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Biology

एक उल्टे कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप पर उपकला ऊतक गतिशीलता की दीर्घकालिक निगरानी के लिए सुव्यवस्थित इंट्रावाइटल इमेजिंग दृष्टिकोण

Published: June 30, 2023 doi: 10.3791/65529
Automatic Translation
1, 1, 2, 1,3, 1,4,5,6
1Department of Cell Biology, Emory University School of Medicine, 2Independent scholar, 3Center for Neurodegenerative Disease, Emory University School of Medicine, 4Department of Dermatology, Emory University School of Medicine, 5Winship Cancer Institute, Emory University School of Medicine, 6Atlanta Veterans Affairs Medical Center

Summary

प्रोटोकॉल उल्टे कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके इंट्रावाइटल इमेजिंग को सरल बनाने के लिए एक नया उपकरण प्रस्तुत करता है।

Abstract

रोग दीक्षा और प्रगति को विफल करने के लिए नैदानिक हस्तक्षेप विकसित करने के लिए विवो सेल व्यवहार में सामान्य और असामान्य को समझना आवश्यक है। इसलिए इमेजिंग दृष्टिकोण ों को अनुकूलित करना महत्वपूर्ण है जो सीटू में सेल गतिशीलता के अवलोकन की सुविधा प्रदान करते हैं, जहां ऊतक संरचना और संरचना अप्रभावित रहती है। एपिडर्मिस शरीर की सबसे बाहरी बाधा है, साथ ही सबसे प्रचलित मानव कैंसर का स्रोत है, अर्थात् त्वचीय त्वचा कार्सिनोमा। त्वचा के ऊतकों की पहुंच नॉनइनवेसिव इंट्रावाइटल माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके बरकरार जानवरों में उपकला और त्वचीय कोशिका व्यवहार की निगरानी करने का एक अनूठा अवसर प्रस्तुत करती है। फिर भी, यह परिष्कृत इमेजिंग दृष्टिकोण मुख्य रूप से सीधे मल्टीफोटॉन माइक्रोस्कोप का उपयोग करके हासिल किया गया है, जो अधिकांश जांचकर्ताओं के लिए प्रवेश के लिए एक महत्वपूर्ण बाधा का प्रतिनिधित्व करता है। यह अध्ययन एक कस्टम-डिज़ाइन किया गया, 3 डी-मुद्रित माइक्रोस्कोप चरण सम्मिलित प्रस्तुत करता है जो उल्टे कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप के साथ उपयोग के लिए उपयुक्त है, जो जीवित ट्रांसजेनिक चूहों में कान की त्वचा की दीर्घकालिक इंट्रावाइटल इमेजिंग को सुव्यवस्थित करता है। हमारा मानना है कि यह बहुमुखी आविष्कार, जिसे उल्टे माइक्रोस्कोप ब्रांड और पसंद के मॉडल को फिट करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है और अतिरिक्त अंग प्रणालियों की छवि के लिए अनुकूलित किया जा सकता है, इंट्रावाइटल माइक्रोस्कोपी की पहुंच को महत्वपूर्ण रूप से बढ़ाकर अधिक वैज्ञानिक अनुसंधान समुदाय के लिए अमूल्य साबित होगा। यह तकनीकी प्रगति सामान्य और रोग संदर्भों में लाइव सेल गतिशीलता की हमारी समझ को मजबूत करने के लिए महत्वपूर्ण है।

Introduction

इंट्रावाइटल माइक्रोस्कोपी एक शक्तिशाली उपकरण है जो विवो वातावरण में उनके अविचलित में सेल व्यवहार की निगरानी की अनुमति देता है। इस अनूठी विधि ने जटिल स्तनधारी अंग प्रणालियों के आंतरिक कामकाज में महत्वपूर्ण अंतर्दृष्टि प्रदान की है, जिसमें फेफड़े1, मस्तिष्क2, यकृत3, स्तन ग्रंथि4, आंत5 और त्वचा6 शामिल हैं। इसके अलावा, इस दृष्टिकोण ने ट्यूमर के विकासके दौरान सेल व्यवहार परिवर्तन 7, घाव भरने8,9, सूजन10, और सीटू में अन्य विविध विकृति का खुलासा किया है। इस अध्ययन में, हम बरकरार माउस त्वचा में लाइव एपिथेलियल और स्ट्रोमल गतिशीलता की छवि बनाने के लिए इंट्रावाइटल माइक्रोस्कोपी की पहुंच को बढ़ाने पर ध्यान केंद्रित करते हैं। स्तनधारी त्वचा में सेल व्यवहार को समझना इस ऊतक की उल्लेखनीय पुनर्योजी और ट्यूमरोजेनिक क्षमता के कारण उच्च नैदानिक महत्व का है।

चूहों में इंट्रावाइटल इमेजिंग मुख्य रूप से ऊतक गहराई पर उच्च-रिज़ॉल्यूशन इमेजिंग प्रदान करने की उनकी क्षमता के कारण सीधे मल्टीफोटॉन माइक्रोस्कोप का उपयोग करके किया गया है >100 μm11,12. फिर भी, इन उपकरणों में वर्कहॉर्स बहुमुखी प्रतिभा और उल्टे कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप की अधिक सामान्य पहुंच की कमी है, जो अधिक उपयोगकर्ता के अनुकूल और लागत प्रभावी हैं, सुसंस्कृत कोशिकाओं की छवि बनाने की क्षमता प्रदान करते हैं, छवि अधिग्रहण के दौरान पूर्ण अंधेरे की आवश्यकता नहीं होती है, और आम तौर पर सुरक्षित होते हैं, अन्य उल्लेखनीय लाभों के बीच13,14।. इस अध्ययन में, हम एक नया उपकरण प्रस्तुत करते हैं जो उल्टे कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप के लिए इस दृष्टिकोण को अपनाकर इंट्रावाइटल इमेजिंग पहुंच को काफी बढ़ाता है।

यहां, हम एक 3 डी-मुद्रित कस्टम स्टेज इंसर्ट डिज़ाइन प्रस्तुत करते हैं जो उल्टे कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप (चित्रा 1, चित्रा 2, चित्रा 3, चित्रा 4, और चित्रा 5) पर माउस कान की त्वचा की स्थिर, दीर्घकालिक इंट्रावाइटल इमेजिंग की सुविधा के लिए कई प्रमुख विशेषताओं को शामिल करता है। इन विशेष विशेषताओं में एक ऑफसेट उद्देश्य छेद शामिल है जो इमेजिंग के दौरान एक वयस्क माउस के पूरे शरीर को पूरी तरह से सपाट रखने की अनुमति देता है। यह इमेजिंग पर माउस शरीर के आंदोलनों के कंपन हस्तक्षेप को कम करता है और श्वास को कम करने के लिए केटामाइन और ज़ाइलेज़िन को प्रशासित करने की आवश्यकता को समाप्त करता है, एक अभ्यास जो अक्सर इंट्रावाइटल इमेजिंग6 के साथ युग्मित होता है। इसके अलावा, डालने पर कोने के कोष्ठक माउस के चेहरे के साथ संरेखित करने के लिए एक आइसोफ्लुरेन नाक शंकु को सही ढंग से स्थान देते हैं, एक धातु कान क्लिप माउस कान को कस्टम-निर्मित कवरस्लिप डिस्क पर स्थिर करता है, और एक वैकल्पिक वियोज्य बंद-लूप बायोफीडबैक हीट प्लेट लंबे इमेजिंग सत्रों के दौरान माउस शरीर के तापमान का समर्थन करने के लिए इंसर्ट के भीतर फ्लश करती है। कस्टम कवरस्लिप डिस्क, जो माउस के सिर और कान को सपाट रखने के लिए आवश्यक एक सपाट सतह प्रदान करती है, एक सामान्य कवरस्लिप युक्त सेल कल्चर डिश की दीवारों को हटाकर एक मशीन की दुकान में उत्पन्न की गई थी। कवरस्लिप डिस्क और कस्टम स्टेज इंसर्ट के संयोजन में 40x सिलिकॉन तेल विसर्जन लेंस (1.25 संख्यात्मक एपर्चर [एनए], 0.3 मिमी कामकाजी दूरी) का उपयोग कान डर्मिस में उच्च रिज़ॉल्यूशन छवियां >50 μm गहरा प्रदान करता है।

इस नए उल्टे माइक्रोस्कोप चरण सम्मिलित की कार्यक्षमता का परीक्षण करने के लिए, हमने एक जीवित ट्रांसजेनिक K14-H2B-mCherry15 वयस्क माउस (इस माउस लाइन में उपकला नाभिक में एक लाल फ्लोरोसेंट लेबल होता है) के कान में 3 घंटे के समय पाठ्यक्रम में सभी एपिडर्मल उपकला परतों को फैलाने वाले जेड-स्टैक्स को कैप्चर किया (चित्रा 6 ए-ए')। हमने एक जीवित ट्रांसजेनिक पीडीजीएफआरए-आरटीटीए16 के कान में 3 घंटे के समय के दौरान त्वचा डर्मिस के भीतर कई फाइब्रोब्लास्ट परतों को फैलाने वाले जेड-स्टैक्स को भी कैप्चर किया; pTRE-H2B-GPP17 वयस्क माउस (इस माउस लाइन में फाइब्रोब्लास्ट नाभिक में डॉक्सीसाइक्लिन प्रेरण के बाद एक हरा फ्लोरोसेंट लेबल होता है) (चित्रा 6बी-डी')। हमारे उच्च-रिज़ॉल्यूशन डेटा एक्स-, वाई-और जेड-प्लेन में बहाव की कमी से लगातार स्थिरता प्रदर्शित करते हैं, इस प्रकार उल्टे माइक्रोस्कोप पर उपयोग के लिए इस नए इंट्रावाइटल इमेजिंग टूल की प्रभावशीलता साबित करते हैं। महत्वपूर्ण रूप से, इस 3 डी-मुद्रित चरण सम्मिलित के आयामों को समायोजित किया जा सकता है, जैसा कि पूरक फ़ाइल 1, पूरक फ़ाइल 2, और पूरक फ़ाइल 3 में वर्णित है, किसी भी उल्टे माइक्रोस्कोप को फिट करने के लिए, और उद्देश्य उद्घाटन की स्थिति को किसी विशेष ऊतक और / या रुचि के पशु मॉडल को बेहतर ढंग से इमेजिंग करने के लिए सम्मिलित के भीतर वैकल्पिक स्थानों पर ले जाया जा सकता है। इस प्रकार यह आविष्कार व्यक्तिगत प्रयोगशालाओं, या जांचकर्ताओं को कोर सुविधा कॉन्फोकल एक्सेस के साथ सशक्त बना सकता है, ताकि वे इस उपकरण को अपनी अनूठी इंट्रावाइटल इमेजिंग आवश्यकताओं के लिए अनुकूलित कर सकें, जिससे विवो सेल जीव विज्ञान में विविध के मूल्यांकन को सुव्यवस्थित किया जा सके।

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Protocol

यह शोध एमोरी विश्वविद्यालय और अटलांटा वेटरन्स अफेयर्स मेडिकल सेंटर पशु देखभाल और उपयोग दिशानिर्देशों के अनुपालन में किया गया था और संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (आईएसीयूसी) द्वारा अनुमोदित किया गया है।

1. उल्टे माइक्रोस्कोप चरण पर लाइव इमेजिंग सम्मिलित स्थापित करना

  1. 3D आयाम और डिज़ाइन (चित्र 1 और चित्रा 2A देखें), एक 3D प्रिंटर और पॉलीलैक्टिक एसिड (PLA) निर्दिष्ट करते हुए .stl फ़ाइलों (पूरक फ़ाइल 1, पूरक फ़ाइल 2, और पूरक फ़ाइल 3) का उपयोग करके सम्मिलित करें का निर्माण करें।
  2. बड़े माइक्रोस्कोप चरण नाली (चित्रा 2 सी और चित्रा 3 ए) में डालने (चित्रा 2 बी, सी) को ध्यान से रखें। सम्मिलित के प्रत्येक कोने में स्थित चार पेंच छेदों के माध्यम से डालने को सुरक्षित करने के लिए स्क्रू का उपयोग करें (चित्रा 2 बी-सी)।
    नोट: सम्मिलित द्विदिश है और माइक्रोस्कोप चरण और संज्ञाहरण तंत्र के अभिविन्यास के आधार पर 180 ° घुमाया जा सकता है।
  3. हीट प्लेट को इंसर्ट प्लग साइड-डाउन (चित्रा 2 डी) में स्लाइड करें ताकि इकाई मंच के नीचे से गुजरने वाले प्लग पोर्ट के साथ निचले सम्मिलित खांचे के ऊपर रखी जा सके (चित्रा 3 बी)।
  4. 40x सिलिकॉन तेल विसर्जन उद्देश्य (चित्रा 3 सी) के साथ डालने में नालीदार परिपत्र उद्घाटन को संरेखित करें और उद्देश्य के केंद्र में सिलिकॉन तेल लागू करें।
    1. यदि लंबे समय तक (>1 घंटे) से अधिक इमेजिंग की जाती है, तो तेल का एक उदार गुड़िया लागू करें जो पूरे इमेजिंग में कवरस्लिप / उद्देश्य इंटरफ़ेस पर बना रहेगा। लेंस के किनारों पर तेल फैलने न दें।
  5. नालीदार गोलाकार उद्घाटन के साथ वैक्यूम ग्रीस की एक छोटी मात्रा लागू करने के लिए एक सिरिंज का उपयोग करें और सम्मिलित करने के लिए कवरस्लिप डिस्क को ऊपर रखें (चित्रा 3 डी)।
    नोट: कवरस्लिप डिस्क 35 मिमी x 10 मिमी ग्लास-बॉटम सेल कल्चर डिश (एक मशीन शॉप द्वारा प्रदर्शन) की दीवारों को हटाकर बनाई गई है।
  6. 40x उद्देश्य को तब तक उठाएं जब तक कि तेल ग्लास कवरस्लिप के निचले हिस्से को चूमन न ले।

2. आइसोफ्लूरेन कॉन्फ़िगरेशन और माउस तैयारी

  1. नाक शंकु और संलग्न टयूबिंग को डालने की अनुमति देने के लिए कम-प्रवाह वाले इलेक्ट्रॉनिक वेपोराइज़र घटकों (संज्ञाहरण कक्ष, टयूबिंग, वेपोराइज़र, चारकोल कनस्तर) को रखें (चित्रा 3 ए)।
    सावधानी: आइसोफ्लूरेन एक इनहेलेशन एनेस्थेटिक है और इसे फैलने से बचने और मानव जोखिम को कम करने के लिए देखभाल के साथ संभाला जाना चाहिए।
  2. उपयोग और लॉग करने से पहले आइसोफ्लुरेन बोतल के वजन को मापें। इलेक्ट्रॉनिक वेपोराइज़र से टोपी को आइसोफ्लुरेन बोतल में संलग्न करें।
  3. पावर कॉर्ड को इलेक्ट्रॉनिक वेपोराइज़र से कनेक्ट करें। नीली नाक शंकु क्लिप को बंद करें और चारकोल कनस्तर में कक्ष के माध्यम से वायु प्रवाह की अनुमति देने के लिए सफेद प्रेरण कक्ष क्लिप खोलें। हवा के प्रवाह की अनुमति देने के लिए मशीन के बाईं ओर से लाल परिवेशी वायु टोपी हटा दें।
  4. सिस्टम को 200 एमएल / मिनट (कम प्रवाह) और 2% आइसोफ्लुरेन पर 5 मिनट के लिए गर्म होने दें।
    नोट: यद्यपि नाक शंकु सेटिंग का चयन किया गया है, नीली नाक शंकु रेखा बंद रहनी चाहिए, और सफेद प्रेरण कक्ष रेखा खुली रहनी चाहिए।
  5. एक बार जब सिस्टम ठीक से संतुलित हो जाता है, तो कक्ष से शेष आइसोफ्लुरेन को हटाने के लिए लाइनों को शुद्ध करें।
  6. माउस को प्रेरण कक्ष में रखें और उच्च प्रवाह का चयन करें। पशु के शरीर को डालने से पहले सभी माउस तैयारी (यानी, बाल हटाने, सामयिक दवा वितरण, आंख मरहम अनुप्रयोग, आदि) को पूरा करें। पुष्टि करें कि माउस को पैर की अंगुली पिंच रिफ्लेक्स विधि का उपयोग करके पूरी तरह से एनेस्थेटाइज किया गया है।
    1. पैर को विस्तारित करने के साथ, शारीरिक क्षति के बिना पैर की अंगुली को मजबूती से चुटकी लेने के लिए एक नाखून का उपयोग करें। यदि माउस उत्तेजना के लिए सकारात्मक प्रतिक्रिया प्रदर्शित करता है (यानी, पैर वापसी, पैर चिकोटी, आदि), कक्ष के भीतर एनेस्थेटिक को तब तक जारी रखें जब तक कि कोई प्रतिक्रिया न देखी जाए। एक बार उचित रूप से एनेस्थेटाइज्ड होने के बाद, माउस श्वास दर ~ 55-65 सांस प्रति मिनट18 तक धीमी होनी चाहिए।
  7. जब माउस पूरी तरह से एनेस्थेटाइज्ड हो जाता है, तो आइसोफ्लुरेन डिलीवरी को रोकने के लिए फिर से हाई फ्लो का चयन करें। नाक शंकु के माध्यम से आइसोफ्लुरेन देने के लिए क्लिप (नीला: खुला; सफेद: बंद) को खोलने और समायोजित करने से पहले कक्ष को शुद्ध करें। आइसोफ्लुरेन डिलीवरी जारी रखने के लिए माउस से नाक शंकु जुड़े होने पर कम प्रवाह का चयन करें।
  8. सम्मिलित करने पर कोने टयूबिंग ब्रैकेट के माध्यम से संलग्न नाक शंकु के साथ थ्रेड आइसोफ्लुरेन ट्यूबिंग (चित्रा 3 ए और चित्रा 5)।

3. इंट्रावाइटल इमेजिंग के लिए सम्मिलित पर माउस प्लेसमेंट

  1. हीट प्लेट को नियंत्रक (संलग्न गुदा जांच युक्त) में प्लग करें, बिजली चालू करें, और प्लेट को 36 डिग्री सेल्सियस (चित्रा 4 ए) तक पहुंचने दें।
  2. प्रेरण कक्ष से एनेस्थेटाइज्ड माउस निकालें और हीट प्लेट (चित्रा 4 बी और चित्रा 5 ए) के पार रखें। इनहेलेंट एनेस्थीसिया के बिना माउस के सक्रिय होने के समय को कम करने के लिए कक्ष से तेजी से डालने के लिए स्थानांतरण करें।
  3. माउस पर नाक शंकु को सुरक्षित करें (चित्रा 4 बी, सी, और चित्रा 5)। यदि आवश्यक हो, तो नाक शंकु के कोण और स्थिति को और सुरक्षित करने के लिए टेप का उपयोग करें।
  4. गुदा जांच डालें और नियंत्रक तापमान को समायोजित करें जब तक कि माउस शरीर का तापमान ~ 36 डिग्री सेल्सियस (चित्रा 4 ए, बी) पर स्थिर न हो। माउस को ठीक से तैनात करने के बाद, उचित शरीर के तापमान (चित्रा 4 सी) का समर्थन करने के लिए, यदि आवश्यक हो, तो गर्मी को फंसाने के लिए प्लास्टिक क्लिंग रैप का उपयोग करें।
  5. माउस को रखें ताकि सिर कवरस्लिप डिस्क के साथ संरेखित हो और धातु कान क्लिप (चित्रा 5 ए, बी) या टेप (चित्रा 5 सी) का उपयोग करके कान को ग्लास कवरस्लिप के केंद्र पर स्थिर करें।
    नोट: कान पर धातु कान क्लिप के दबाव को पेंच को ढीला करके समायोजित किया जा सकता है जो क्लिप को डालने के लिए सुरक्षित करता है। बढ़ी हुई क्लिप कसने के लचीलेपन के लिए एक धातु स्प्रिंग जोड़ा जा सकता है।
    1. कान क्लिप स्थान को बदलने के लिए, बोल्ट को 2.5 मिमी एलन रिंच के साथ अनस्क्रू करें और द्वितीयक साइट पर स्थानांतरित करें (चित्रा 2 बी, सी)। कान क्लिप को फिर से इकट्ठा करते समय, क्लिप को डालने के खिलाफ रखें, इसके बाद वॉशर को शीर्ष पर रखें। क्लिप को धुरी बनाने के लिए क्लिप को मामूली बल के साथ सुरक्षित रूप से बांधने के लिए बोल्ट का उपयोग करें।
  6. उद्देश्य जेड-पोजिशनिंग को तब तक समायोजित करें जब तक कि कोशिकाएं फोकल स्थान के भीतर न हों (चित्रा 6 ए, डी)। प्रयोगात्मक लक्ष्यों के अनुसार जेड-स्टैक और टाइम-लैप्स पैरामीटर सेट करें और छवि अधिग्रहण शुरू करें।
    नोट: यदि सही सेटअप प्राप्त किया जाता है, तो माउस कान को कम से कम 3 लगातार घंटे (चित्रा 6 ए', डी') के लिए चित्रित किया जा सकता है।
    1. एक बार जेड-स्टैक सीमाएं निर्धारित हो जाने के बाद, लेजर शक्ति को समायोजित करें और यह सुनिश्चित करने के लिए लाभ करें कि फोटोब्लीचिंग को कम करने के लिए कोई जेड-प्लेन ओवरसैचुरेटेड न हो। जेड-स्टैक की कुल मोटाई, चरण संख्या (Nyquist नमूनाकरण अनुशंसित), और समय अंतराल का उपयोग करके समय-चूक पैरामीटर निर्धारित करें।
    2. एनेस्थीसिया के तहत पशु व्यवहार्यता, लेजर-प्रेरित फोटोब्लीचिंग / फोटोटॉक्सिसिटी, और लाइव इमेजिंग के लक्ष्य (यानी, सेल डिवीजन डायनामिक्स, सेल-सेल इंटरैक्शन, आदि) सहित कई कारकों का उपयोग करके इमेजिंग पैरामीटर (समय अंतराल, कुल इमेजिंग समय, आदि) निर्धारित करें।

4. इमेजिंग की समाप्ति

  1. जल-परिसंचारी गर्मी पैड चालू करें और छवि अधिग्रहण की समाप्ति से पहले कम से कम 30 मिनट के लिए निरंतर चक्र और 35 डिग्री सेल्सियस पर सेट करें।
  2. इमेजिंग पूरा होने पर, आइसोफ्लुरेन डिलीवरी को रोकने के लिए इलेक्ट्रॉनिक वेपोराइज़र पर कम प्रवाह का चयन करें और माउस को एम्बुलेटरी तक हीट पैड पर ले जाएं।
  3. एक बार जागने के बाद, माउस को पूरी तरह से एम्बुलेटरी तक हीट पैड पर बनाए रखने के दौरान ट्रांसफर कंटेनर में वापस ले जाएं। हीट पैड पर माउस की लगातार निगरानी करें जब तक कि यह उत्तरदायी न हो।
  4. इलेक्ट्रॉनिक वेपोराइज़र पर, मेनू > एनेस्थेटिक नियंत्रण > खाली का चयन करें क्लिक करें. सिस्टम से आइसोफ्लुरेन बोतल को हटा दें और निर्माता की टोपी को बोतल पर वापस रखें।
  5. आइसोफ्लुरेन बोतल और चारकोल कनस्तर के वजन को मापें और लॉग में वजन दर्ज करें। एक बार चारकोल कनस्तर का वजन बेसलाइन माप पर 50 ग्राम हो जाने के बाद, कनस्तर का निपटान करें और इसे एक नई इकाई के साथ बदलें। आइसोफ्लुरेन को लॉकबॉक्स में वापस करें।
  6. कवरस्लिप डिस्क को हटा दें और लेंस पेपर और लेंस समाधान से साफ करें। पुन: उपयोग के लिए खरोंच से बचने के लिए ठीक से स्टोर करें।
  7. इन्सर्ट ब्रैकेट से एनेस्थीसिया टयूबिंग को हटा दें और माइक्रोस्कोप चरण से इंसर्ट को अनस्क्रू करें।

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Representative Results

एक उल्टे कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप पर लाइव इमेजिंग इंसर्ट की उचित असेंबली और इंसर्ट के ऊपर एक ट्रांसजेनिक माउस का उचित अभिविन्यास एक्स-, वाई-और जेड-अक्षों में बहाव के न्यूनतम सबूत के साथ ≥1 घंटे के समय में फ्लोरोसेंटली-लेबल, लाइव कान ऊतक के जेड-ढेर प्राप्त करके मान्य किया जाता है। छवियों को लगातार अंतराल पर कैप्चर किया जाना चाहिए (अंतराल समय जैविक प्रश्न, प्रतिदीप्ति संकेत की ताकत, आदि पर निर्भर करेगा) ताकि सेल गतिशीलता और छवि बहाव को समय के साथ ट्रैक किया जा सके। पूरे समय के दौरान, यह सुनिश्चित करने के लिए कि वे फोकस में रहें, व्यक्तिगत जेड-प्लेन की निगरानी से पता चलता है कि क्या पशु आंदोलन इमेजिंग स्थिरता में हस्तक्षेप करता है। लाइव इमेजिंग इंसर्ट का उपयोग करके विस्तारित समय पाठ्यक्रम पर फोकस में रहने वाले एकल जेड-प्लेन का एक उदाहरण चित्रा 6 में दर्शाया गया है।

चित्रा 6 ए में प्रदर्शित चार 60 मिनट के समय बिंदुओं से छवियों को 3 महीने के वयस्क पुरुष K14-H2B-mCherry माउस (~ 30 ग्राम) के कान में mChery + एपिडर्मल कोशिकाओं की 3 घंटे की टाइम-लैप्स फिल्म से चुना गया था, जिसे 2 मिनट के अंतराल पर 0.246 μm के z-step का उपयोग करके कैप्चर किया गया था ताकि 24 μm (प्रति समय बिंदु प्राप्त 99 z-स्टैक छवियां) की कुल z-गहराई में Nyquist नमूने प्राप्त किए जा सकें।

चित्रा 6 डी में प्रदर्शित चार 60 मिनट के समय बिंदुओं से छवियों को 8 महीने की वयस्क महिला पीडीजीएफआरए: आरटीटीए के कान में जीएफपी + त्वचीय फाइब्रोब्लास्ट की 3 घंटे की टाइम-लैप्स फिल्म से चुना गया था; pTRE: H2B-GPP माउस (~ 30 ग्राम; चित्रा 6 बी)। इन्हें 5 मिनट के अंतराल पर 5 मिनट के अंतराल पर कैप्चर किया गया था, जिसमें 54 μm की कुल z-गहराई (प्रति समय बिंदु पर प्राप्त 28 z-स्टैक छवियां) में Nyquist नमूनाकरण प्राप्त करने के लिए 2 μm के z-step का उपयोग किया गया था। इस माउस को इमेजिंग (चित्रा 6 सी) से पहले 6 दिनों (चार उपचार, कुल 8 मिलीग्राम) के लिए हर दूसरे दिन 2 मिलीग्राम डॉक्सीसाइक्लिन के साथ इलाज किया गया था।

Figure 1
चित्रा 1: अनुकूलित 3 डी-मुद्रित चरण सम्मिलित डिजाइन। (ए, बी) हीट प्लेट ओपनिंग (ए) के साथ-साथ हीट प्लेट बॉटम होल्डर (बी) के साथ एक कस्टम, 3 डी-मुद्रित सम्मिलित का डिज़ाइन और आयाम, जिसे अलग से मुद्रित किया जाता है और फिर सम्मिलित में पेंच किया जाता है (संबंधित पूरक फ़ाइल 1, पूरक फ़ाइल 2, और पूरक फ़ाइल 3 देखें)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: नया चरण डालने से उल्टे कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप पर इंट्रावाइटल इमेजिंग को सुव्यवस्थित किया जा सकता है। (ए) 3 डी प्रिंटर का उपयोग करके निर्माण किया जा रहा है। (बी) हीटिंग डिवाइस के बिना सरल सम्मिलित मॉडल; लाइव इमेजिंग इंसर्ट में माइक्रोस्कोप स्टेज अटैचमेंट के लिए चार पेंच साइट्स (नीले तीर) शामिल हैं। धातु कान क्लिप 20 मिमी चौड़ी ग्लास कवरस्लिप युक्त 35 मिमी चौड़ी प्लास्टिक डिस्क पर कान को समतल और गतिहीन करती है। माउस ओरिएंटेशन के साथ लचीलापन प्रदान करने के लिए इंसर्ट में ईयर क्लिप प्लेसमेंट के लिए दो विकल्प हैं। उद्देश्य छेद का असममित प्लेसमेंट वयस्क माउस को सपाट रखने की अनुमति देता है। साइड ब्रैकेट माउस अटैचमेंट को सुविधाजनक बनाने के लिए आइसोफ्लुरेन नाक शंकु को संरेखित और गतिहीन करते हैं। सरलीकृत मॉडल को शरीर के तापमान को विनियमित करने में मदद करने के लिए माउस के नीचे एक छोटे हीटिंग पैड (या वैकल्पिक गर्मी स्रोत) के प्लेसमेंट की आवश्यकता होती है। (सी) एक अंतर्निहित गर्मी प्लेट के साथ उन्नत सम्मिलित मॉडल। (डी) हीट प्लेट को इंसर्ट के एक नालीदार उद्घाटन में स्लाइड करके स्थापित किया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: एक उल्टे माइक्रोस्कोप चरण पर स्थापित इंट्रावाइटल इमेजिंग सम्मिलित। (ए) एक लेजर स्कैनिंग इनवर्टेड कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप के चरण पर लगाया गया है। आइसोफ्लुरेन वेपोराइज़र और चैंबर की निकटता सम्मिलित ब्रैकेट के माध्यम से नाक शंकु ट्यूबिंग के थ्रेडिंग की अनुमति देती है। (बी) नियंत्रक से कनेक्ट करने के लिए हीट प्लेट प्लग माइक्रोस्कोप चरण के नीचे फैला हुआ है। (सी) सम्मिलित छेद 40x सिलिकॉन उद्देश्य के साथ संरेखित होता है। (डी) एक प्लास्टिक डिस्क (35 मिमी व्यास) जिसमें एक ग्लास कवरस्लिप (20 मिमी व्यास) होता है, को स्टेज इंसर्ट के खांचे के उद्घाटन के ऊपर रखा जाता है और वैक्यूम ग्रीस के साथ जगह में सील किया जाता है। कवरस्लिप डिस्क को 35 मिमी x 10 मिमी ग्लास-बॉटम सेल कल्चर डिश की दीवारों को हटाकर बनाया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: हीट प्लेट नियंत्रक का उपयोग करके पशु शरीर के तापमान की निगरानी करना। (ए) हीट प्लेट नियंत्रक, जिसे इंट्रावाइटल इमेजिंग सत्र के दौरान इष्टतम 36 डिग्री सेल्सियस पर माउस शरीर के तापमान को स्थिर करने के लिए समायोजित किया जा सकता है। (बी) एक गुदा जांच का उपयोग माउस शरीर के तापमान की निगरानी के लिए किया जाता है जब माउस को हीट प्लेट के ऊपर रखा जाता है। (सी) प्लास्टिक क्लिंग रैप का उपयोग माउस शरीर के तापमान को और बढ़ाने के लिए गर्मी को फंसाने के लिए किया जा सकता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्र 5: इंट्रावाइटल इमेजिंग इंसर्ट पर माउस पोजिशनिंग । (ए) माउस बॉडी हीट प्लेट के शीर्ष के साथ फैली हुई है, जिसमें कान ग्लास कवरस्लिप पर केंद्रित है और धातु कान क्लिप के साथ स्थिर है। ब्रैकेट माउस अटैचमेंट के लिए आइसोफ्लुरेन नाक शंकु रखता है। (बी) (ए) का ज़ूम-इन क्षेत्र ग्लास कवरस्लिप पर एक धातु कान क्लिप के साथ माउस कान स्थिरीकरण और माउस से आइसोफ्लुरेन नाक शंकु लगाव दिखाता है। (सी) टेप का उपयोग ग्लास कवरस्लिप पर कान स्थिरीकरण की वैकल्पिक विधि के रूप में किया जा सकता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 6
चित्रा 6: कस्टम इंसर्ट माउस कान एपिडर्मिस और फाइब्रोब्लास्ट के स्थिर दीर्घकालिक इंट्रावाइटल इमेजिंग की सुविधा प्रदान करता है । (ए) 3 महीने के वयस्क पुरुष K14-H2B-mचेरी ट्रांसजेनिक माउस के कान एपिडर्मल एपिथेलियम पर इंट्रावाइटल इमेजिंग करने से कैप्चर किया गया एक एकल जेड-प्लेन। डॉटेड बॉक्स (ए') में दिखाए गए ज़ूम-इन क्षेत्र को इंगित करता है। स्केल बार = 50 μm. (A') (A) का ज़ूम-इन क्षेत्र 3 घंटे की फिल्म में हर घंटे छवियां दिखा रहा है। स्केल बार = 10 μm. (B) त्वचीय फाइब्रोब्लास्ट नाभिक के विवो जीएफपी लेबलिंग को बढ़ावा देने के लिए उपयोग किए जाने वाले डॉक्सीसाइक्लिन-इंड्यूसेबल ट्रांसजेनिक सिस्टम का योजनाबद्ध। (सी) डॉक्सीसाइक्लिन इंजेक्शन की समयरेखा। (डी) त्वचीय फाइब्रोब्लास्ट की अधिकतम तीव्रता प्रक्षेपण (54 μm कुल जेड-गहराई का प्रतिनिधित्व करते हुए) को एक डॉक्स-इंजेक्शन वाली 8 महीने की मादा Pdgfra:rtTA के कान पर इंट्रावाइटल इमेजिंग करके कैप्चर किया गया; pTRE: H2B-GPP ट्रांसजेनिक माउस। डॉटेड बॉक्स (डी') में दिखाए गए ज़ूम-इन क्षेत्र को इंगित करता है। स्केल बार = 50 μm. (D') (D) का ज़ूम-इन क्षेत्र 3 घंटे की फिल्म पर हर घंटे छवियां दिखाता है। स्केल बार = 10 μm। ये समय पाठ्यक्रम 3 डी-मुद्रित कस्टम सम्मिलित का उपयोग करके दीर्घकालिक इंट्रावाइटल इमेजिंग की स्थिरता का प्रदर्शन करते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक फ़ाइल 1: हीट प्लेट खोलने के साथ 3 डी-मुद्रित सम्मिलित करने के लिए डिज़ाइन फ़ाइल। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।

पूरक फ़ाइल 2: 3 डी-मुद्रित हीट प्लेट बॉटम धारक के लिए डिज़ाइन फ़ाइल। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।

पूरक फ़ाइल 3: हीट प्लेट खोलने के बिना 3 डी-मुद्रित सम्मिलित करने के लिए डिज़ाइन फ़ाइल। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।

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Discussion

इस अध्ययन में, हम एक नया उपकरण प्रस्तुत करते हैं जो उल्टे कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप पर बरकरार माउस त्वचा एपिथेलिया के स्थिर, दीर्घकालिक इंट्रावाइटल इमेजिंग की सुविधा प्रदान करता है। यह आविष्कार पीएलए से बना है, जो सबसे आम और सस्ती 3 डी-प्रिंट करने योग्य सामग्री है; इस सम्मिलित करने के लिए सभी इन-हाउस 3 डी-प्रिंटिंग लागत < $ 5 है। दो अलग-अलग सम्मिलित टुकड़े (चित्रा 1, पूरक फ़ाइल 1, और पूरक फ़ाइल 2) को सेट स्क्रू का उपयोग करके आसानी से इकट्ठा किया जा सकता है (सामग्री की तालिका देखें)। विशेष रूप से, प्रदान की गई .stl फ़ाइलों का उपयोग वाणिज्यिक साधनों द्वारा इस सम्मिलित को ऑर्डर करने के लिए भी किया जा सकता है। एक अतिरिक्त विकल्प एनोडाइज्ड एल्यूमीनियम से सम्मिलित करने के लिए कंप्यूटर संख्यात्मक नियंत्रण (सीएनसी) मशीन का उपयोग करना है, हालांकि यह काफी अधिक महंगा है।

इस नए उपकरण का उपयोग करके समय की अवधि में विश्वसनीय और कुशल इमेजिंग सुनिश्चित करने के लिए, उपयोगकर्ता के माइक्रोस्कोप चरण के अनुसार लाइव इमेजिंग सम्मिलित को ठीक से आकार देना महत्वपूर्ण है। प्रदान की गई पूरक फ़ाइल 1, पूरक फ़ाइल 2, और पूरक फ़ाइल 3 को उपयुक्त सम्मिलित आयामों को प्रतिबिंबित करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है जो 3 डी-प्रिंटिंग से पहले पसंद के माइक्रोस्कोप के साथ संगत हैं। प्रत्येक इमेजिंग सत्र के दौरान स्थिर कवरस्लिप डिस्क के साथ सटीक सम्मिलित आयाम स्थितिगत (x/y) और फोकल (z) बहाव को कम करते हैं। यह सुनिश्चित करना भी महत्वपूर्ण है कि सम्मिलित गहराई मंच के नीचे हीट प्लेट प्लग पोर्ट को पारित करने के लिए पर्याप्त है।

इमेजिंग से पहले, यह पुष्टि करना आवश्यक है कि माउस पूरी तरह से एनेस्थेटाइज्ड है, इसके शरीर का तापमान ~ 36 डिग्री सेल्सियस पर स्थिर रहता है जैसा कि गुदा थर्मामीटर जांच के साथ मापा जाता है, और सांस लेने के कारण आंदोलन से बचने के लिए कान को मजबूती से स्थिर किया जाता है। कवरस्लिप में कान को सुरक्षित करने के लिए धातु कान क्लिप का उपयोग करते समय, किसी को यह सुनिश्चित करके सामान्य रक्त परिसंचरण को काटने से रोकना चाहिए कि कान क्लैंप बहुत कसकर बंद न हो। लंबे इमेजिंग सत्रों के दौरान ओकुलर नमी बनाए रखने के लिए आवश्यक होने पर माउस पर आंख मरहम की निगरानी और भरपाई करना भी महत्वपूर्ण है।

जबकि यह अद्वितीय सम्मिलित डिज़ाइन इंट्रावाइटल इमेजिंग के लिए एक नया दृष्टिकोण प्रदान करता है, इसकी कुछ उल्लेखनीय सीमाएं हैं। माइक्रोस्कोप चरण में सम्मिलित की कम स्थिति के कारण, उद्देश्य की स्थिति के बाद एक्स- और वाई-विमानों में चरण आंदोलन बहुत सीमित होना चाहिए और कवरस्लिप डिस्क को जगह में सील कर दिया जाता है। उद्देश्य को नुकसान से बचने के लिए यह सीमित आंदोलन महत्वपूर्ण है। इसके अलावा, यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि ग्लास कवरस्लिप डिस्क वर्तमान में व्यावसायिक रूप से उपलब्ध नहीं है। इस अध्ययन में उपयोग की जाने वाली कवरस्लिप डिस्क को फिर से बनाने के लिए, मशीन शॉप के साथ सहयोग की आवश्यकता हो सकती है।

जबकि हम प्रदर्शित करते हैं कि यह कॉन्फोकल-आधारित विधि बरकरार ऊतक में गहरी स्थिर दीर्घकालिक इमेजिंग प्राप्त कर सकती है, यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि मल्टीफोटॉन माइक्रोस्कोप कम फोटोडैमेज का कारण बनते हैं और कॉन्फोकल उपकरणोंकी तुलना में अधिक गहराई तक प्रवेश करते हैं। इसलिए, इस उपकरण की उपयोगिता पसंद के ट्रांसजेनिक पशु मॉडल में प्रतिदीप्ति संकेत की ताकत पर निर्भर करती है, साथ ही प्रयोगात्मक लक्ष्यों को प्राप्त करने के लिए आवश्यक ऊतक की गहराई भी। इसलिए हम वांछित संकल्प प्राप्त करते समय फोटोब्लीचिंग को कम करने के लिए सबसे कम लेजर शक्ति का उपयोग करने की सलाह देते हैं। यह भी महत्वपूर्ण है कि इस सम्मिलित के साथ उपयोग किए जाने वाले उद्देश्य लेंस में इष्टतम रिज़ॉल्यूशन के लिए एक उच्च एनए है, साथ ही साथ एक लंबी कामकाजी दूरी भी है ताकि यह कवरस्लिप डिस्क तक पहुंच सके। यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि यह दृष्टिकोण पिनेडा एट अल में वर्णित अच्छी तरह से मान्य ईमानदार मल्टीफोटॉन-आधारित इंट्रावाइटल इमेजिंग विधि को बदलने के लिए नहीं है। 6. इसके बजाय, इस नए उपकरण का उद्देश्य उन प्रयोगशालाओं के लिए एक प्रभावी विकल्प प्रदान करना है जिनके पास मल्टीफोटॉन उपकरण तक पहुंच नहीं है, कम बोझिल प्रणाली पसंद करते हैं, और / या उल्टे माइक्रोस्कोप के मालिक हैं।

हमारा नया उपकरण व्यक्तिगत प्रयोगात्मक आवश्यकताओं और वरीयताओं के लिए उल्लेखनीय रूप से अनुकूलन योग्य है। इस सम्मिलित का उपयोग हीट प्लेट के साथ या उसके बिना किया जा सकता है, क्योंकि कुछ वैकल्पिक विकल्पों में माउस के नीचे एक पतली हीटिंग पैड का प्लेसमेंट, इसके धड़ के चारों ओर एक उद्देश्य लेंस वार्मर लपेटना, और / या प्लास्टिक क्लिंग रैप के साथ माउस को कवर करके गर्मी को फंसाना शामिल है (चित्रा 4 सी)। इसके अलावा, इष्टतम ऊतक स्थिरीकरण प्रदान करने के लिए टेप का उपयोग कान क्लिप के साथ या उसके स्थान पर किया जा सकता है (चित्रा 5 सी)। स्टेज इंसर्ट का अभिविन्यास प्रतिवर्ती है, इसलिए उपयोगकर्ता यह तय कर सकता है कि दाईं या बाईं ओर उद्देश्य छेद को उन्मुख करना इष्टतम है या नहीं। इसके अलावा, डालने में वांछित माउस अभिविन्यास (दाएं बनाम बाएं कान की इमेजिंग), आइसोफ्लुरेन सेटअप का स्थान और विशिष्ट माइक्रोस्कोप कॉन्फ़िगरेशन (चित्रा 2 सी) के आधार पर अधिकतम लचीलापन प्रदान करने के लिए कान क्लिप और आइसोफ्लुरेन टयूबिंग के लिए अंतर्निहित वैकल्पिक प्लेसमेंट विकल्प हैं। सम्मिलित आसानी से स्थापित करने योग्य और हटाने योग्य है, एक सरलीकृत डिजाइन के साथ जिसका उद्देश्य अत्यधिक उपयोगकर्ता के अनुकूल होना है ताकि इंट्रावाइटल इमेजिंग को नौसिखिए माइक्रोस्कोपी के लिए भी सुलभ बनाया जा सके। इसके अतिरिक्त, असममित रूप से स्थानीयकृत उद्देश्य छेद विभिन्न पशु मॉडल के साथ-साथ अलग-अलग आकार के अंगों की छवि बनाने की क्षमता प्रदान करता है।

हम इस आविष्कार के लिए व्यक्तिगत प्रयोगशालाओं के साथ-साथ माइक्रोकॉपी कोर के भीतर इंट्रावाइटल माइक्रोस्कोपी के आवेदन को बढ़ाने का इरादा रखते हैं जिसमें उल्टे कॉन्फोकल उपकरण होते हैं। यह अत्यधिक सुलभ और अनुकूलन योग्य उपकरण जांचकर्ताओं को महत्वपूर्ण सेल जैविक अंतर्दृष्टि को प्रकट करने के लिए विभिन्न अंग प्रणालियों में लाइव सेल गतिशीलता की कल्पना करने की स्वतंत्रता प्रदान करेगा।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए हितों का कोई टकराव नहीं है।

Acknowledgments

हम K14-mChery-H2B चूहों के लिए वैलेंटाइना ग्रीको को धन्यवाद देते हैं। हम ग्लास कवरस्लिप डिस्क उत्पन्न करने के लिए एमोरी विश्वविद्यालय भौतिकी विभाग मशीन शॉप के आभारी हैं। इस काम को यूएस डिपार्टमेंट ऑफ वेटरन्स अफेयर्स बीएलआरडी सर्विस से एलएस को करियर डेवलपमेंट अवार्ड #IK2 BX005370, एनआईएच अवार्ड्स आरएफ 1-AG079269 और एमजेएमआर को आर 56-AG072473 और एमजेएमआर को आई 3 एमोरी एसओएम / जीटी कम्प्यूटेशनल एंड डेटा एनालिसिस अवार्ड द्वारा वित्त पोषित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3D Printer Qudi Tech i-Fast 3D prints using PLA material
40x 1.25NA silicone objective lens Nikon
AxR Laser Scanning Confocal Microscope Nikon
Cotton Tipped Swab VWR 76337-046 Cream/ointment application
Doxycycline hyclate Sigma-Aldrich D9891 Induces GFP labeling of fibroblast nuclei in Pdgfra-rtTA; pTRE-H2B-GFP mice
Flathead Screwdriver (2.5 mm) Affiix insert to microscope stage
Flathead Screws x 4 (#6-32) Nikon Screw insert into microscope stage
Glass Bottom Culture Dish chemglass Life Sciences CLS-1811-002 Modified by removing walls of dish for use as coverslip disk compatible with live insert; 35 mm wide disk contains 20 mm wide glass coverslip; dish walls were removed by machine shop
Heat Plate controller Physitemp TCAT-2LV Animal Temperature Controller - Low Voltage; anal prob attachment for mouse body temperature monitoring
Hex Wrench (1.5 mm) For M3 setscrew adjustments
Hex Wrench (2.5 mm) Adjust tension on metal ear clip
Intravital Imaging Insert
Isoflurane Med-Vet International HPA030782-100uL Mouse anesthesia
Labeling Tape (or Scotch Tape) VWR 10127-458 Alternative to metal ear clip to immobilize ear to coverslip
Metal fastener used as ear clip
Mouse: C57BL/6-Pdgfraem1(rtTA)Xsun/J The Jackson Laboratory RRID: IMSR_JAX:034459 Fibrroblast-specific promoter driving doxycycline-inducible rtTA expression
Mouse: K14-H2BPAmCherry Courtesy of Dr. Valentina Greco at Yale University Labels epidermal epithelial cell nuclei with mCherry; referred to in text as "K14-H2B-mCherry"
Mouse: pTRE-H2B-GFP: STOCK
Tg(tetO-HIST1H2BJ/GFP)47Efu/J		 The Jackson Laboratory RRID: IMSR_JAX:005104  Labels fibroblast nuclei with GFP when combined with Pdgfra-rtTA and induced with doxycycline
Multipurpose Sealing Wrap Glad Enhance mouse warmth
Optixcare VWR MSPP-078932779 Eye lubricant
Set screws x 3 (M3; 6 mm) Thorlabs SS3M6 Attachment for heatplate module
Silicone Immersion Oil Applied to 40x silicone objective
Small Animal Heating Plate Physitemp HP-4M Provides heat to animal
Somnoflow Low-Flow Electronic Vaporizer Kent Scientific SF-01 Mouse anesthesia
Vacuum Grease Flinn Scientific AP1095 Seals coverslip disk to insert
Veet hair removal 
Water circulating heat pad Stryker Medical TP700 for mouse revival post-imaging

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References

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इंट्रावाइटल इमेजिंग उपकला ऊतक गतिशीलता इनवर्टेड कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप विवो सेल व्यवहार में नैदानिक हस्तक्षेप रोग दीक्षा और प्रगति इमेजिंग दृष्टिकोण सेल गतिशीलता ऊतक संरचना और संरचना एपिडर्मिस त्वचीय त्वचा कार्सिनोमा नॉनइनवेसिव इंट्रावाइटल माइक्रोस्कोपी मल्टीफोटॉन माइक्रोस्कोप माइक्रोस्कोप स्टेज इंसर्ट लाइव ट्रांसजेनिक चूहे वैज्ञानिक अनुसंधान समुदाय इंट्रावाइटल माइक्रोस्कोपी की पहुंच।
एक उल्टे कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप पर उपकला ऊतक गतिशीलता की दीर्घकालिक निगरानी के लिए सुव्यवस्थित इंट्रावाइटल इमेजिंग दृष्टिकोण
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Hamersky IV, M., Tekale, K.,… More

Hamersky IV, M., Tekale, K., Winfree, L. M., Rowan, M. J. M., Seldin, L. Streamlined Intravital Imaging Approach for Long-Term Monitoring of Epithelial Tissue Dynamics on an Inverted Confocal Microscope. J. Vis. Exp. (196), e65529, doi:10.3791/65529 (2023).

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