Summary
Ce protocole décrit la préparation de l’inoculum, la quantification du biofilm sur des plaques de microtitration à l’aide d’un colorant violet cristallin, le nombre viable dans les biofilms et la visualisation des biofilms d’Acinetobacter.
Abstract
Acinetobacter provoque des infections nosocomiales et la formation de son biofilm peut contribuer à la survie sur des surfaces sèches telles que les environnements hospitaliers. Ainsi, la quantification et la visualisation du biofilm sont des méthodes importantes pour évaluer le potentiel des souches d’Acinetobacter à provoquer des infections nosocomiales. Les biofilms qui se forment à la surface de la microplaque peuvent être quantifiés en termes de volume et de nombre de cellules. Les volumes de biofilm peuvent être quantifiés par coloration à l’aide de violet cristallin, lavage, décoloration à l’éthanol, puis mesure du colorant solubilisé à l’aide d’un lecteur de microplaques. Pour quantifier le nombre de cellules incorporées dans les biofilms, les biofilms sont éliminés à l’aide de racleurs cellulaires, récoltés dans la solution saline, vigoureusement agités en présence de billes de verre et étalés sur gélose Acinetobacter. Ensuite, les plaques sont incubées à 30 °C pendant 24 à 42 h. Après incubation, les colonies rouges sont dénombrées pour estimer le nombre de cellules dans les biofilms. Cette méthode de comptage viable peut également être utile pour compter les cellules Acinetobacter dans les biofilms d’espèces mixtes. Les biofilms d’Acinetobacter peuvent être visualisés à l’aide de colorants fluorescents. Une microplaque disponible dans le commerce et conçue pour l’analyse microscopique est utilisée pour former des biofilms. Ensuite, les biofilms attachés à la surface inférieure sont colorés avec des colorants SYTO9 et à l’iodure de propidium, lavés, puis visualisés par microscopie confocale à balayage laser.
Introduction
Acinetobacter est connu pour provoquer des infections nosocomiales, et son infection humaine, en particulier dans les établissements de santé, est de plus en plus signalée1. Il est répandu dans les hôpitaux, les établissements de santé et les environnements associés à l’alimentation 2,3,4. Il peut survivre pendant une longue période dans des environnements tels que les surfaces hospitalières telles que les barrières de lit, les tables de chevet, la surface des ventilateurs et les éviers4. Une telle persistance sur les surfaces environnementales peut être l’un des facteurs importants contribuant aux infections nosocomiales d’Acinetobacter4.
Le biofilm est une forme de vie microbienne et est une matrice microbienne composée de cellules microbiennes vivantes et de substances polymères extracellulaires (EPS) provenant des cellules5. Les cellules microbiennes sont intégrées dans la matrice et sont souvent très résistantes aux stress environnementaux tels que la chaleur, les sels, la sécheresse, les antibiotiques, les désinfectants et les forces de cisaillement 6,7.
Acinetobacter peut former des biofilms sur les surfaces, ce qui suggère qu’il peut contribuer à une survie prolongée sur les surfaces environnementales, y compris les surfaces hospitalières, et à une résistance accrue aux traitements antibiotiques 8,9. De plus, la formation d’un biofilm d’Acinetobacter pourrait être fortement associée aux résultats cliniques chez l’homme8. Par conséquent, la formabilité du biofilm des souches d’Acinetobacter pourrait être l’un des indicateurs de prédiction de la survie environnementale et des infections humaines 8,10.
Les biofilms attachés à la surface peuvent être quantifiés et visualisés pour évaluer la formabilité du biofilm. Pour quantifier les biofilms attachés à la surface, les biofilms sont normalement colorés par des colorants de coloration du biofilm tels que le violet cristallin, et les colorants sont élués en solution et mesurés pour la densité optique11. La visualisation des biofilms est une autre bonne approche pour évaluer la formabilité des biofilms11. La méthode de visualisation de la microscopie confocale à balayage laser (CLSM) utilisant la spécificité à l’aide de colorants fluorescents pourrait être plus utile pour caractériser la morphologie du biofilm par rapport à d’autres techniques telles que MEB12,13.
Les cellules viables dans les biofilms peuvent être comptées pour estimer le nombre de cellules viables dans les biofilms11. Les cellules viables intégrées dans les biofilms sont détachées, diluées, étalées sur des plaques de gélose, incubées et dénombrées. Étant donné que le nombre plus élevé de cellules est susceptible de répondre à la dose infectieuse, il peut fournir des informations plus détaillées sur les biofilms, tels que les potentiels d’infection associés au nombre de cellules13,14.
Cet article présente des protocoles étape par étape pour (1) quantifier les biofilms attachés à la surface, (2) compter les cellules viables dans les biofilms et (3) visualiser les biofilms à l’aide du CLSM d’Acinetobacter. Les protocoles présentés décrivent les méthodes permettant d’évaluer la formabilité du biofilm des isolats d’Acinetobacter et de caractériser leurs biofilms.
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Protocol
1. Préparation de l’inoculum bactérien
- Retirez le flacon de glycérol stocké à -80 °C.
- Retirez la souche bactérienne (2-10 μL) du flacon à l’aide d’un embout de pipette stérile.
NOTA : Les souches d’Acinetobacter A. bouvetii (13-1-1), A. junii (13-1-2), A. pittii (13-2-5), A. baumannii (13-2-9), A. radioresistens (20-1) et A. ursingii (24-1) sont utilisées dans ce protocole. - Inoculez la bactérie à une plaque de gélose au sang disponible dans le commerce (gélose tryptique au soja additionnée de 5 % de sang de mouton, voir le tableau des matériaux).
REMARQUE : D’autres milieux, tels que la gélose nutritive ou la gélose MacConkey, peuvent également être utilisés. - Striez la surface de la gélose à l’aide d’une boucle stérile avec un flambage intermittent pour l’amincir.
- Placez la plaque de gélose à l’envers dans un incubateur et incubez à 30 °C pendant une nuit de 20 à 24 h.
- Prélever une seule colonie de la culture bactérienne à l’aide d’une aiguille stérile et inoculer 5 ml de bouillon stérile pour perfusion de cerveau et de cœur (BHI, voir le tableau des matériaux) avec la culture.
- Incuber le bouillon inoculé dans un incubateur à agitation à 30 °C pendant une nuit de 20 à 24 h à environ 150 tr/min.
- Transférez 1 mL de la culture de nuit dans un tube de microcentrifugation stérile et centrifugez la culture de nuit à 6 000 × g pendant 10 minutes à température ambiante (RT).
- Retirez le surnageant à l’aide d’une pipette.
- À l’aide d’un vortex, remettre le granulé en suspension dans 1 mL de solution saline stérile tamponnée au phosphate (PBS).
- Centrifuger à 6 000 × g pendant 10 min à RT et retirer le surnageant.
- Remettre en suspension la pastille dans un BHI stérile dix fois dilué à l’aide d’un vortex jusqu’à une densité optique d’environ 0,1 à 600 nm.
REMARQUE : La densité optique d’environ 0,1 est équivalente à environ 107 UFC/mL.
2. Quantification du biofilm à l’aide du violet cristallin
- Ajouter 200 μL d’inoculum à chaque puits d’une plaque de polystyrène stérile à 96 puits (voir le tableau des matériaux) et ajouter 200 μL d’eau déminéralisée à chacun des puits les plus à l’extérieur pour éviter que les puits intérieurs ne se dessèchent15.
- Ajouter 200 μL de BHI dilué dix fois dans chaque puits de la même plaque comme témoin négatif.
- Incuber la plaque à 25 °C pendant 24 h.
- Retirez le surnageant à l’aide d’une pipette.
REMARQUE : La pipette multicanal est souvent plus pratique pour plusieurs échantillons. - Ajouter délicatement 300 μL de PBS dans chaque puits et retirer le surnageant à l’aide d’une pipette.
REMARQUE : La pipette multicanal est souvent plus pratique pour plusieurs échantillons. - Répétez l’étape 2.5 deux fois de plus.
- Ajouter 200 μL de solution cristalline violette (1 %) (voir le tableau des matériaux) dans chaque puits et incuber à RT pendant 30 minutes.
- Répétez les étapes 2.4 à 2.6.
- Ajouter 200 μL d’éthanol absolu dans chaque puits et incuber pendant 15 min à RT. Bien mélanger en pipetant de haut en bas plusieurs fois.
- Transférez 100 μL d’élution de chaque puits vers une nouvelle plaque de 96 puits.
- Mesurer l’absorbance à 595 nm à l’aide d’un lecteur de microplaques (voir Tableau des matériaux).
- Lorsque l’absorbance est supérieure à 2,0, diluer correctement l’échantillon jusqu’à ce qu’il soit inférieur à 2,0 dans l’éthanol absolu et le mesurer comme à l’étape 2.11. Ensuite, calculez l’absorbance de l’échantillon (valeur finale) en multipliant la valeur observée par le facteur de dilution.
- Calculer l’absorbance réelle des échantillons en soustrayant la valeur moyenne du témoin négatif de la valeur de chaque puits des échantillons d’essai sur la même plaque de puits.
3. Dénombrement de la viabilité du biofilm
- Ajouter 1 mL d’inoculum (étape 1) dans chaque puits d’une plaque de polystyrène stérile à 12 puits15. Incuber la plaque à 25 °C pendant 24 h. Retirez le surnageant à l’aide d’une pipette.
- Ajouter délicatement 1,5 mL de PBS stérile dans chaque puits et retirer le surnageant à l’aide d’une pipette. Ajouter 1 mL de PBS stérile dans chaque puits.
- Grattez le fond et les parois du puits à l’aide de grattoirs à cellules ajustés.
- Transférez la suspension cellulaire récoltée dans un tube en plastique stérile (10-1) contenant 9 mL de solution saline (0,85 % de NaCl) et 10 à 20 billes de verre (voir le tableau des matériaux).
REMARQUE : Pour recueillir les débris résiduels du biofilm laissés sur la surface inférieure du puits, ils peuvent être remis en suspension et transférés à l’aide d’une pipette à l’aide d’une solution saline du tube 10-1 . - Vortex le tube 10-1 pendant 60 s à une vitesse maximale.
- Effectuer une dilution en série 10 fois en transférant 1 mL dans le tube stérile suivant (10-2) contenant 9 mL de solution saline (0,85 % de NaCl) jusqu’à 10-7.
- Étaler 100 μL de chaque dilution sur une gélose Acinetobacter (voir tableau des matériaux) et incuber les plaques de gélose à 30 °C pendant 24 à 42 h.
- Comptez manuellement le nombre de colonies rouges typiques sur chaque plaque entre 10 et 250.
- Calculez le nombre de cellules viables dans le biofilm de chaque puits à l’aide de l’équation ci-dessous :
Cellules viables = Nombre de colonies × Facteurs de dilution × 10
4. Visualisation du biofilm à l’aide de la microscopie confocale à balayage laser (CLSM)
- Ajouter 200 μL d’inoculum dans chaque puits d’une plaque stérile à 96 puits destinée à l’analyse microscopique.
- Incuber la plaque à 25 °C pendant 24 h.
- Retirez le surnageant à l’aide d’une pipette.
- Ajouter délicatement 300 μL d’eau déminéralisée stérilisée par filtre dans chaque puits et retirer le surnageant à l’aide d’une pipette.
- Répétez l’étape 4.4.
- Préparer le mélange de SYTO 9 et d’iodure de propidium (voir le tableau des matériaux) dilué dans de l’eau déminéralisée stérilisée par filtre jusqu’à une concentration finale de 10 μM et 60 μM, respectivement.
- Ajouter le mélange dans chaque puits à 200 μL et incuber la plaque pendant 20-30 min à RT dans l’obscurité.
- Répétez les étapes 4.3 et 4.4
- Visualisez les biofilms attachés à la surface inférieure à l’aide de CLSM avec une longueur d’onde d’excitation de 488 nm et 561 nm et une gamme de longueurs d’onde d’émission de 499 à 535 nm et de 568 à 712 nm, respectivement.
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Representative Results
Suivant le protocole, les biofilms d’isolats d’Acinetobacter, isolés à l’origine des surfaces de cuisine, ont été formés sur une plaque de polystyrène à 96 puits, colorée au violet cristallin, et les colorants ont été solubilisés dans de l’éthanol et mesurés pour la masse du biofilm (Figure 1). Le nombre de biofilms variait considérablement en fonction des souches, allant de 0,04 à 1,69 OD (Figure 1). Sur la base des critères établis par Stepanović et al.16, tous les isolats, à l’exception d’A. bouvetii, ont formé des biofilms. A. radioresistens a formé un biofilm faible. A. junii et A. baumannii ont formé des biofilms modérés, tandis que A. pittii et A. ursingii ont formé des biofilms forts.
Pour compter les cellules viables dans les biofilms, les biofilms ont été grattés à l’aide de racleurs cellulaires, vortex à grande vitesse, dilués et étalés sur les plaques sélectives d’Acinetobacter . Après incubation, le nombre de colonies a été compté pour estimer le nombre de cellules du biofilm (Figure 2). Tous les isolats, à l’exception d’A. bouvetii , avaient des cellules équivalentes à 7-8 Log UFC dans leurs biofilms. Conformément à la propriété de non-formation du biofilm démontrée par l’essai au violet cristallin, A. bouvetii avait un niveau beaucoup plus faible de nombre de cellules à 4,4 Log UFC.
Les biofilms attachés à la surface inférieure ont été visualisés à l’aide du CLSM (Figure 3). Une quantité importante de biofilm a été trouvée chez A. junii, A. baumannii et A. ursingii avec des morphologies de biofilm distinctes. Alors que A. pittii était un solide biofilm dans l’essai de violet cristallin, il ne formait pas beaucoup de biofilm sur la surface inférieure.
Figure 1 : Mesure de la masse du biofilm d’Acinetobacter formé sur une plaque de polystyrène à 96 puits à l’aide d’un test au violet cristallin. Les barres d’erreur représentent l’écart type par rapport au triple. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Dénombrement viable des biofilms d’Acinetobacter formés sur une plaque de polystyrène à 12 puits. Les barres d’erreur représentent l’écart-type par rapport au doublon. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Biofilms d’Acinetobacter attachés à la surface inférieure formés sur une plaque à 96 puits visualisés par CLSM à l’aide de colorants SYTO 9 et d’iodure de propidium. Barres d’échelle : 50 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
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Discussion
À l’aide du protocole décrit, la formation de biofilms d’isolats d’Acinetobacter à des degrés divers a été mesurée, visualisée et les cellules viables dans les biofilms ont été estimées (Figure 1, Figure 2 et Figure 3).
Dans ce protocole, deux températures différentes ont été utilisées, 30 °C pour la croissance et 25 °C pour la formation du biofilm d’Acinetobacter. 30 °C a été utilisé parce que de nombreuses études ont utilisé plus de 30 °C pour la croissance optimale d’Acinetobacter, ce qui serait approprié pour obtenir suffisamment d’inoculum12,13,14,17. Cependant, cette température est généralement plus élevée que les températures de l’environnement où se produirait la formation de biofilm, comme les surfaces des hôpitaux ou les environnements de transformation des aliments. Par conséquent, 25 °C ont été utilisés pour la formation du biofilm, ce qui simulerait davantage ces conditions environnementales.
Ce protocole utilisait du BHI dilué 10 fois au lieu du BHI original pour former des biofilms (étape 1.12). De nombreuses surfaces, telles que les surfaces des hôpitaux ou les environnements de transformation des aliments, sont susceptibles d’être pauvres en nutriments18,19. De plus, les micro-organismes présents sur les surfaces contaminées restent sur les surfaces après le nettoyage et persistent dans des conditions de faible teneur en nutriments20. Par conséquent, les conditions à faible teneur en nutriments, telles que le BHI dilué 10 fois, sont plus souhaitables que les conditions à forte teneur en nutriments, telles que le BHI d’origine.
Le test au violet cristallin est une méthode généralement acceptée et bien établie pour mesurer la masse du biofilm, et cette étude a montré que la formabilité du biofilm d’Acinetobacter est discernable à différents niveaux en utilisant cette méthode.
Le nombre de cellules viables dans le biofilm est également important, car les cellules viables dans les biofilms sont responsables des infections humaines qui sont plus susceptibles de se produire par un plus grand nombre de cellules21. De plus, le dénombrement viable peut être un bon outil pour distinguer les producteurs de biofilm médiocres, comme l’ont démontré A. bouvetii et A. radioresistens (figure 1 et figure 2). Le nombre viable d’A. radioresistens était beaucoup plus élevé que celui d’A. bouvetii, tandis que peu de différence a été trouvée dans la masse du biofilm, ce qui suggère un potentiel plus élevé d’infection par A. radioresistens (Figure 1 et Figure 2). De plus, cette méthode peut être utilisée pour estimer la proportion d’Acinetobacter dans les biofilms multi-espèces, qui est plus fréquente dans l’environnement.
Acinetobacter forme un biofilm non seulement sur la surface inférieure mais aussi sur la paroi latérale, en particulier à l’interface air-liquide dans les tubes17,22. L’analyse CLSM à l’aide d’une plaque de microtitration est limitée aux biofilms attachés à la surface inférieure, ce qui rend parfois difficile la comparaison avec les résultats du test au violet cristallin, qui mesure toutes les surfaces immergées, y compris les surfaces des parois. Une quantité substantielle de biofilm à l’interface air-liquide a également été trouvée dans ces isolats, en particulier le producteur de biofilm fort, A. pittii. Il a formé un biofilm relativement pauvre sur la surface inférieure par rapport à d’autres isolats (Figure 3). Par conséquent, une technique d’analyse microscopique doit être développée pour visualiser les biofilms formés au niveau de la paroi latérale.
Dans cette étude, trois tests différents, le violet cristallin, le comptage viable et le CLSM, ont été utilisés pour caractériser les biofilms d’Acinetobacter. Le test au violet cristallin est la méthode bien établie pour quantifier les biofilms, et les critères pour déterminer la formabilité du biofilm existent16. Cependant, il mesure non seulement les cellules vivantes et l’EPS, mais aussi les cellules mortes, qui sont moins significatives en termes d’infection humaine et de virulence. Les cellules vivantes dans les biofilms peuvent être mesurées par la méthode du comptage viable. Cependant, la formabilité du biofilm ne peut pas être déterminée par la méthode du dénombrement viable, car cette méthode ne mesure pas l’EPS, un composant essentiel de la structure du biofilm. Par conséquent, cette méthode n’a pas les critères ou la valeur limite pour déterminer la formabilité du biofilm. De plus, la méthode de comptage viable ne mesure que la cultivabilité des cellules et ne mesure pas les cellules à l’état « viable mais non cultivable »11. La présence de biofilms peut être confirmée par la méthode CLSM, qui permet de visualiser efficacement les biofilms. Cependant, il ne mesure que les biofilms attachés à la surface inférieure, bien que des biofilms se forment souvent sur les parois latérales. Par conséquent, il est recommandé d’utiliser le test du violet cristallin pour déterminer la formabilité du biofilm. Ensuite, les cellules vivantes et cultivables dans les biofilms peuvent être quantifiées par la méthode du comptage viable, et les biofilms attachés à la surface du fond peuvent être confirmés ou caractérisés par la méthode CLSM.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Cette recherche a été financée par le Programme principal de recherche (E0210702-03) de l’Institut coréen de recherche sur l’alimentation (KFRI), financé par le ministère des Sciences et des TIC.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96-well cell culture plate | SPL | 30096 | Polystyrene 96-well plate |
| BHI (Brain Heart Infusion) broth | Merck KGaA | 1.10493.0500 | |
| Blood Agar Base Plate | KisanBio | MB-B1005-P50 | Growth media for Acinetobacter |
| CHROMagar Acinetobacter | CHROMagar | AC092 | Selective plate for Acinetobacter |
| Crystal violet solution | Sigma-Aldrich | V5265 | |
| Filmtracer LIVE/DEAD biofilm viability kit | Invitrogen | L10316 | SYTO9 and propidium iodide |
| Microplate reader | Tecan | Infinite M200 PRO NanoQuant | Biofilm measurement |
| RBC Glass Plating Beads | RBC | RG001 | Glass beads |
| μ-Plate 96 Well Black | ibidi | 89621 | Microplate intended for CLSM |
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