijnd. Wij zijn van mening dat deze veelzijdige uitvinding, die kan worden aangepast aan het merk en model van de omgekeerde microscoop naar keuze en kan worden aangepast om extra orgaansystemen in beeld te brengen, van onschatbare waarde zal zijn voor de grotere wetenschappelijke onderzoeksgemeenschap door de toegankelijkheid van intravitale microscopie aanzienlijk te verbeteren. Deze technologische vooruitgang is van cruciaal belang voor het versterken van ons begrip van de dynamiek van levende cellen in normale en ziektecontexten.
Introduction
Intravitale microscopie is een krachtig hulpmiddel waarmee het gedrag van cellen in hun onverstoorbare in vivo omgevingen kan worden gevolgd. Deze unieke methode heeft belangrijke inzichten opgeleverd in de innerlijke werking van complexe orgaansystemen van zoogdieren, waaronder de long1, de hersenen2, de lever3, de borstklier4, de darm5 en de huid6. Bovendien heeft deze aanpak veranderingen in het celgedrag tijdens de ontwikkeling van tumoren7, wondgenezing8,9, ontsteking10 en andere uiteenlopende pathologieën in situ aan het licht gebracht. In deze studie richten we ons op het verbeteren van de toegankelijkheid van intravitale microscopie om levende epitheliale en stromale dynamiek in intacte muizenhuid in beeld te brengen. Het begrijpen van celgedrag in de huid van zoogdieren is van groot klinisch belang vanwege de opmerkelijke regeneratieve en tumorigene capaciteit van dit weefsel.
Intravitale beeldvorming bij muizen is voornamelijk uitgevoerd met behulp van rechtopstaande multifotonenmicroscopen vanwege hun vermogen om beeldvorming met hoge resolutie te bieden op weefseldiepten >100 μm11,12. Desalniettemin missen deze instrumenten de veelzijdigheid van het werkpaard en de meer algemene toegankelijkheid van omgekeerde confocale microscopen, die gebruiksvriendelijker en kosteneffectiever zijn, de mogelijkheid bieden om gekweekte cellen in beeld te brengen, geen volledige duisternis vereisen tijdens beeldacquisitie en over het algemeen veiliger zijn, naast andere opmerkelijke voordelen13,14. In deze studie presenteren we een nieuw hulpmiddel dat de toegankelijkheid van intravitale beeldvorming aanzienlijk verbetert door deze benadering aan te passen voor omgekeerde confocale microscopen.
Hier presenteren we een 3D-geprint ontwerp van een op maat gemaakt inzetstuk dat verschillende belangrijke kenmerken bevat om stabiele, langdurige intravitale beeldvorming van de huid van muizenoren op een omgekeerde confocale microscoop mogelijk te maken (Figuur 1, Figuur 2, Figuur 3, Figuur 4 en Figuur 5). Deze gespecialiseerde functies omvatten een offset-objectiefgat waardoor het volledige lichaam van een volwassen muis volledig plat kan liggen tijdens beeldvorming. Dit minimaliseert de trillingsinterferentie van lichaamsbewegingen van muizen op beeldvorming en elimineert de noodzaak om ketamine en xylazine toe te dienen om de ademhaling te dempen, een praktijk die vaak gepaard gaat met intravitale beeldvorming6. Bovendien positioneren hoekbeugels op het inzetstuk een isofluraanneuskegel correct om uit te lijnen met het gezicht van de muis, immobiliseert een metalen oorclip het muisoor op een op maat gemaakte dekglaasje en ligt een optionele afneembare biofeedback-warmteplaat met gesloten lus vlak in het inzetstuk om de lichaamstemperatuur van de muis te ondersteunen tijdens lange beeldvormingssessies. De op maat gemaakte dekglaasjeschijf, die een plat oppervlak biedt dat essentieel is voor het hoofd en het oor van de muis om plat te liggen, werd gegenereerd in een machinewerkplaats door de wanden van een generiek dekglaasje met celkweekschaal te verwijderen. Het gebruik van een 40x siliconen olie-immersielens (1,25 numerieke apertuur [N.A.], 0,3 mm werkafstand) in combinatie met de dekglaasjesschijf en het op maat gemaakte podiuminzetstuk zorgt voor beelden met een hoge resolutie >50 μm diep in de oordermis.
Om de functionaliteit van dit nieuwe omgekeerde microscooptafelinzetstuk te testen, hebben we z-stacks vastgelegd die alle epidermale epitheellagen overspannen gedurende een tijdsverloop van 3 uur in het oor van een levende transgene K14-H2B-mCherry15 volwassen muis (epitheelkernen in deze muislijn bevatten een rood fluorescerend label) (Figuur 6A-A'). We hebben ook z-stacks vastgelegd die verschillende fibroblastlagen in de huiddermis overspannen gedurende een tijdsverloop van 3 uur in het oor van een levende transgene Pdgfra-rtTA16; pTRE-H2B-GFP17 volwassen muis (fibroblastkernen in deze muizenlijn bevatten een groen fluorescerend label na doxycycline-inductie) (Figuur 6B-D'). Onze gegevens met hoge resolutie tonen een consistente stabiliteit aan door gebrek aan drift in de x-, y- en z-vlakken, en bewijzen zo de effectiviteit van dit nieuwe intravitale beeldvormingsinstrument voor gebruik op omgekeerde microscopen. Belangrijk is dat de afmetingen van dit 3D-geprinte podiuminzetstuk kunnen worden aangepast, zoals beschreven in Aanvullend bestand 1, Aanvullend bestand 2 en Aanvullend bestand 3, zodat het op elke omgekeerde microscoop past, en dat de positionering van de objectiefopening kan worden verplaatst naar alternatieve locaties binnen het inzetstuk om beter geschikt te zijn voor het afbeelden van een bepaald weefsel en/of diermodel van belang. Deze uitvinding kan dus individuele laboratoria, of onderzoekers met confocale toegang tot kernfaciliteiten, in staat stellen dit instrument aan te passen aan hun unieke intravitale beeldvormingsbehoeften, waardoor de evaluatie van diverse in vivo celbiologie wordt gestroomlijnd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Dit onderzoek is uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen voor dierenverzorging en -gebruik van Emory University en Atlanta Veterans Affairs Medical Center en is goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC).
1. Het live beeldvormingsinzetstuk installeren op de omgekeerde microscooptafel
- Construeer het inlegvel met behulp van .stl-bestanden (aanvullend bestand 1, aanvullend bestand 2 en aanvullend bestand 3) met vermelding van de 3D-afmetingen en het ontwerp (zie afbeelding 1 en afbeelding 2A), een 3D-printer en polymelkzuur (PLA).
- Plaats het inzetstuk (Figuur 2B,C) voorzichtig in de grote groef van de microscooptafel (Figuur 2C en Figuur 3A). Gebruik schroeven om het inzetstuk vast te zetten via vier schroefgaten in elke hoek van het inzetstuk (Figuur 2B-C).
NOTITIE: Het inzetstuk is bidirectioneel en kan 180° worden gedraaid, afhankelijk van de oriëntatie van de microscooptafel en het anesthesieapparaat. - Schuif de warmteplaat met de kant naar beneden in de plugzijde van het inzetstuk (Figuur 2D) zodat het apparaat bovenop de onderste inzetgroeven ligt met de stekkerpoort onder de tafel door (Figuur 3B).
- Lijn de gegroefde ronde opening in het inzetstuk uit met een 40x onderdompelingsobjectief voor siliconenolie (Figuur 3C) en breng siliconenolie aan op het midden van het objectief.
- Als u gedurende langere perioden (>1 uur) beeldvorming maakt, breng dan een flinke klodder olie aan die tijdens de beeldvorming op het dekglaasje/objectief-interface blijft staan. Zorg ervoor dat er geen olie over de randen van de lens wordt gemorst.
- Gebruik een injectiespuit om een kleine hoeveelheid vacuümvet langs de gegroefde ronde opening aan te brengen en leg de dekglaasjesschijf erop om het inzetstuk af te dichten (Figuur 3D).
OPMERKING: De dekglaasjesschijf wordt gemaakt door de wanden van een celkweekschaal van 35 mm x 10 mm met glazen bodem te verwijderen (uitgevoerd door een machinewerkplaats). - Til het 40x objectief op totdat de olie de onderkant van het glazen dekglaasje kust.
2. Isofluraanconfiguratie en muisvoorbereiding
- Plaats de elektronische verdampercomponenten met laag debiet (anesthesiekamer, slang, verdamper, houtskoolbus) zodat de neuskegel en de bevestigde slang het inzetstuk kunnen bereiken (Figuur 3A).
LET OP: Isofluraan is een inhalatie-anestheticum en moet met zorg worden behandeld om morsen te voorkomen en menselijke blootstelling tot een minimum te beperken. - Meet voor gebruik het gewicht van de isofluraanfles en log deze uit. Bevestig de dop van de elektronische vaporizer aan de isofluraanfles.
- Sluit het netsnoer aan op de elektronische vaporizer. Sluit de blauwe neuskegelclips en open de witte inductiekamerclips om luchtstroom door de kamer in de houtskoolbus mogelijk te maken. Verwijder de rode omgevingsluchtkap aan de linkerkant van de machine om luchtstroom mogelijk te maken.
- Laat het systeem 5 minuten opwarmen met 200 ml/min (laag debiet) en 2% isofluraan.
NOTITIE: Hoewel de instelling van de neuskegel is geselecteerd, moet de blauwe neuskegellijn gesloten blijven en moet de witte inductiekamerlijn open blijven. - Zodra het systeem goed in evenwicht is, verwijdert u de leidingen om de resterende isofluraan uit de kamer te verwijderen.
- Plaats de muis in de inductiekamer en selecteer High Flow. Voltooi alle muizenvoorbereidingen (d.w.z. ontharen, plaatselijke medicijnafgifte, aanbrengen van oogzalf, enz.) voordat het lichaam van het dier op de insert wordt gelegd. Controleer of de muis volledig verdoofd is met behulp van de teenknijpreflexmethode.
- Gebruik met het been gestrekt een vingernagel om de teen stevig vast te knijpen zonder fysieke schade aan te richten. Als de muis een positieve reactie op de stimulus vertoont (d.w.z. terugtrekking van de benen, spiertrekkingen van de voet, enz.), Ga dan door met het toedienen van verdoving in de kamer totdat er geen reactie wordt waargenomen. Eenmaal op de juiste manier verdoofd, zou de ademhalingsfrequentie van de muis moeten vertragen tot ~55-65 ademhalingen per minuut18.
- Wanneer de muis volledig is verdoofd, selecteert u opnieuw High Flow om de toediening van isofluraan te stoppen. Leeg de kamer voordat u deze opent en pas de clips aan (blauw: open; wit: gesloten) om isofluraan door de neuskegel af te geven. Selecteer Low Flow terwijl de neuskegel aan de muis is bevestigd om door te gaan met de toediening van isofluraan.
- Rijg isofluraanslang met de bevestigde neuskegel door de hoekslangbeugel op het inzetstuk (Figuur 3A en Figuur 5).
3. Plaatsing van de muis op het inzetstuk voor intravitale beeldvorming
- Sluit de warmteplaat aan op de controller (met een aangesloten anale sonde), schakel hem in en laat de plaat 36 °C bereiken (Figuur 4A).
- Haal de verdoofde muis uit de inductiekamer en leg hem over de warmteplaat (Figuur 4B en Figuur 5A). Voer de overdracht van kamer naar inbrenging snel uit om de tijd dat de muis actief is zonder inhalatie-anesthesie te minimaliseren.
- Bevestig de neuskegel op de muis (Figuur 4B, C en Figuur 5). Gebruik indien nodig tape om de hoek en positionering van de neuskegel verder vast te zetten.
- Plaats de anale sonde en pas de temperatuur van de controller aan totdat de lichaamstemperatuur van de muis stabiel is op ~36 °C (Figuur 4A,B). Nadat de muis correct is gepositioneerd, gebruikt u indien nodig plastic huishoudfolie om warmte vast te houden om de juiste lichaamstemperatuur verder te ondersteunen (Figuur 4C).
- Plaats de muis zo dat de kop is uitgelijnd met de dekglaasjesschijf en immobiliseer het oor op het midden van het glazen dekglaasje met behulp van een metalen oorclip (Figuur 5A,B) of tape (Figuur 5C).
NOTITIE: De druk van de metalen oorclip op het oor kan worden aangepast door de schroef los te draaien waarmee de clip aan het inzetstuk is bevestigd. Er kan een metalen veer worden toegevoegd voor meer flexibiliteit bij het aandraaien van de clip.- Om de locatie van de oorclip te wijzigen, draait u de bout los met een 2.5 mm inbussleutel en brengt u deze over naar de secundaire plaats (Figuur 2B,C). Wanneer u de oorclip weer in elkaar zet, plaatst u de clip tegen het inzetstuk, gevolgd door de ring erop. Gebruik een bout om de clip stevig vast te maken met lichte kracht om de clip te draaien.
- Pas de z-positionering van het objectief aan totdat de cellen zich binnen de brandpuntsafstand bevinden (Figuur 6A,D). Stel de z-stack- en time-lapse-parameters in volgens de experimentele doelen en begin met beeldacquisitie.
NOTITIE: Als de juiste instelling is bereikt, kan het oor van de muis gedurende ten minste 3 opeenvolgende uren worden afgebeeld (Figuur 6A',D').- Zodra de grenzen van de z-stack zijn ingesteld, past u het laservermogen en de versterking aan om ervoor te zorgen dat geen enkel z-vlak oververzadigd raakt om fotobleken te minimaliseren. Bepaal de time-lapse-parameters met behulp van de totale dikte van de z-stack, stapnummers (Nyquist-bemonstering aanbevolen) en tijdsintervallen.
- Bepaal de beeldvormingsparameters (tijdsintervallen, totale beeldvormingstijd, enz.) met behulp van meerdere factoren, waaronder levensvatbaarheid van dieren onder anesthesie, lasergeïnduceerde fotobleking/fototoxiciteit en het doel van live beeldvorming (d.w.z. dynamiek van celdeling, cel-celinteracties, enz.).
4. Beëindiging van de beeldvorming
- Schakel het watercirculerende warmtekussen in en stel het in op Continue cyclus en 35 °C gedurende ten minste 30 minuten voordat de beeldacquisitie wordt beëindigd.
- Selecteer na voltooiing van de beeldvorming Low Flow op de elektronische verdamper om de afgifte van isofluraan te stoppen en verplaats de muis naar een warmtekussen totdat hij ambulant is.
- Eenmaal wakker, beweegt u de muis terug naar de transfercontainer terwijl u op een warmtekussen blijft totdat u volledig ambulant bent. Houd de muis consequent in de gaten terwijl u op het warmtekussen ligt totdat deze reageert.
- Klik op de elektronische vaporizer op Menu selecteren > Verdovingscontrole > Leegmaken. Verwijder de isofluraanfles uit het systeem en plaats de dop van de fabrikant terug op de fles.
- Meet het gewicht van de isofluraanfles en de houtskoolbus en voer de gewichten in het logboek in. Zodra de houtskoolbus 50 g weegt ten opzichte van de nulmeting, gooit u de bus weg en vervangt u deze door een nieuw apparaat. Doe de isofluraan terug in het lockbox.
- Verwijder het dekglaasje en veeg schoon met lenspapier en lenzenvloeistof. Op de juiste manier bewaren om krassen voor hergebruik te voorkomen.
- Verwijder de anesthesieslang van de insteekbeugel en schroef de insteekplaats los van de microscooptafel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De juiste montage van het live imaging-inzetstuk op een omgekeerde confocale microscoop en de juiste oriëntatie van een transgene muis bovenop het inzetstuk wordt gevalideerd door het verkrijgen van z-stapels fluorescerend gelabeld, levend oorweefsel gedurende een tijdsverloop ≥1 uur met minimaal bewijs van drift in de x-, y- en z-as. Beelden moeten met consistente tussenpozen worden vastgelegd (intervaltijd hangt af van de biologische vraag, sterkte van het fluorescentiesignaal, enz.), zodat celdynamiek en beelddrift in de loop van de tijd kunnen worden gevolgd. Gedurende de hele tijd laat het monitoren van individuele z-vlakken om ervoor te zorgen dat ze scherp blijven, zien of de beweging van dieren de beeldstabiliteit verstoort. Een voorbeeld van enkele z-vlakken die gedurende een langere tijdspanne scherp blijven met behulp van het live imaging-inzetstuk wordt weergegeven in figuur 6.
Beelden van vier tijdstippen van 60 minuten weergegeven in figuur 6A' werden geselecteerd uit een time-lapse-film van 3 uur van mCherry+ epidermale cellen in het oor van een volwassen K14-H2B-mCherry-muis van 3 maanden oud (~30 g), vastgelegd met tussenpozen van 2 minuten met behulp van een z-stap van 0,246 μm om Nyquist-bemonstering te verkrijgen over een totale z-diepte van 24 μm (99 z-stack-beelden verkregen per tijdstip).
Beelden van vier tijdstippen van 60 minuten weergegeven in figuur 6D' werden geselecteerd uit een time-lapse-film van 3 uur van GFP+ dermale fibroblasten in het oor van een 8 maanden oude volwassen vrouwelijke Pdgfra:rtTA; pTRE:H2B-GFP-muis (~30 g; Figuur 6B). Deze werden vastgelegd met tussenpozen van 5 minuten met behulp van een z-stap van 2 μm om Nyquist-bemonstering te bereiken over een totale z-diepte van 54 μm (28 z-stackbeelden verkregen per tijdstip). Deze muis werd behandeld met 2 mg doxycycline om de dag gedurende 6 dagen (vier behandelingen, 8 mg in totaal) voorafgaand aan beeldvorming (Figuur 6C).
Afbeelding 1: Aangepast 3D-geprint podiuminzetstuk. (A,B) Ontwerp en afmetingen van een aangepast, 3D-geprint inzetstuk met een opening van een warmteplaat (A), evenals een bodemhouder voor een warmteplaat (B), die afzonderlijk wordt afgedrukt en vervolgens in het inzetstuk wordt geschroefd (zie het bijbehorende aanvullende bestand 1, aanvullend bestand 2 en aanvullend bestand 3). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Nieuwe fase-insert stroomlijnt intravitale beeldvorming op omgekeerde confocale microscopen . (A) Insert wordt geconstrueerd met behulp van een 3D-printer. (B) Eenvoudig inzetmodel zonder verwarmingsapparaat; Het Live Imaging-inzetstuk bevat vier schroefplaatsen (blauwe pijlen) voor bevestiging van de microscooptafel. De metalen oorclip maakt het oor plat en immobiliseert het op een 35 mm brede plastic schijf met daarin een 20 mm breed glazen dekglaasje. Het inzetstuk bevat twee opties voor het plaatsen van de oorclip om flexibiliteit te bieden bij de oriëntatie van de muis. Door de asymmetrische plaatsing van het objectiefgat kan de volwassen muis plat liggen. Zijbeugels lijnen de isofluraanneuskegel uit en immobiliseren deze om de bevestiging van de muis te vergemakkelijken. Het vereenvoudigde model vereist de plaatsing van een klein verwarmingskussen (of alternatieve warmtebron) onder de muis om de lichaamstemperatuur te helpen reguleren. (C) Geavanceerd inzetmodel met een ingebouwde warmteplaat. (D) De warmteplaat wordt geïnstalleerd door in een gegroefde opening van het inzetstuk te schuiven. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Afbeelding 3: Intravitaal beeldvormingsinzetstuk geïnstalleerd op een omgekeerde microscooptafel . (A) Inzetstuk gemonteerd op de objecttafel van een omgekeerde confocale microscoop met laserscanning. De nabijheid van de isofluraanverdamper en de kamer maakt het mogelijk om de neuskegelslang door de insteekbeugel te halen. (B) De stekker van de warmteplaat steekt uit onder de microscooptafel om verbinding te maken met de controller. (C) Het insteekgat is uitgelijnd met een 40x siliconen objectief. (D) Een plastic schijf (diameter 35 mm) met daarin een glazen dekglaasje (diameter 20 mm) wordt bovenop de gegroefde opening van het objectieel geplaatst en op zijn plaats verzegeld met vacuümvet. De dekglaasjesschijf is gemaakt door de wanden van een celkweekschaal van 35 mm x 10 mm met glazen bodem te verwijderen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Afbeelding 4: Bewaking van de lichaamstemperatuur van het dier met behulp van een warmteplaatcontroller. (A) Warmteplaatcontroller, die kan worden aangepast om de lichaamstemperatuur van de muis te stabiliseren op de optimale 36 °C tijdens de intravitale beeldvormingssessie. (B) Een anale sonde wordt gebruikt om de lichaamstemperatuur van de muis te controleren zodra de muis bovenop de warmteplaat is gelegd. (C) Plastic huishoudfolie kan worden gebruikt om warmte vast te houden om de lichaamstemperatuur van de muis verder te verhogen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Afbeelding 5: Positionering van de muis op het intravitale beeldvormingsinzetstuk. (A) Het muislichaam wordt langs de bovenkant van de warmteplaat uitgespreid, met het oor gecentreerd op het glazen dekglaasje en geïmmobiliseerd met een metalen oorclip. De beugel positioneert de isofluraan neuskegel voor muisbevestiging. (B) Ingezoomd gebied van (A) met immobilisatie van het oor van de muis met een metalen oorclip op het glazen dekglaasje en de isofluraan neuskegelbevestiging aan de muis. (C) Tape kan worden gebruikt als een alternatieve methode voor oorimmobilisatie op het glazen dekglaasje. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Afbeelding 6: Aangepast inzetstuk vergemakkelijkt stabiele intravitale beeldvorming op lange termijn van de epidermis en fibroblasten van het oor van muizen. (A) Een enkel z-vlak vastgelegd van het uitvoeren van intravitale beeldvorming op het epidermale epitheel van het oor van een 3 maanden oude volwassen mannelijke K14-H2B-mCherry transgene muis. Het gestippelde vak geeft het ingezoomde gebied aan dat wordt weergegeven in (A'). Schaalbalk = 50 μm. (A') Ingezoomd gebied van (A) met elk uur beelden gedurende een film van 3 uur. Schaalbalk = 10 μm. (B) Schema van het doxycycline-induceerbare transgene systeem dat wordt gebruikt om in vivo GFP-etikettering van dermale fibroblastkernen te bevorderen. (C) Tijdlijn van doxycycline-injecties. (D) Projectie van maximale intensiteit (wat neerkomt op een totale z-diepte van 54 μm) van dermale fibroblasten die zijn vastgelegd door intravitale beeldvorming uit te voeren op het oor van een met dox geïnjecteerd vrouwtje van 8 maanden oud Pdgfra:rtTA; pTRE: H2B-GFP transgene muis. Het gestippelde vak geeft het ingezoomde gebied aan dat wordt weergegeven in (D'). Schaalbalk = 50 μm. (D') Ingezoomd gebied van (D) met elk uur beelden gedurende een film van 3 uur. Schaalbalk = 10 μm. Deze tijdcursussen demonstreren de stabiliteit van intravitale beeldvorming op lange termijn met behulp van het 3D-geprinte aangepaste inzetstuk. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Aanvullend bestand 1: Ontwerpbestand voor het 3D-geprinte inzetstuk met een opening van de warmteplaat. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullend bestand 2: Ontwerpbestand voor de 3D-geprinte bodemhouder van de warmteplaat. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullend bestand 3: Ontwerpbestand voor het 3D-geprinte inzetstuk zonder opening van de warmteplaat. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In deze studie presenteren we een nieuw hulpmiddel dat stabiele, langdurige intravitale beeldvorming van intacte epitheel van de huid van muizen mogelijk maakt op omgekeerde confocale microscopen. Deze uitvinding is gemaakt van PLA, het meest voorkomende en goedkope 3D-printbare materiaal; alle in-house 3D-printkosten voor deze insert bedragen <$5. De twee afzonderlijke insteekstukken (afbeelding 1, aanvullende vijl 1 en aanvullende vijl 2) kunnen eenvoudig worden gemonteerd met behulp van stelschroeven (zie materiaaltabel). Met name de meegeleverde .stl-bestanden kunnen ook worden gebruikt om deze insert op commerciële wijze te bestellen. Een extra optie is om een computer numerieke besturing (CNC) machine te gebruiken om de wisselplaat uit geanodiseerd aluminium te genereren, hoewel dit aanzienlijk duurder is.
Om betrouwbare en efficiënte beeldvorming gedurende een bepaalde tijd met behulp van deze nieuwe tool te garanderen, is het van cruciaal belang om het live imaging-inzetstuk op de juiste maat te maken volgens het microscoopstadium van de gebruiker. Het meegeleverde aanvullende bestand 1, aanvullend bestand 2 en aanvullend bestand 3 kunnen worden aangepast om de juiste inzetstukken weer te geven die compatibel zijn met de microscoop van keuze voorafgaand aan het 3D-printen. Nauwkeurige wisselplaatafmetingen met een geïmmobiliseerde dekglaasjesschijf minimaliseren positionele (x/y) en focale (z) drift tijdens elke beeldvormingssessie. Het is ook belangrijk om ervoor te zorgen dat de insteekdiepte voldoende is om de plugpoort van de warmteplaat onder de tafel door te voeren.
Voorafgaand aan de beeldvorming is het essentieel om te bevestigen dat de muis volledig verdoofd is, dat de lichaamstemperatuur stabiel blijft op ~36 °C zoals gemeten met de anale thermometersonde, en dat het oor stevig geïmmobiliseerd is om beweging als gevolg van ademhaling te voorkomen. Wanneer u de metalen oorclip gebruikt om het oor aan het dekglaasje te bevestigen, moet men voorkomen dat de normale bloedcirculatie wordt afgesneden door ervoor te zorgen dat de oorklem niet te strak wordt vastgeschroefd. Het is ook van cruciaal belang om de oogzalf op de muis te controleren en aan te vullen wanneer dat nodig is om het oogvocht op peil te houden tijdens lange beeldvormingssessies.
Hoewel dit unieke insert-ontwerp een nieuwe benadering biedt voor intravitale beeldvorming, heeft het een paar opmerkelijke beperkingen. Vanwege de lage positionering van het inzetstuk in de microscooptafel, zou de beweging van de objecttafel in het x- en y-vlak zeer beperkt moeten zijn nadat het objectief is gepositioneerd en de dekglaasjesschijf op zijn plaats is verzegeld. Deze beperkte beweging is van cruciaal belang om schade aan het doel te voorkomen. Bovendien moet worden opgemerkt dat de glazen dekglaasjesschijf momenteel niet in de handel verkrijgbaar is. Om de dekglaasjesschijf die in dit onderzoek is gebruikt, na te maken, kan samenwerking met een machinewerkplaats nodig zijn.
Hoewel we aantonen dat deze confocale methode stabiele beeldvorming op lange termijn diep in intact weefsel kan bereiken, moet worden opgemerkt dat multifotonenmicroscopen minder fotoschade veroorzaken en tot grotere diepten doordringen in vergelijking met confocale instrumenten19. Daarom is het nut van deze tool afhankelijk van de sterkte van het fluorescentiesignaal in het transgene diermodel naar keuze, evenals de weefseldiepte die nodig is om de experimentele doelen te bereiken. We raden daarom aan om het laagst mogelijke laservermogen te gebruiken om fotobleken te minimaliseren en tegelijkertijd de gewenste resolutie te bereiken. Het is ook belangrijk dat de objectieflens die met dit inzetstuk wordt gebruikt, een hoge N.A. heeft voor een optimale resolutie, evenals een lange werkafstand zodat deze de dekglaasjesschijf kan bereiken. Opgemerkt moet worden dat deze benadering niet bedoeld is ter vervanging van de goed gevalideerde rechtopstaande multifoton-gebaseerde intravitale beeldvormingsmethode beschreven in Pineda et al. 6. In plaats daarvan is deze nieuwe tool bedoeld om een effectief alternatief te bieden voor laboratoria die geen toegang hebben tot multifotonapparatuur, de voorkeur geven aan een minder omslachtig systeem en/of een omgekeerde microscoop bezitten.
Onze nieuwe tool is opmerkelijk aanpasbaar aan geïndividualiseerde experimentele vereisten en voorkeuren. Dit inzetstuk kan met of zonder warmteplaat worden gebruikt, aangezien enkele alternatieve opties het plaatsen van een dun verwarmingskussen onder de muis zijn, het wikkelen van een objectieflenswarmer om de romp en/of het vasthouden van warmte door de muis af te dekken met plastic huishoudfolie (Figuur 4C). Bovendien kan tape worden gebruikt in combinatie met of in plaats van de oorclip om optimale weefselimmobilisatie te bieden (Figuur 5C). De oriëntatie van het tafelinzetstuk is omkeerbaar, zodat de gebruiker kan beslissen of het optimaal is om het objectiefgat aan de rechter- of linkerkant te oriënteren. Bovendien heeft het inzetstuk ingebouwde alternatieve plaatsingsopties voor de oorclip en isofluraanslang om maximale flexibiliteit te bieden op basis van de gewenste muisoriëntatie (beeldvorming van het rechter- versus linkeroor), locatie van isofluraanopstelling en specifieke microscoopconfiguraties (Figuur 2C). Het inzetstuk is eenvoudig te installeren en te verwijderen, met een vereenvoudigd ontwerp dat bedoeld is om zeer gebruiksvriendelijk te zijn, zodat intravitale beeldvorming zelfs voor beginnende microscopisten toegankelijk kan worden gemaakt. Bovendien biedt het asymmetrisch gelokaliseerde objectiefgat de mogelijkheid om diverse diermodellen en organen van verschillende groottes in beeld te brengen.
Het is de bedoeling dat deze uitvinding de toepassing van intravitale microscopie binnen individuele laboratoria verbetert, evenals microkopieerkernen die omgekeerde confocale instrumenten bevatten. Deze zeer toegankelijke en aanpasbare tool biedt onderzoekers de vrijheid om de dynamiek van levende cellen in verschillende orgaansystemen te visualiseren om belangrijke celbiologische inzichten te onthullen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben geen belangenconflicten om bekend te maken.
Acknowledgments
Wij danken Valentina Greco voor de K14-mCherry-H2B muizen. We zijn de Emory University Physics Department Machine Shop dankbaar voor het genereren van de glazen dekglaasjes. Dit werk werd gefinancierd door de Career Development Award #IK2 BX005370 van het Amerikaanse Department of Veterans Affairs BLRD Service aan LS, NIH Awards RF1-AG079269 en R56-AG072473 aan MJMR, en I3 Emory SOM / GT Computational and Data Analysis Award aan MJMR.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3D Printer | Qudi Tech | i-Fast | 3D prints using PLA material |
| 40x 1.25NA silicone objective lens | Nikon | ||
| AxR Laser Scanning Confocal Microscope | Nikon | ||
| Cotton Tipped Swab | VWR | 76337-046 | Cream/ointment application |
| Doxycycline hyclate | Sigma-Aldrich | D9891 | Induces GFP labeling of fibroblast nuclei in Pdgfra-rtTA; pTRE-H2B-GFP mice |
| Flathead Screwdriver (2.5 mm) | Affiix insert to microscope stage | ||
| Flathead Screws x 4 (#6-32) | Nikon | Screw insert into microscope stage | |
| Glass Bottom Culture Dish | chemglass Life Sciences | CLS-1811-002 | Modified by removing walls of dish for use as coverslip disk compatible with live insert; 35 mm wide disk contains 20 mm wide glass coverslip; dish walls were removed by machine shop |
| Heat Plate controller | Physitemp | TCAT-2LV | Animal Temperature Controller - Low Voltage; anal prob attachment for mouse body temperature monitoring |
| Hex Wrench (1.5 mm) | For M3 setscrew adjustments | ||
| Hex Wrench (2.5 mm) | Adjust tension on metal ear clip | ||
| Intravital Imaging Insert | |||
| Isoflurane | Med-Vet International | HPA030782-100uL | Mouse anesthesia |
| Labeling Tape (or Scotch Tape) | VWR | 10127-458 | Alternative to metal ear clip to immobilize ear to coverslip |
| Metal fastener | used as ear clip | ||
| Mouse: C57BL/6-Pdgfraem1(rtTA)Xsun/J | The Jackson Laboratory | RRID: IMSR_JAX:034459 | Fibrroblast-specific promoter driving doxycycline-inducible rtTA expression |
| Mouse: K14-H2BPAmCherry | Courtesy of Dr. Valentina Greco at Yale University | Labels epidermal epithelial cell nuclei with mCherry; referred to in text as "K14-H2B-mCherry" | |
| Mouse: pTRE-H2B-GFP: STOCK Tg(tetO-HIST1H2BJ/GFP)47Efu/J |
The Jackson Laboratory | RRID: IMSR_JAX:005104 | Labels fibroblast nuclei with GFP when combined with Pdgfra-rtTA and induced with doxycycline |
| Multipurpose Sealing Wrap | Glad | Enhance mouse warmth | |
| Optixcare | VWR | MSPP-078932779 | Eye lubricant |
| Set screws x 3 (M3; 6 mm) | Thorlabs | SS3M6 | Attachment for heatplate module |
| Silicone Immersion Oil | Applied to 40x silicone objective | ||
| Small Animal Heating Plate | Physitemp | HP-4M | Provides heat to animal |
| Somnoflow Low-Flow Electronic Vaporizer | Kent Scientific | SF-01 | Mouse anesthesia |
| Vacuum Grease | Flinn Scientific | AP1095 | Seals coverslip disk to insert |
| Veet | hair removal | ||
| Water circulating heat pad | Stryker Medical | TP700 | for mouse revival post-imaging |
References
- Babes, L., Yipp, B. G., Senger, D. L. Intravital microscopy of the metastatic pulmonary environment. Methods in Molecular Biology. , 383-396 (2023).
- Nal Chen,, et al. Neutrophils promote glioblastoma tumor cell migration after biopsy. Cells. 11 (14), 2196 (2022).
- Courson, J. A., Langlois, K. W., Lam, F. W. Intravital microscopy to study platelet-leukocyte-endothelial interactions in the mouse liver. Journal of Visualized Experiments. 188 (188), (2022).
- Rios, A. C., van Rheenen, J., Scheele, C. L. G. J.
- Fischer, M., Edelblum, K. L. Intravital microscopy to visualize murine small intestinal intraepithelial lymphocyte migration. Current Protocols. 2 (8), (2022).
- Pineda, C. M., et al. Intravital imaging of hair follicle regeneration in the mouse. Nature Protocols. 10 (7), 1116-1130 (2015).
- Entenberg, D., Oktay, M. H., Condeelis, J. S. Intravital imaging to study cancer progression and metastasis. Nature Reviews. Cancer. 23 (1), 25-42 (2023).
- Turk, M., Biernaskie, J., Mahoney, D. J., Jenne, C. N. Intravital microscopy techniques to image wound healing in mouse skin. Methods in Molecular Biology. , 165-180 (2022).
- Pal Arndt,, et al. A quantitative 3D intravital look at the juxtaglomerular renin-cell-niche reveals an individual intra/extraglomerular feedback system. Frontiers in Physiology. 13, 980787 (2022).
- Oal Yam, A., et al. Neutrophil conversion to a tumor-killing phenotype underpins effective microbial therapy. Cancer Research. 83 (8), 1315-1328 (2023).
- Huang, S., Rompolas, P. Two-photon microscopy for intracutaneous imaging of stem cell activity in mice. Experimental Dermatology. 26 (5), 379-383 (2017).
- Durr, N. J., Weisspfennig, C. T., Holfeld, B. A., Ben-Yakar, A. Maximum imaging depth of two-photon autofluorescence microscopy in epithelial tissues. Journal of Biomedical Optics. 16 (2), 026008 (2011).
- Tauer, U. Advantages and risks of multiphoton microscopy in physiology. Experimental Physiology. 87 (6), 709-714 (2002).
- Yoshitake, T., et al. Direct comparison between confocal and multiphoton microscopy for rapid histopathological evaluation of unfixed human breast tissue. Journal of Biomedical Optics. 21 (12), 126021 (2016).
- Mesa, K., Rompolas, P., Zito, G., et al. Niche-induced cell death and epithelial phagocytosis regulate hair follicle stem cell pool. Nature. 522, 94-97 (2015).
- Ral Li,, et al. Pdgfra marks a cellular lineage with distinct contributions to myofibroblasts in lung maturation and injury response. eLife. 7, (2018).
- Tal Tumbar,, et al. Defining the epithelial stem cell niche in skin. Science. 303 (5656), 359-363 (2004).
- Ewald, A. J., Werb, Z., Egeblad, M. Monitoring of vital signs for long-term survival of mice under anesthesia. Cold Spring Harbor Protocols. 2 (2), 5563 (2011).
- Sanderson, J.
