Summary
Este protocolo descreve a preparação do inóculo, a quantificação do biofilme em placas de microtitulação usando corante violeta cristal, a contagem viável em biofilmes e a visualização de biofilmes de Acinetobacter.
Abstract
Acinetobacter causa infecções hospitalares e sua formação de biofilme pode contribuir para a sobrevivência em superfícies secas, como ambientes hospitalares. Assim, a quantificação e visualização do biofilme são métodos importantes para avaliar o potencial de cepas de Acinetobacter em causar infecções nosocomiais. Os biofilmes que se formam na superfície da microplaca podem ser quantificados em termos de volume e número de células. Os volumes de biofilme podem ser quantificados pela coloração usando violeta de cristal, lavagem, coloração usando etanol e, em seguida, medindo o corante solubilizado usando um leitor de microplacas. Para quantificar o número de células embutidas nos biofilmes, os biofilmes são descartados com raspadores celulares, colhidos em solução salina, agitados vigorosamente na presença de esferas de vidro e espalhados em ágar Acinetobacter. Em seguida, as placas são incubadas a 30 °C por 24-42 h. Após a incubação, as colônias vermelhas são enumeradas para estimar o número de células em biofilmes. Este método de contagem viável também pode ser útil para a contagem de células de Acinetobacter em biofilmes de espécies mistas. Biofilmes de Acinetobacter podem ser visualizados usando corantes fluorescentes. Uma microplaca comercialmente disponível projetada para análise microscópica é empregada para formar biofilmes. Em seguida, os biofilmes aderidos à superfície inferior são corados com SYTO9 e iodeto de propídio, lavados e, em seguida, visualizados com microscopia confocal de varredura a laser.
Introduction
Sabe-se que a Acinetobacter causa infecções nosocomiais é cada vez mais relatada1. Está disseminada em hospitais, serviços de saúde e ambientes associados à alimentação 2,3,4. Pode sobreviver por um longo período em ambientes que incluem superfícies hospitalares, como grades de cama, mesas de cabeceira, superfície de ventiladores e pias4. Essa persistência nas superfícies ambientais pode ser um dos fatores significativos que contribuem para as infecções nosocomiais de Acinetobacter4.
O biofilme é uma forma de vida microbiana e é uma matriz microbiana composta por células microbianas vivas e substâncias poliméricas extracelulares (EPS) provenientes das células5. As células microbianas estão embutidas na matriz e são frequentemente altamente resistentes a estresses ambientais como calor, sais, secura, antibióticos, desinfetantes e forças de cisalhamento 6,7.
Acinetobacter pode formar biofilmes em superfícies, sugerindo que pode contribuir para maior sobrevida em superfícies ambientais, incluindo superfícies hospitalares, e maior resistência ao tratamento com antibióticos 8,9. Além disso, a formação de biofilme de Acinetobacter poderia estar altamente associada a desfechos clínicos humanos8. Portanto, a formabilidade do biofilme de cepas de Acinetobacter pode ser um dos indicadores na predição de sobrevivência ambiental e infecções humanas 8,10.
Os biofilmes aderidos à superfície podem ser quantificados e visualizados para avaliar a formabilidade do biofilme. Para quantificar os biofilmes aderidos à superfície, os biofilmes são normalmente corados por corantes corantes de biofilme, como o violeta de cristal, e os corantes são eluídos em solução e medidos quanto à densidade óptica11. A visualização de biofilmes é outra boa abordagem para avaliar a conformabilidade do biofilme11. O método de visualização por microscopia confocal de varredura a laser (CLSM) empregando especificidade usando corantes fluorescentes poderia ser mais útil para caracterizar a morfologia do biofilme em comparação com outras técnicas, como aMEV12,13.
As células viáveis em biofilmes podem ser contadas para estimar o número de células viáveis em biofilmes11. As células viáveis embutidas em biofilmes são destacadas, diluídas, espalhadas em placas de ágar, incubadas e enumeradas. Como o maior número de células provavelmente atenderá à dose infecciosa, ele pode fornecer informações mais detalhadas sobre os biofilmes, como os potenciais de infecção associados ao número de células13,14.
Este artigo apresenta protocolos passo a passo para (1) quantificar biofilmes aderidos à superfície, (2) contar células viáveis nos biofilmes e (3) visualizar os biofilmes usando CLSM de Acinetobacter. Os protocolos apresentados descrevem os métodos para avaliar a conformabilidade do biofilme de isolados de Acinetobacter e caracterizar seus biofilmes.
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Protocol
1. Preparação do inóculo bacteriano
- Retire o frasco para injetáveis de glicerol armazenado a -80 °C.
- Retire a estirpe bacteriana (2-10 μL) do frasco para injetáveis utilizando uma ponta de pipeta estéril.
NOTA: Cepas de Acinetobacter , A. bouvetii (13-1-1), A. junii (13-1-2), A. pittii (13-2-5), A. baumannii (13-2-9), A. radioresistens (20-1) e A. ursingii (24-1) são utilizadas neste protocolo. - Inocular uma placa de ágar sangue comercialmente disponível (ágar de soja tríptico suplementado com 5% de sangue de carneiro, ver Tabela de Materiais) com as bactérias.
NOTA: Outros meios, como ágar nutriente ou ágar MacConkey, também podem ser usados. - Estrie a superfície do ágar usando uma alça estéril com chamas intermitentes para afiná-la.
- Coloque a placa de ágar de cabeça para baixo em uma incubadora e incube a 30 °C durante a noite por 20-24 h.
- Escolha uma única colônia da cultura bacteriana com uma agulha estéril e inocular 5 mL de caldo de infusão cerebral cerebral estéril (BHI, ver Tabela de Materiais) com a cultura.
- Incubar o caldo inoculado numa incubadora de agitação a 30 °C durante a noite durante 20-24 h a cerca de 150 rpm.
- Transferir 1 mL da cultura noturna para um tubo de microcentrífuga estéril e centrifugar a cultura noturna a 6.000 × g por 10 min à temperatura ambiente (TR).
- Retire o sobrenadante com uma pipeta.
- Usando um vórtice, ressuspenda o pellet em 1 mL de solução salina tamponada com fosfato estéril (PBS).
- Centrifugar a 6.000 × g por 10 min em RT e remover o sobrenadante.
- Ressuspender o pellet em BHI estéril dez vezes diluído usando vórtice para uma densidade óptica de cerca de 0,1 a 600 nm.
NOTA: A densidade óptica de cerca de 0,1 é equivalente a aproximadamente 107 UFC/mL.
2. Quantificação do biofilme utilizando cristal violeta
- Adicionar 200 μL de inóculo a cada poço de uma placa estéril de poliestireno de 96 poços (ver Tabela de Materiais) e adicionar 200 μL de água deionizada a cada um dos poços mais externos para evitar que os poços internos sequem15.
- Adicionar 200 μL de BHI diluído dez vezes a cada poço da mesma placa como controle negativo.
- Incubar a placa a 25 °C durante 24 horas.
- Retire o sobrenadante com uma pipeta.
NOTA: A pipeta multicanal é geralmente mais conveniente para várias amostras. - Adicione cuidadosamente 300 μL de PBS a cada poço e remova o sobrenadante com uma pipeta.
NOTA: A pipeta multicanal é geralmente mais conveniente para várias amostras. - Repita a etapa 2.5 mais duas vezes.
- Adicionar 200 μL de solução de cristal violeta (1%) (ver Tabela de Materiais) a cada poço e incubar em RT durante 30 minutos.
- Repita as etapas 2.4-2.6.
- Adicione 200 μL de etanol absoluto a cada poço e incube por 15 min em RT. Misture bem pipetando para cima e para baixo várias vezes.
- Transfira a eluição de 100 μL de cada poço para uma nova placa de 96 poços.
- Medir a absorbância a 595 nm utilizando um leitor de microplacas (ver Tabela de Materiais).
- Quando a absorbância exceder 2,0, fazer uma diluição adequada da amostra para a absorvância inferior a 2,0 em etanol absoluto e medi-la como na etapa 2.11. Em seguida, calcule a absorbância da amostra (valor final) multiplicando o valor observado pelo fator de diluição.
- Calcular a verdadeira absorbância das amostras subtraindo o valor médio do controlo negativo do valor de cada poço das amostras de ensaio na mesma placa de poço.
3. Contagem de viabilidade do biofilme
- Adicionar 1 mL de inóculo (passo 1) a cada poço de uma placa estéril de poliestireno de 12 poços15. Incubar a placa a 25 °C durante 24 horas. Retire o sobrenadante com uma pipeta.
- Adicione cuidadosamente 1,5 mL de PBS estéril a cada poço e remova o sobrenadante com uma pipeta. Adicionar 1 mL de PBS estéril a cada poço.
- Raspe as superfícies do fundo e da parede do poço usando raspadores de células adaptados.
- Transferir a suspensão celular colhida para um tubo plástico estéril (10-1) contendo 9 mL de solução salina (NaCl a 0,85%) e 10-20 esferas de vidro (ver Tabela de Materiais).
NOTA: Para coletar qualquer resíduo residual de biofilme deixado na superfície inferior do poço, ele pode ser ressuspendido e transferido por pipeta usando soro fisiológico do tubo 10-1 . - Vórtice o tubo 10-1 por 60 s em uma velocidade máxima.
- Fazer uma diluição seriada de 10 vezes transferindo 1 mL para o próximo tubo estéril (10-2) contendo 9 mL de solução salina (NaCl a 0,85%) até 10-7.
- Espalhe 100 μL de cada diluição em ágar Acinetobacter (ver Tabela de Materiais) e incube as placas de ágar a 30 °C durante 24-42 horas.
- Conte manualmente o número das colônias vermelhas típicas em cada placa no intervalo entre 10 e 250.
- Calcule o número de células viáveis no biofilme de cada poço utilizando a equação abaixo:
Células viáveis = Número de colônias × Fatores de diluição × 10
4. Visualização do biofilme por microscopia confocal de varredura a laser (CLSM)
- Adicionar 200 μL de inóculo a cada poço de uma placa estéril de 96 poços destinada à análise microscópica.
- Incubar a placa a 25 °C durante 24 horas.
- Retire o sobrenadante com uma pipeta.
- Adicione cuidadosamente 300 μL de água deionizada esterilizada por filtro a cada poço e remova o sobrenadante com uma pipeta.
- Repita a etapa 4.4.
- Preparar a mistura de SYTO 9 e iodeto de propídio (ver Tabela de Materiais) diluída em água deionizada esterilizada por filtro até uma concentração final de 10 μM e 60 μM, respectivamente.
- Adicione a mistura a cada poço a 200 μL e incube a placa por 20-30 min em TR no escuro.
- Repita as etapas 4.3-4.4
- Visualize os biofilmes acoplados à superfície inferior usando CLSM com comprimento de onda de excitação de 488 nm e 561 nm e a faixa de comprimento de onda de emissão de 499-535 nm e 568-712 nm, respectivamente.
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Representative Results
Seguindo o protocolo, os biofilmes dos isolados de Acinetobacter , originalmente isolados de superfícies de cozinha, foram formados em uma placa de poliestireno de 96 poços, corada com violeta de cristal, e os corantes foram solubilizados em etanol e medidos quanto à massa de biofilme (Figura 1). O número de biofilmes variou muito dependendo das cepas, variando de 0,04 a 1,69 DO (Figura 1). Com base nos critérios estabelecidos por Stepanović et al.16, todos os isolados, exceto A. bouvetii , formaram biofilmes. A. radioresistens formou um biofilme fraco. A. junii e A. baumannii formaram biofilmes moderados, enquanto A. pittii e A . ursingii formaram biofilmes fortes.
Para a contagem de células viáveis em biofilmes, os biofilmes foram raspados usando raspadores celulares, vórtices em alta velocidade, diluídos e espalhados nas placas seletivas de Acinetobacter . Após a incubação, o número de colônias foi contado para estimar o número de células do biofilme (Figura 2). Todos os isolados, exceto A. bouvetii , apresentaram células equivalentes a 7-8 Log UFC em seus biofilmes. Consistente com a propriedade não-formadora do biofilme mostrada pelo ensaio violeta de cristal, A. bouvetii teve um nível muito menor de número de células em 4,4 Log UFC.
Os biofilmes aderidos à superfície inferior foram visualizados usando CLSM (Figura 3). Uma quantidade substancial de biofilme foi encontrada em A. junii, A. baumannii e A. ursingii com morfologias distintas de biofilme. Enquanto A. pittii foi um forte formador de biofilme no ensaio violeta de cristal, ele não formou muito biofilme na superfície inferior.
Figura 1: Medição da massa do biofilme de Acinetobacter formado em uma placa de poliestireno de 96 poços usando ensaio violeta de cristal. As barras de erro representam o desvio padrão da triplicata. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Contagens viáveis de biofilmes de Acinetobacter formados em uma placa de poliestireno de 12 poços. As barras de erro representam o desvio padrão da duplicata. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Biofilmes de Acinetobacter aderidos à superfície inferior formados em uma placa de 96 poços visualizados por CLSM usando os corantes SYTO 9 e iodeto de propídio. Barras de escala: 50 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Usando o protocolo descrito, a formação de biofilme de isolados de Acinetobacter com graus variados foi medida, visualizada e as células viáveis nos biofilmes foram estimadas (Figura 1, Figura 2 e Figura 3).
Neste protocolo, foram utilizadas duas diferentes temperaturas, 30 °C para o crescimento e 25 °C para a formação do biofilme de Acinetobacter. 30 °C foi utilizado porque muitos estudos utilizaram mais de 30 °C para o crescimento ótimo de Acinetobacter, o que seria apropriado para a obtenção de inóculo suficiente12,13,14,17. No entanto, essa temperatura é geralmente mais alta do que as temperaturas do ambiente onde ocorreria a formação de biofilme, como superfícies hospitalares ou ambientes de processamento de alimentos. Portanto, 25 °C foi utilizado para a formação de biofilme, o que simularia mais essas condições ambientais.
Esse protocolo utilizou BHI diluído 10 vezes em vez do BHI original para formar biofilmes (passo 1.12). Muitas superfícies, como superfícies hospitalares ou ambientes de processamento de alimentos, são provavelmente hiponutritivas18,19. Além disso, microrganismos nas superfícies contaminadas permanecem nas superfícies após a limpeza e persistem nas condições de baixo nutriente20. Portanto, condições de baixo nutriente, como BHI diluído 10 vezes mais, são mais desejáveis do que condições de alto nutriente, como BHI original.
O ensaio violeta de cristal é um método geralmente aceito e bem estabelecido para medir a massa do biofilme, e este estudo mostrou que a formabilidade do biofilme de Acinetobacter é discernível em diferentes níveis usando este método.
A contagem viável no biofilme também é importante, pois as células viáveis nos biofilmes são responsáveis por infecções humanas que são mais prováveis de ocorrer por um número maior de células21. Além disso, a contagem viável pode ser uma boa ferramenta para distinguir produtores pobres de biofilme, como demonstrado em A. bouvetii e A. radioresistens (Figura 1 e Figura 2). A contagem viável de A. radioresistens foi muito maior que a de A. bouvetii, enquanto pouca diferença foi encontrada na massa do biofilme, sugerindo maior potencial de infecção por A. radioresistens (Figura 1 e Figura 2). Além disso, este método pode ser usado para estimar a proporção de Acinetobacter em biofilmes multiespécies, que é mais comum no ambiente.
Acinetobacter forma biofilme não só na superfície inferior, mas também na parede lateral, especialmente na interface ar-líquido em tubos17,22. A análise CLSM usando uma placa de microtitulação é limitada aos biofilmes anexados à superfície inferior, o que torna às vezes difícil comparar com os resultados pelo ensaio violeta de cristal, que mede todas as superfícies submersas, incluindo as superfícies da parede. Uma quantidade substancial de biofilme na interface ar-líquido também foi encontrada nesses isolados, especialmente no forte produtor de biofilme, A. pittii. Formou biofilme relativamente pobre na superfície inferior em comparação com outros isolados (Figura 3). Portanto, uma técnica de análise microscópica deve ser mais desenvolvida para visualizar os biofilmes formados na parede lateral.
Neste estudo, três diferentes ensaios, violeta de cristal, contagem de viáveis e CLSM, foram utilizados para caracterizar os biofilmes de Acinetobacter. O ensaio violeta de cristal é o método bem estabelecido para quantificar biofilmes, e os critérios para determinar a conformabilidade do biofilme existem16. No entanto, ele mede não apenas células vivas e EPS, mas também células mortas, que são menos significativas em termos de infecção humana e virulência. As células vivas em biofilmes podem ser medidas pelo método de contagem viável. No entanto, a formabilidade do biofilme não pode ser determinada pelo método de contagem viável porque este método não mede o EPS, um componente crítico na estrutura do biofilme. Portanto, esse método não possui critérios ou valores de corte para determinar a formabilidade do biofilme. Além disso, o método de contagem viável mede apenas a culturalidade das células e não mede as células em "estado viável, mas não cultivável"11. A presença de biofilmes pode ser confirmada pelo método CLSM, que visualiza efetivamente os biofilmes. No entanto, ele mede apenas biofilmes fixados à superfície inferior, embora os biofilmes também sejam frequentemente formados nas paredes laterais. Portanto, recomenda-se o uso do ensaio violeta de cristal para determinar a formabilidade do biofilme. Então, as células vivas e cultiváveis em biofilmes podem ser quantificadas pelo método de contagem viável, e os biofilmes aderidos à superfície inferior podem ser confirmados ou caracterizados pelo método CLSM.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Esta pesquisa foi apoiada pelo Programa Principal de Pesquisa (E0210702-03) do Korea Food Research Institute (KFRI), financiado pelo Ministério da Ciência e TIC.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96-well cell culture plate | SPL | 30096 | Polystyrene 96-well plate |
| BHI (Brain Heart Infusion) broth | Merck KGaA | 1.10493.0500 | |
| Blood Agar Base Plate | KisanBio | MB-B1005-P50 | Growth media for Acinetobacter |
| CHROMagar Acinetobacter | CHROMagar | AC092 | Selective plate for Acinetobacter |
| Crystal violet solution | Sigma-Aldrich | V5265 | |
| Filmtracer LIVE/DEAD biofilm viability kit | Invitrogen | L10316 | SYTO9 and propidium iodide |
| Microplate reader | Tecan | Infinite M200 PRO NanoQuant | Biofilm measurement |
| RBC Glass Plating Beads | RBC | RG001 | Glass beads |
| μ-Plate 96 Well Black | ibidi | 89621 | Microplate intended for CLSM |
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