Summary
Das Protokoll stellt ein neues Werkzeug zur Vereinfachung der intravitalen Bildgebung mittels invertierter konfokaler Mikroskopie dar.
Abstract
Das Verständnis des normalen und aberranten Verhaltens von In-vivo-Zellen ist notwendig, um klinische Interventionen zu entwickeln, die den Ausbruch und das Fortschreiten der Krankheit vereiteln. Daher ist es von entscheidender Bedeutung, bildgebende Verfahren zu optimieren, die die Beobachtung der Zelldynamik in situ ermöglichen, wo die Gewebestruktur und -zusammensetzung ungestört bleiben. Die Epidermis ist die äußerste Barriere des Körpers und die Quelle der häufigsten Krebserkrankungen des Menschen, nämlich des Hautkarzinoms. Die Zugänglichkeit von Hautgewebe bietet eine einzigartige Möglichkeit, das Verhalten von Epithel- und Hautzellen bei intakten Tieren mit nicht-invasiver intravitaler Mikroskopie zu überwachen. Nichtsdestotrotz wurde dieser ausgeklügelte Bildgebungsansatz in erster Linie mit aufrechten Multiphotonenmikroskopen erreicht, die für die meisten Forscher eine erhebliche Eintrittsbarriere darstellen. In dieser Studie wird ein speziell entwickelter, 3D-gedruckter Mikroskoptischeinsatz vorgestellt, der für die Verwendung mit inversen konfokalen Mikroskopen geeignet ist und die intravitale Langzeitbildgebung der Ohrhaut in lebenden transgenen Mäusen optimiert. Wir glauben, dass diese vielseitige Erfindung, die an die Marke und das Modell des inversen Mikroskops angepasst und an die Abbildung zusätzlicher Organsysteme angepasst werden kann, sich als unschätzbar wertvoll für die größere wissenschaftliche Forschungsgemeinschaft erweisen wird, indem sie die Zugänglichkeit der intravitalen Mikroskopie erheblich verbessert. Dieser technologische Fortschritt ist entscheidend für unser Verständnis der Dynamik lebender Zellen in normalen und krankheitsbedingten Kontexten.
Introduction
Die intravitale Mikroskopie ist ein leistungsfähiges Werkzeug, das die Überwachung des Zellverhaltens in ihrer ungestörten In-vivo-Umgebung ermöglicht. Diese einzigartige Methode hat wichtige Einblicke in das Innenleben komplexer Organsysteme von Säugetieren geliefert, darunter Lunge1, Gehirn2, Leber3, Brustdrüse4, Darm5 und Haut6. Darüber hinaus hat dieser Ansatz Zellverhaltensänderungen während der Tumorentwicklung7, der Wundheilung8,9, der Entzündung10 und anderer verschiedener Pathologien in situ aufgedeckt. In dieser Studie konzentrieren wir uns auf die Verbesserung der Zugänglichkeit der intravitalen Mikroskopie zur Abbildung von Live-Epithel- und Stromadynamik in intakter Maushaut. Das Verständnis des Zellverhaltens in der Haut von Säugetieren ist aufgrund der bemerkenswerten regenerativen und tumorigenen Fähigkeit dieses Gewebes von großer klinischer Bedeutung.
Die intravitale Bildgebung bei Mäusen wurde hauptsächlich mit aufrechten Multiphotonenmikroskopen durchgeführt, da diese eine hochauflösende Bildgebung in Gewebetiefen >100 μm ermöglichen11,12. Nichtsdestotrotz fehlt diesen Instrumenten die Vielseitigkeit und allgemeinere Zugänglichkeit von inversen konfokalen Mikroskopen, die benutzerfreundlicher und kostengünstiger sind, die Möglichkeit bieten, kultivierte Zellen abzubilden, bei der Bildaufnahme keine völlige Dunkelheit erfordern und im Allgemeinen sicherer sind, neben anderen bemerkenswerten Vorteilen13,14. In dieser Studie stellen wir ein neues Werkzeug vor, das die Zugänglichkeit der intravitalen Bildgebung erheblich verbessert, indem es diesen Ansatz für inverse konfokale Mikroskope adaptiert.
Hier präsentieren wir ein 3D-gedrucktes, kundenspezifisches Tischeinsatzdesign, das mehrere Schlüsselfunktionen enthält, um eine stabile, langfristige intravitale Bildgebung der Ohrhaut von Mäusen auf einem inversen konfokalen Mikroskop zu ermöglichen (Abbildung 1, Abbildung 2, Abbildung 3, Abbildung 4 und Abbildung 5). Zu diesen speziellen Merkmalen gehört ein versetztes Objektivloch, das es ermöglicht, dass der gesamte Körper einer erwachsenen Maus während der Bildgebung völlig flach liegt. Dies minimiert die Vibrationsstörung der Körperbewegungen von Mäusen bei der Bildgebung und eliminiert die Notwendigkeit, Ketamin und Xylazin zu verabreichen, um die Atmung zu dämpfen, eine Praxis, die oft mit intravitaler Bildgebung gekoppelt ist6. Darüber hinaus positionieren Eckklammern am Einsatz einen Isofluran-Nasenkonus korrekt, um sich an der Vorderseite der Maus auszurichten, ein Ohrclip aus Metall immobilisiert das Mausohr an einer speziell angefertigten Deckglasscheibe, und eine optionale abnehmbare Biofeedback-Heizplatte mit geschlossenem Regelkreis liegt bündig im Einsatz, um die Körpertemperatur der Maus bei langen Bildgebungssitzungen zu unterstützen. Die maßgeschneiderte Deckglasscheibe, die eine flache Oberfläche bietet, die für das flache Liegen des Mauskopfes und des Ohrs unerlässlich ist, wurde in einer Maschinenwerkstatt hergestellt, indem die Wände einer generischen Deckglasschale mit Zellkulturschalen entfernt wurden. Die Verwendung einer 40-fachen Silikonöl-Immersionslinse (1,25 numerische Apertur [N.A.], 0,3 mm Arbeitsabstand) in Verbindung mit der Deckglasscheibe und dem benutzerdefinierten Tischeinsatz liefert hochauflösende Bilder >50 μm tief in die Ohrdermis.
Um die Funktionalität dieses neuen inversen Mikroskoptischeinsatzes zu testen, haben wir Z-Stapel, die alle epidermalen Epithelschichten umfassen, über einen Zeitverlauf von 3 Stunden im Ohr einer lebenden transgenen K14-H2B-mCherry15 adulten Maus aufgenommen (Epithelkerne in dieser Mauslinie enthalten eine rot fluoreszierende Markierung) (Abbildung 6A-A'). Wir haben auch Z-Stapel aufgenommen, die sich über mehrere Fibroblastenschichten innerhalb der Hautdermis erstrecken, über einen Zeitverlauf von 3 Stunden im Ohr eines lebenden transgenen Pdgfra-rtTA16; pTRE-H2B-GFP17 adulte Maus (Fibroblastenkerne in dieser Mauslinie enthalten nach Doxycyclin-Induktion eine grün fluoreszierende Markierung) (Abbildung 6B-D'). Unsere hochauflösenden Daten zeigen eine gleichbleibende Stabilität durch keine Drift in der x-, y- und z-Ebene und belegen damit die Wirksamkeit dieses neuen intravitalen Bildgebungswerkzeugs für den Einsatz an inversen Mikroskopen. Wichtig ist, dass die Abmessungen dieses 3D-gedruckten Tischeinsatzes angepasst werden können, wie in Zusatzdatei 1, Zusatzdatei 2 und Zusatzdatei 3 beschrieben, um in jedes inverse Mikroskop zu passen, und die Positionierung der Objektivöffnung kann an alternative Stellen innerhalb des Einsatzes verschoben werden, um der Abbildung eines bestimmten Gewebe- und/oder Tiermodells von Interesse besser gerecht zu werden. Diese Erfindung kann somit einzelne Laboratorien oder Forscher mit konfokalem Zugang zu Kerneinrichtungen in die Lage versetzen, dieses Werkzeug an ihre einzigartigen intravitalen Bildgebungsanforderungen anzupassen und dadurch die Bewertung verschiedener In-vivo-Zellbiologie zu rationalisieren.
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Protocol
Diese Forschung wurde in Übereinstimmung mit den Richtlinien der Emory University und des Atlanta Veterans Affairs Medical Center für die Pflege und Verwendung von Tieren durchgeführt und vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) genehmigt.
1. Einbau des Live-Imaging-Einsatzes auf den inversen Mikroskoptisch
- Erstellen Sie die Einfügung mithilfe von STL-Dateien (Ergänzungsdatei 1, Ergänzungsdatei 2 und Ergänzungsdatei 3), die die 3D-Abmessungen und das Design angeben (siehe Abbildung 1 und Abbildung 2A), einen 3D-Drucker und Polymilchsäure (PLA).
- Setzen Sie den Einsatz (Abbildung 2B,C) vorsichtig in die große Nut des Mikroskoptisches ein (Abbildung 2C und Abbildung 3A). Befestigen Sie den Einsatz mit Schrauben über vier Schraubenlöcher in jeder Ecke des Einsatzes (Abbildung 2B-C).
HINWEIS: Der Einsatz ist bidirektional und kann je nach Ausrichtung des Mikroskoptisches und des Anästhesiegeräts um 180° gedreht werden. - Schieben Sie die Heizplatte mit der Seite nach unten in den Einsatzstopfen (Abbildung 2D), sodass das Gerät auf den unteren Einsatznuten liegt und der Steckeranschluss unter dem Tisch verläuft (Abbildung 3B).
- Richten Sie die gerillte kreisförmige Öffnung im Einsatz mit einem 40-fachen Silikonöl-Tauchobjektiv aus (Abbildung 3C) und tragen Sie Silikonöl auf die Mitte des Objektivs auf.
- Wenn Sie über einen längeren Zeitraum (>1 h) fotografieren, tragen Sie einen großzügigen Klecks Öl auf, der während der gesamten Bildgebung an der Schnittstelle zwischen Deckglas und Objektiv verbleibt. Achten Sie darauf, dass kein Öl über die Ränder des Objektivs läuft.
- Tragen Sie mit einer Spritze eine kleine Menge Vakuumfett entlang der gerillten kreisförmigen Öffnung auf und legen Sie die Deckglasscheibe darauf, um den Einsatz zu versiegeln (Abbildung 3D).
HINWEIS: Die Deckglasscheibe wird hergestellt, indem die Wände einer 35 mm x 10 mm großen Zellkulturschale mit Glasboden entfernt werden (durchgeführt von einer Maschinenwerkstatt). - Heben Sie das 40-fache Objektiv an, bis das Öl die Unterseite des Deckglases küsst.
2. Isofluran-Konfiguration und Mausvorbereitung
- Positionieren Sie die Komponenten des elektronischen Verdampfers mit geringem Durchfluss (Anästhesiekammer, Schlauch, Verdampfer, Aktivkohlekanister) so, dass der Nasenkonus und der angeschlossene Schlauch den Einsatz erreichen können (Abbildung 3A).
VORSICHT: Isofluran ist ein Inhalationsanästhetikum und sollte mit Vorsicht gehandhabt werden, um ein Verschütten zu vermeiden und die Exposition des Menschen zu minimieren. - Messen Sie das Gewicht der Isofluranflasche vor Gebrauch und protokollieren Sie. Befestigen Sie die Kappe des elektronischen Vaporizers an der Isofluranflasche.
- Schließen Sie das Netzkabel an den elektronischen Vaporizer an. Schließen Sie die blauen Nasenkonus-Clips und öffnen Sie die weißen Induktionskammer-Clips, um einen Luftstrom durch die Kammer in den Aktivkohlekanister zu ermöglichen. Entfernen Sie die rote Umgebungsluftkappe von der linken Seite des Geräts, um den Luftstrom zu ermöglichen.
- Lassen Sie das System 5 Minuten lang bei 200 ml/min (geringer Durchfluss) und 2 % Isofluran aufwärmen.
HINWEIS: Obwohl die Nasenkonuseinstellung ausgewählt ist, sollte die blaue Nasenkonusleitung geschlossen bleiben und die weiße Induktionskammerleitung offen bleiben. - Sobald das System richtig ausbalanciert ist, spülen Sie die Leitungen, um das verbleibende Isofluran aus der Kammer zu entfernen.
- Platzieren Sie die Maus in der Induktionskammer und wählen Sie High Flow. Schließen Sie alle Vorbereitungen für die Maus ab (d. h. Haarentfernung, topische Verabreichung von Medikamenten, Auftragen von Augensalbe usw.), bevor Sie den Körper des Tieres auf den Einsatz legen. Vergewissern Sie sich, dass die Maus vollständig betäubt ist, indem Sie die Zehenkneifreflexmethode anwenden.
- Verwenden Sie mit gestrecktem Bein einen Fingernagel, um den Zeh fest einzuklemmen, ohne körperliche Schäden zu verursachen. Wenn die Maus eine positive Reaktion auf den Reiz zeigt (z. B. Zurückziehen des Beins, Zucken des Fußes usw.), setzen Sie die Verabreichung des Anästhetikums in der Kammer fort, bis keine Reaktion mehr beobachtet wird. Nach entsprechender Betäubung sollte sich die Atemfrequenz der Maus auf ~55-65 Atemzüge pro Minute verlangsamen18.
- Wenn die Maus vollständig betäubt ist, wählen Sie erneut High Flow, um die Isofluran-Verabreichung zu stoppen. Spülen Sie die Kammer vor dem Öffnen und stellen Sie die Clips (blau: offen; weiß: geschlossen) so ein, dass Isofluran durch den Nasenkonus abgegeben wird. Wählen Sie Low Flow, während der Nasenkonus an der Maus befestigt ist, um die Verabreichung von Isofluran fortzusetzen.
- Isofluran-Schlauch mit dem aufgesetzten Nasenkonus durch die Eckrohrhalterung am Einsatz führen (Abbildung 3A und Abbildung 5).
3. Platzierung der Maus auf dem Einsatz für die intravitale Bildgebung
- Schließen Sie die Heizplatte an den Controller an (mit angeschlossener Analsonde), schalten Sie sie ein und lassen Sie die Platte 36 °C erreichen (Abbildung 4A).
- Nehmen Sie die betäubte Maus aus der Induktionskammer und legen Sie sie quer über die Heizplatte (Abbildung 4B und Abbildung 5A). Führen Sie den Transfer von der Kammer zum Einsetzen schnell durch, um die Zeit zu minimieren, in der die Maus ohne Inhalationsanästhesie aktiv ist.
- Befestigen Sie den Nasenkonus an der Maus (Abbildung 4B, C und Abbildung 5). Verwenden Sie bei Bedarf Klebeband, um den Winkel und die Positionierung des Nasenkonus weiter zu sichern.
- Führen Sie die Analsonde ein und stellen Sie die Temperatur des Reglers ein, bis die Körpertemperatur der Maus stabil bei ~36 °C liegt (Abbildung 4A,B). Nachdem die Maus richtig positioniert ist, verwenden Sie bei Bedarf eine Frischhaltefolie, um die Wärme einzufangen und die entsprechende Körpertemperatur weiter zu unterstützen (Abbildung 4C).
- Positionieren Sie die Maus so, dass der Kopf mit der Deckglasscheibe ausgerichtet ist, und fixieren Sie das Ohr mit einem Ohrclip aus Metall (Abbildung 5A,B) oder Klebeband (Abbildung 5C) in der Mitte des Deckglases.
HINWEIS: Der Druck des Ohrclips aus Metall auf das Ohr kann durch Lösen der Schraube, mit der der Clip am Einsatz befestigt ist, eingestellt werden. Eine Metallfeder kann hinzugefügt werden, um die Flexibilität beim Anziehen des Clips zu erhöhen.- Um die Position des Ohrclips zu ändern, lösen Sie die Schraube mit einem 2,5-mm-Inbusschlüssel und übertragen Sie sie an die sekundäre Stelle (Abbildung 2B,C). Wenn Sie den Ohrclip wieder zusammenbauen, legen Sie den Clip an den Einsatz, gefolgt von der Unterlegscheibe darauf. Befestigen Sie den Clip mit einer Schraube mit leichtem Kraftaufwand, um den Clip zu schwenken.
- Passen Sie die Z-Positionierung des Objektivs an, bis sich die Zellen innerhalb der Fokusposition befinden (Abbildung 6A,D). Stellen Sie den Z-Stapel und die Zeitrafferparameter entsprechend den experimentellen Zielen ein und beginnen Sie mit der Bildaufnahme.
HINWEIS: Wenn die richtige Einstellung erreicht ist, kann das Mausohr für mindestens 3 aufeinanderfolgende Stunden abgebildet werden (Abbildung 6A',D').- Sobald die Z-Stack-Grenzen festgelegt sind, passen Sie die Laserleistung und -verstärkung an, um sicherzustellen, dass keine Z-Ebene übersättigt ist, um das Photobleaching zu minimieren. Bestimmen Sie die Zeitrafferparameter anhand der Gesamtdicke des Z-Stapels, der Schrittnummern (Nyquist-Abtastung empfohlen) und der Zeitintervalle.
- Bestimmen Sie die Bildgebungsparameter (Zeitintervalle, Gesamtbildgebungszeit usw.) anhand mehrerer Faktoren, einschließlich der Lebensfähigkeit des Tieres unter Narkose, laserinduzierter Photobleichung/Phototoxizität und des Ziels der Live-Bildgebung (d. h. Zellteilungsdynamik, Zell-Zell-Interaktionen usw.).
4. Beendigung der Bildgebung
- Schalten Sie das wasserumwälzende Heizkissen ein und stellen Sie es mindestens 30 Minuten lang auf Dauerzyklus und 35 °C ein, bevor die Bildaufnahme beendet wird.
- Wählen Sie nach Abschluss der Bildgebung Low Flow auf dem elektronischen Vaporizer, um die Isofluran-Abgabe zu stoppen, und bewegen Sie die Maus auf ein Wärmekissen, bis sie gehfähig ist.
- Sobald Sie wach sind, bewegen Sie die Maus zurück zum Transferbehälter, während Sie sie weiterhin auf einem Wärmekissen halten, bis Sie vollständig gehfähig sind. Überwachen Sie die Maus konsequent, während sie sich auf dem Wärmekissen befindet, bis sie reagiert.
- Klicken Sie auf dem elektronischen Vaporizer auf Menü auswählen > Anästhesiesteuerung > leer. Nehmen Sie die Isofluranflasche aus dem System und setzen Sie die Kappe des Herstellers wieder auf die Flasche.
- Messen Sie das Gewicht der Isofluranflasche und des Aktivkohlekanisters und tragen Sie die Gewichte in das Protokoll ein. Sobald der Aktivkohlekanister 50 g über dem Ausgangswert wiegt, entsorgen Sie den Kanister und ersetzen Sie ihn durch ein neues Gerät. Lege das Isofluran zurück in den Tresorkasten.
- Entfernen Sie das Deckglas und wischen Sie es mit Linsenpapier und Linsenlösung ab. Richtig lagern, um Kratzer bei der Wiederverwendung zu vermeiden.
- Entfernen Sie den Anästhesieschlauch aus der Einsatzhalterung und schrauben Sie den Einsatz vom Mikroskoptisch ab.
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Representative Results
Die korrekte Montage des Live-Imaging-Einsatzes auf einem inversen konfokalen Mikroskop und die geeignete Ausrichtung einer transgenen Maus auf dem Einsatz wird durch die Erfassung von Z-Stapeln von fluoreszenzmarkiertem, lebendem Ohrgewebe über einen Zeitverlauf von ≥1 h mit minimalen Anzeichen einer Drift in der x-, y- und z-Achse validiert. Die Bilder sollten in gleichmäßigen Intervallen aufgenommen werden (die Intervallzeit hängt von der biologischen Fragestellung, der Stärke des Fluoreszenzsignals usw. ab), damit die Zelldynamik und die Bilddrift im Laufe der Zeit verfolgt werden können. Während des gesamten Zeitverlaufs zeigt die Überwachung einzelner Z-Ebenen, um sicherzustellen, dass sie im Fokus bleiben, ob Tierbewegungen die Bildstabilität beeinträchtigen. Ein Beispiel für einzelne Z-Ebenen, die über einen längeren Zeitverlauf mit dem Live-Imaging-Einsatz im Fokus bleiben, ist in Abbildung 6 dargestellt.
Bilder von vier 60-Minuten-Zeitpunkten, die in Abbildung 6A' gezeigt werden, wurden aus einem 3-stündigen Zeitrafferfilm von mCherry+-Epidermiszellen im Ohr einer 3 Monate alten männlichen männlichen K14-H2B-mCherry-Maus (~30 g) ausgewählt, die in 2-Minuten-Intervallen mit einem z-Schritt von 0,246 μm aufgenommen wurden, um eine Nyquist-Probenahme über eine Gesamttiefe von 24 μm (99 Z-Stapelbilder pro Zeitpunkt) zu erreichen.
Bilder von vier 60-minütigen Zeitpunkten, die in Abbildung 6D' gezeigt werden, wurden aus einem 3-stündigen Zeitrafferfilm von GFP+ dermalen Fibroblasten im Ohr einer 8 Monate alten erwachsenen weiblichen Pdgfra:rtTA ausgewählt; pTRE:H2B-GFP-Maus (~30 g; Abbildung 6B). Diese wurden in 5-Minuten-Intervallen mit einem z-Schritt von 2 μm aufgenommen, um eine Nyquist-Abtastung über eine Gesamtz-Tiefe von 54 μm zu erreichen (28 Z-Stapel-Bilder pro Zeitpunkt). Diese Maus wurde vor der Bildgebung 6 Tage lang jeden zweiten Tag mit 2 mg Doxycyclin (vier Behandlungen, insgesamt 8 mg) behandelt (Abbildung 6C).
Abbildung 1: Kundenspezifisches 3D-gedrucktes Bühneneinsatz-Design. (A,B) Design und Abmessungen eines individuellen, 3D-gedruckten Einsatzes mit einer Heizplattenöffnung (A) sowie einem Heizplatten-Bodenhalter (B), der separat gedruckt und dann in den Einsatz eingeschraubt wird (siehe entsprechende Ergänzungsdatei 1, Ergänzungsdatei 2 und Ergänzungsdatei 3). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Der neue Tischeinsatz optimiert die intravitale Bildgebung auf inversen konfokalen Mikroskopen . (A) Der Einsatz wird mit einem 3D-Drucker hergestellt. (B) Einfaches Einsatzmodell ohne Heizvorrichtung; Der Live-Imaging-Einsatz enthält vier Schraubstellen (blaue Pfeile) für die Befestigung des Mikroskoptisches. Der Ohrclip aus Metall glättet und immobilisiert das Ohr auf einer 35 mm breiten Kunststoffscheibe, die ein 20 mm breites Deckglas aus Glas enthält. Der Einsatz enthält zwei Optionen für die Platzierung der Ohrclips, um Flexibilität bei der Mausausrichtung zu bieten. Die asymmetrische Platzierung des Objektivlochs ermöglicht es der erwachsenen Maus, flach zu liegen. Seitliche Halterungen richten den Isofluran-Nasenkonus aus und immobilisieren ihn, um das Anbringen der Maus zu erleichtern. Das vereinfachte Modell erfordert die Platzierung eines kleinen Heizkissens (oder einer alternativen Wärmequelle) unter der Maus, um die Körpertemperatur zu regulieren. (C) Erweitertes Einsatzmodell mit eingebauter Heizplatte. (D) Die Heizplatte wird durch Einschieben in eine gerillte Öffnung des Einsatzes eingebaut. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Intravitaler Bildgebungseinsatz, der auf einem inversen Mikroskoptisch installiert ist . (A) Einsatz auf dem Tisch eines inversen konfokalen Laserscanning-Mikroskops. Die Nähe des Isofluran-Vaporizers und der Kammer ermöglicht das Einfädeln des Nasenkonusschlauchs durch die Einsatzhalterung. (B) Der Heizplattenstecker reicht bis unter den Mikroskoptisch, um an den Controller angeschlossen zu werden. (C) Das Einsatzloch ist auf ein 40-faches Silikonobjektiv ausgerichtet. (D) Eine Kunststoffscheibe (35 mm Durchmesser) mit einem Deckglas (20 mm Durchmesser) wird auf die gerillte Öffnung des Tischeinsatzes gelegt und mit Vakuumfett versiegelt. Die Deckglasscheibe wurde durch Entfernen der Wände einer 35 mm x 10 mm großen Zellkulturschale mit Glasboden hergestellt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Überwachung der Körpertemperatur des Tieres mit einem Heizplattenregler. (A) Heizplattenregler, der so eingestellt werden kann, dass die Körpertemperatur der Maus während der gesamten intravitalen Bildgebungssitzung auf den optimalen 36 °C stabilisiert wird. (B) Eine Analsonde wird verwendet, um die Körpertemperatur der Maus zu überwachen, sobald die Maus auf die Heizplatte gelegt wird. (C) Plastikfolie kann verwendet werden, um Wärme einzufangen und die Körpertemperatur der Maus weiter zu erhöhen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 5: Positionierung der Maus auf dem intravitalen Bildgebungseinsatz . (A) Der Mauskörper wird entlang der Oberseite der Heizplatte ausgebreitet, wobei das Ohr mittig auf dem Deckglas aus Glas liegt und mit einem Ohrclip aus Metall ruhiggestellt wird. Die Halterung positioniert den Isofluran-Nasenkonus für die Mausbefestigung. (B) Vergrößerter Bereich von (A), der die Immobilisierung der Mäuseohren mit einem Metall-Ohrclip auf dem Glasdeckglas und der Befestigung des Isofluran-Nasenkegels an der Maus zeigt. (C) Klebeband kann als alternative Methode zur Ruhigstellung der Ohren auf dem Deckglas verwendet werden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 6: Der kundenspezifische Einsatz ermöglicht eine stabile Langzeit-Intravitalbildgebung der Ohrepidermis und der Fibroblasten der Maus. (A) Eine einzelne Z-Ebene, die durch die Durchführung einer intravitalen Bildgebung am Epidermisepithel des Ohrs einer 3 Monate alten männlichen männlichen K14-H2B-mCherry-transgenen Maus aufgenommen wurde. Das gestrichelte Kästchen zeigt den vergrößerten Bereich an, der in (A') angezeigt wird. Maßstabsleiste = 50 μm. (A') Vergrößerter Bereich von (A), in dem stündlich Bilder über einen 3-stündigen Film angezeigt werden. Maßstabsbalken = 10 μm. (B) Schematische Darstellung des Doxycyclin-induzierbaren transgenen Systems, das zur Förderung der in vivo GFP-Markierung von dermalen Fibroblastenkernen verwendet wird. (C) Zeitlicher Ablauf der Doxycyclin-Injektionen. (D) Projektion mit maximaler Intensität (entspricht einer Gesamtz-Tiefe von 54 μm) von dermalen Fibroblasten, die durch Durchführung einer intravitalen Bildgebung am Ohr einer Dox-injizierten 8 Monate alten weiblichen Pdgfra:rtTA erfasst wurden; pTRE: H2B-GFP transgene Maus. Das gepunktete Kästchen zeigt den vergrößerten Bereich an, der in (D') dargestellt ist. Maßstabsleiste = 50 μm. (D') Vergrößerter Bereich von (D), in dem stündlich Bilder über einen 3-stündigen Film angezeigt werden. Maßstabsleiste = 10 μm. Diese Zeitverläufe demonstrieren die Stabilität der intravitalen Langzeitbildgebung mit dem 3D-gedruckten kundenspezifischen Einsatz. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Ergänzungsdatei 1: Designdatei für den 3D-gedruckten Einsatz mit einer Heizplattenöffnung. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
Ergänzungsdatei 2: Designdatei für den 3D-gedruckten Heizplatten-Bodenhalter. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
Ergänzungsdatei 3: Designdatei für den 3D-gedruckten Einsatz ohne Heizplattenöffnung. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
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Discussion
In dieser Studie stellen wir ein neues Werkzeug vor, das eine stabile, langfristige intravitale Bildgebung von intakten Hautepithelien der Maus auf inversen konfokalen Mikroskopen ermöglicht. Diese Erfindung besteht aus PLA, dem gebräuchlichsten und kostengünstigsten 3D-druckbaren Material; Alle internen 3D-Druckkosten für diesen Einsatz belaufen sich auf 5 <$. Die beiden separaten Einlegeteile (Abbildung 1, Ergänzungsdatei 1 und Ergänzungsdatei 2) lassen sich einfach mit Stellschrauben zusammenstecken (siehe Materialtabelle). Bemerkenswert ist, dass die bereitgestellten .stl-Dateien auch verwendet werden können, um diese Beilage auf kommerziellem Wege zu bestellen. Eine weitere Möglichkeit besteht darin, den Einsatz mit einer CNC-Maschine (Computer Numerical Control) aus eloxiertem Aluminium herzustellen, was jedoch deutlich teurer ist.
Um eine zuverlässige und effiziente Bildgebung über einen längeren Zeitraum mit diesem neuen Werkzeug zu gewährleisten, ist es wichtig, den Live-Imaging-Einsatz entsprechend dem Mikroskoptisch des Benutzers richtig zu dimensionieren. Die mitgelieferte Ergänzungsdatei 1, die Ergänzungsdatei 2 und die Ergänzungsdatei 3 können angepasst werden, um die entsprechenden Einsatzabmessungen widerzuspiegeln, die mit dem Mikroskop der Wahl vor dem 3D-Druck kompatibel sind. Genaue Einsatzabmessungen mit einer immobilisierten Deckglasscheibe minimieren die Positionsdrift (x/y) und die fokale (z) Drift während jeder Bildgebungssitzung. Es ist auch darauf zu achten, dass die Einlegetiefe ausreicht, um den Steckeranschluss der Heizplatte unter dem Tisch zu führen.
Vor der Bildgebung muss unbedingt bestätigt werden, dass die Maus vollständig betäubt ist, ihre Körpertemperatur stabil bei ~36 °C bleibt, gemessen mit der Analthermometersonde, und das Ohr fest immobilisiert ist, um Bewegungen durch Atmung zu vermeiden. Bei der Verwendung des Ohrclips aus Metall zur Befestigung des Ohres am Deckglas sollte man verhindern, dass die normale Durchblutung unterbrochen wird, indem man darauf achtet, dass die Ohrklemme nicht zu fest festgeschraubt wird. Es ist auch wichtig, die Augensalbe der Maus zu überwachen und bei Bedarf aufzufüllen, um die Augenfeuchtigkeit während langer Bildgebungssitzungen aufrechtzuerhalten.
Dieses einzigartige Einsatzdesign bietet zwar einen neuen Ansatz für die intravitale Bildgebung, weist jedoch einige bemerkenswerte Einschränkungen auf. Aufgrund der niedrigen Positionierung des Einsatzes im Mikroskoptisch sollte die Tischbewegung in der X- und Y-Ebene nach dem Positionieren des Objektivs und dem Einrasten der Deckglasscheibe sehr begrenzt sein. Diese eingeschränkte Bewegung ist entscheidend, um Schäden am Objektiv zu vermeiden. Des Weiteren ist zu beachten, dass die Deckglasscheibe aus Glas derzeit nicht im Handel erhältlich ist. Um die in dieser Studie verwendete Deckglasscheibe nachzubilden, kann die Zusammenarbeit mit einer Maschinenwerkstatt erforderlich sein.
Während wir zeigen, dass diese konfokale Methode eine stabile Langzeitbildgebung tief in intaktem Gewebe erreichen kann, sollte beachtet werden, dass Multiphotonenmikroskope im Vergleich zu konfokalen Instrumenten weniger Lichtschäden verursachen und in größere Tiefen eindringen19. Daher hängt der Nutzen dieses Werkzeugs von der Stärke des Fluoreszenzsignals im transgenen Tiermodell der Wahl sowie von der Gewebetiefe ab, die erforderlich ist, um die experimentellen Ziele zu erreichen. Wir empfehlen daher, eine möglichst geringe Laserleistung zu verwenden, um das Photobleaching zu minimieren und gleichzeitig die gewünschte Auflösung zu erreichen. Es ist auch wichtig, dass die mit diesem Einsatz verwendete Objektivlinse einen hohen N.A. für eine optimale Auflösung sowie einen großen Arbeitsabstand hat, damit sie die Deckglasscheibe erreichen kann. Es sollte beachtet werden, dass dieser Ansatz nicht dazu gedacht ist, die in Pineda et al. beschriebene gut validierte aufrechte Multiphotonen-basierte intravitale Bildgebungsmethode zu ersetzen. 6. Stattdessen soll dieses neue Tool eine effektive Alternative für Labore bieten, die keinen Zugang zu Multiphotonengeräten haben, ein weniger umständliches System bevorzugen und/oder ein inverses Mikroskop besitzen.
Unser neues Tool ist bemerkenswert anpassbar an individuelle experimentelle Anforderungen und Vorlieben. Dieser Einsatz kann mit oder ohne Heizplatte verwendet werden, da einige alternative Optionen die Platzierung eines dünnen Heizkissens unter der Maus, das Umwickeln eines Objektivlinsenwärmers um den Oberkörper und/oder das Einfangen von Wärme durch Abdecken der Maus mit Plastikfolie umfassen (Abbildung 4C). Darüber hinaus kann Klebeband in Verbindung mit oder anstelle des Ohrclips verwendet werden, um eine optimale Gewebeimmobilisierung zu gewährleisten (Abbildung 5C). Die Ausrichtung des Tischeinsatzes ist reversibel, so dass der Benutzer entscheiden kann, ob es optimal ist, das Objektivloch auf der rechten oder linken Seite auszurichten. Darüber hinaus verfügt der Einsatz über integrierte alternative Platzierungsoptionen für den Ohrclip und den Isofluranschlauch, um maximale Flexibilität basierend auf der gewünschten Mausausrichtung (Abbildung des rechten vs. linken Ohrs), der Position des Isofluran-Aufbaus und spezifischen Mikroskopkonfigurationen zu bieten (Abbildung 2C). Der Einsatz ist leicht zu installieren und abnehmbar, mit einem vereinfachten Design, das sehr benutzerfreundlich sein soll, so dass die intravitale Bildgebung auch für unerfahrene Mikroskopiker zugänglich gemacht werden kann. Darüber hinaus bietet das asymmetrisch lokalisierte Objektivloch die Möglichkeit, verschiedene Tiermodelle sowie Organe unterschiedlicher Größe abzubilden.
Wir beabsichtigen, mit dieser Erfindung die Anwendung der intravitalen Mikroskopie in einzelnen Laboratorien sowie in Mikroskopiekernen, die invertierte konfokale Instrumente enthalten, zu verbessern. Dieses leicht zugängliche und anpassbare Werkzeug wird Forschern die Freiheit geben, die Dynamik lebender Zellen in verschiedenen Organsystemen zu visualisieren, um wichtige zellbiologische Erkenntnisse zu gewinnen.
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Disclosures
Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.
Acknowledgments
Wir danken Valentina Greco für die K14-mCherry-H2B Mäuse. Wir danken der Maschinenwerkstatt des Emory University Physics Department für die Herstellung der Deckglasscheiben. Diese Arbeit wurde finanziert durch den Career Development Award #IK2 BX005370 des US Department of Veterans Affairs BLRD Service an LS, die NIH Awards RF1-AG079269 und R56-AG072473 an MJMR und den I3 Emory SOM/GT Computational and Data Analysis Award an MJMR.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3D Printer | Qudi Tech | i-Fast | 3D prints using PLA material |
| 40x 1.25NA silicone objective lens | Nikon | ||
| AxR Laser Scanning Confocal Microscope | Nikon | ||
| Cotton Tipped Swab | VWR | 76337-046 | Cream/ointment application |
| Doxycycline hyclate | Sigma-Aldrich | D9891 | Induces GFP labeling of fibroblast nuclei in Pdgfra-rtTA; pTRE-H2B-GFP mice |
| Flathead Screwdriver (2.5 mm) | Affiix insert to microscope stage | ||
| Flathead Screws x 4 (#6-32) | Nikon | Screw insert into microscope stage | |
| Glass Bottom Culture Dish | chemglass Life Sciences | CLS-1811-002 | Modified by removing walls of dish for use as coverslip disk compatible with live insert; 35 mm wide disk contains 20 mm wide glass coverslip; dish walls were removed by machine shop |
| Heat Plate controller | Physitemp | TCAT-2LV | Animal Temperature Controller - Low Voltage; anal prob attachment for mouse body temperature monitoring |
| Hex Wrench (1.5 mm) | For M3 setscrew adjustments | ||
| Hex Wrench (2.5 mm) | Adjust tension on metal ear clip | ||
| Intravital Imaging Insert | |||
| Isoflurane | Med-Vet International | HPA030782-100uL | Mouse anesthesia |
| Labeling Tape (or Scotch Tape) | VWR | 10127-458 | Alternative to metal ear clip to immobilize ear to coverslip |
| Metal fastener | used as ear clip | ||
| Mouse: C57BL/6-Pdgfraem1(rtTA)Xsun/J | The Jackson Laboratory | RRID: IMSR_JAX:034459 | Fibrroblast-specific promoter driving doxycycline-inducible rtTA expression |
| Mouse: K14-H2BPAmCherry | Courtesy of Dr. Valentina Greco at Yale University | Labels epidermal epithelial cell nuclei with mCherry; referred to in text as "K14-H2B-mCherry" | |
| Mouse: pTRE-H2B-GFP: STOCK Tg(tetO-HIST1H2BJ/GFP)47Efu/J |
The Jackson Laboratory | RRID: IMSR_JAX:005104 | Labels fibroblast nuclei with GFP when combined with Pdgfra-rtTA and induced with doxycycline |
| Multipurpose Sealing Wrap | Glad | Enhance mouse warmth | |
| Optixcare | VWR | MSPP-078932779 | Eye lubricant |
| Set screws x 3 (M3; 6 mm) | Thorlabs | SS3M6 | Attachment for heatplate module |
| Silicone Immersion Oil | Applied to 40x silicone objective | ||
| Small Animal Heating Plate | Physitemp | HP-4M | Provides heat to animal |
| Somnoflow Low-Flow Electronic Vaporizer | Kent Scientific | SF-01 | Mouse anesthesia |
| Vacuum Grease | Flinn Scientific | AP1095 | Seals coverslip disk to insert |
| Veet | hair removal | ||
| Water circulating heat pad | Stryker Medical | TP700 | for mouse revival post-imaging |
References
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