Summary
该方案描述了接种物的制备，使用结晶紫染料在微量滴定板上的生物膜定量，生物膜中的活菌计数以及 不动杆菌生物膜的可视化。
Abstract
不动杆菌 会引起院内感染，其生物膜的形成有助于在医院环境等干燥表面上存活。因此，生物膜定量和可视化是评估 不动杆菌菌 株引起医院感染潜力的重要方法。在微孔板表面形成的生物膜可以根据体积和细胞数量进行量化。生物膜体积可以通过使用结晶紫染色、洗涤、使用乙醇脱色，然后使用酶标仪测量溶解染料来定量。为了量化嵌入生物膜中的细胞数量，使用细胞刮刀将生物膜刮掉，在盐水中收获，在玻璃珠存在下剧烈搅拌，并涂抹在不动杆菌琼脂上。然后，将板在30°C孵育24-42小时。孵育后，计数红色菌落以估计生物膜中的细胞数。这种可行的计数方法也可用于计数混合物种生物膜中的 不动杆菌 细胞。 不动杆菌 生物膜可以使用荧光染料进行可视化。使用设计用于显微分析的市售微孔板来形成生物膜。然后，用SYTO9和碘化丙啶染料染色底表面附着的生物膜，洗涤，然后用共聚焦激光扫描显微镜观察。
Introduction
已知不动杆菌会引起医院感染，其人类感染，尤其是在医疗机构中，越来越多的报道1.它广泛存在于医院、医疗机构和食品相关环境中 2,3,4。它可以在包括医院表面（如床栏、床头柜、呼吸机表面和水槽）在内的环境中长期存活4.这种在环境表面的持久性可能是导致不动杆菌4 院内感染的重要因素之一。
生物膜是微生物生命的一种形式，是由活的微生物细胞和来自细胞的细胞外聚合物物质（EPS）组成的微生物基质5。微生物细胞嵌入基质中，通常对环境压力（如热、盐、干燥、抗生素、消毒剂和剪切力）具有很强的抵抗力6,7。
不动杆菌可以在表面上形成生物膜，这表明它可能有助于延长在环境表面（包括医院表面）的存活时间，并增强对抗生素治疗的耐药性8,9。此外，不动杆菌的生物膜形成可能与人类临床结果高度相关8。因此，不动杆菌菌株的生物膜形成性可能是预测环境生存和人类感染的指标之一8,10。
表面附着的生物膜可以被量化和可视化，以评估生物膜的形成性。为了量化表面附着的生物膜，通常用生物膜染色染料（如结晶紫）对生物膜进行染色，并将染料在溶液中洗脱并测量光密度11。生物膜的可视化是评估生物膜形成性的另一种好方法11。与其他技术（如 SEM12,13）相比，使用荧光染料的特异性共聚焦激光扫描显微镜 （CLSM） 可视化方法可能更有助于表征生物膜形态。
可以对生物膜中的活细胞进行计数，以估计生物膜中的活细胞数量11。将嵌入生物膜中的活细胞分离、稀释、铺在琼脂平板上、孵育和计数。由于较高的细胞数可能满足感染剂量，因此可以提供有关生物膜的更详细的信息，例如与细胞数相关的感染电位13,14。
本文介绍了 （1） 量化表面附着的生物膜，（2） 对生物膜中的活细胞进行计数，以及 （3） 使用 Acinetobacter 的 CLSM 可视化生物膜的分步方案。所提出的方案描述了评估 不动杆菌 分离株的生物膜形成性和表征其生物膜的方法。
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Protocol
1.细菌接种物的制备
- 取出储存在-80°C的甘油储备瓶。
- 使用无菌移液器吸头从小瓶中取出细菌菌株（2-10μL）。
注： 不动杆菌 菌株， 布维 曲霉（13-1-1）， 朱氏 曲霉（13-1-2）， 皮蒂 曲霉（13-2-5）， 鲍曼 曲霉（13-2-9）， 放射性曲霉 （20-1）和 乌辛曲 霉（24-1）用于本协议。 - 用细菌接种市售的血琼脂平板（补充有5%羊血的胰蛋白酶大豆琼脂，见 材料表）。
注意：也可以使用其他培养基，例如营养琼脂或MacConkey琼脂。 - 使用间歇性燃烧的无菌环在琼脂表面划线以使其变薄。
- 将琼脂平板倒置在培养箱中，并在30°C下孵育20-24小时。
- 用无菌针头挑选细菌培养物的单个菌落，并用培养物接种5mL无菌脑心脏输注液（BHI，参见 材料表）。
- 将接种的肉汤在30°C的振荡培养箱中以约150rpm孵育20-24小时。
- 将 1 mL 过夜培养物转移到无菌微量离心管中，并在室温 （RT） 下以 6,000 × g 离心过夜培养物 10 分钟。
- 用移液管除去上清液。
- 使用涡旋，将沉淀重悬于 1 mL 无菌磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 中。
- 在室温下以6,000× g 离心10分钟，除去上清液。
- 在600nm处使用涡旋至约0.1的光密度，将沉淀重悬于无菌的10倍稀释BHI中。
注：约 0.1 的光密度相当于约 107 CFU/mL。
2. 使用结晶紫进行生物膜定量
- 向无菌聚苯乙烯 96 孔板的每个孔中加入 200 μL 接种物（参见 材料表），并向最外层的每个孔中加入 200 μL 去离子水以防止内孔变干15.
- 向同一板的每个孔中加入 200 μL 10 倍稀释的 BHI 作为阴性对照。
- 将板在25°C孵育24小时。
- 用移液管除去上清液。
注意：多通道移液器通常更方便用于多个样品。 - 小心地向每个孔中加入300μL PBS，并用移液管除去上清液。
注意：多通道移液器通常更方便用于多个样品。 - 再重复步骤 2.5 两次。
- 向每个孔中加入 200 μL 结晶紫溶液 （1%）（参见 材料表），并在室温下孵育 30 分钟。
- 重复步骤 2.4-2.6。
- 向每个孔中加入 200 μL 无水乙醇，并在室温下孵育 15 分钟，通过上下移液数次彻底混合。
- 将 100 μL 洗脱液从每个孔转移到新的 96 孔板中。
- 使用酶标仪测量595nm处的吸光度（参见 材料表）。
- 当吸光度超过2.0时，将样品在无水乙醇中适当稀释至2.0以下的吸光度，并按步骤2.11进行测量。然后，通过将观察值乘以稀释因子来计算样品的吸光度（最终值）。
- 通过从同一孔板上测试样品的每个孔的值中减去阴性对照的平均值来计算样品的真实吸光度。
3. 生物膜活力计数
- 向无菌聚苯乙烯 12 孔板15 的每个孔中加入 1 mL 接种物（步骤 1）。将板在25°C孵育24小时。用移液管除去上清液。
- 小心地向每个孔中加入 1.5 mL 无菌 PBS，并用移液管除去上清液。向每个孔中加入 1 mL 无菌 PBS。
- 使用安装的细胞刮刀刮掉孔的底部和壁面。
- 将收获的细胞悬液转移到含有 9 mL 盐水 （0.85% NaCl） 和 10-20 个玻璃珠的无菌塑料管 （10-1） 中（参见 材料表）。
注意：要收集残留在孔底面上的任何残留生物膜碎片，可以将其重新悬浮并使用10-1 管中的生理盐水通过移液管转移。 - 以最大速度涡旋10-1 管60秒。
- 通过将 1 mL 转移到下一个含有 9 mL 盐水 （0.85 % NaCl） 至 10-7 的无菌管 （10-2） 中，进行 10 倍的连续稀释。
- 将每种稀释液中的100μL涂布在不动杆菌琼脂上（参见 材料表），并将琼脂平板在30°C下孵育24-42小时。
- 手动计算每个板上典型红色菌落的数量，范围在 10 到 250 之间。
- 使用以下公式计算每个孔的生物膜中的活细胞数：
活细胞 = 菌落数 × 稀释因子 × 10
4. 使用共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）进行生物膜可视化
- 向用于显微镜分析的无菌 96 孔板的每个孔中加入 200 μL 接种物。
- 将板在25°C孵育24小时。
- 用移液管除去上清液。
- 小心地向每个孔中加入 300 μL 过滤灭菌的去离子水，并用移液管除去上清液。
- 重复步骤 4.4。
- 制备在过滤灭菌的去离子水中稀释至最终浓度分别为10μM和60μM的SYTO 9和碘化丙啶（见 材料表）的混合物。
- 将混合物以 200 μL 加入每个孔中，并在室温下在黑暗中孵育板 20-30 分钟。
- 重复步骤 4.3-4.4
- 使用激发波长分别为 488 nm 和 561 nm，发射波长范围为 499-535 nm 和 568-712 nm 的 CLSM 可视化底表面附着的生物膜。
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Representative Results
按照该方案，最初从厨房表面分离的 不动杆菌 分离株的生物膜在聚苯乙烯96孔板上形成，用结晶紫染色，并将染料溶解在乙醇中并测量生物膜质量（图1）。生物膜的数量因菌株而异，范围从OD 0.04到1.69（图1）。根据 Stepanović 等人 16 建立的标准，除 A. bouvetii 外，所有分离株都形成了生物膜。 A.放射性抗性剂 形成弱生物膜。 朱 氏曲霉和 鲍曼 曲霉形成中等生物膜，而 皮蒂 曲霉和 乌尔辛吉曲 霉形成强生物膜。
为了对生物膜中的活细胞进行计数，使用细胞刮刀刮掉生物膜，高速涡旋，稀释并在 不动杆菌 选择性板上铺展。孵育后，计算菌落数以估计生物膜细胞的数量（图2）。除 A. bouvetii 外，所有分离株的生物膜中都具有相当于 7-8 Log CFU 的细胞。与结晶紫测定显示的生物膜非形成特性一致， 布维曲 霉在 4.4 Log CFU 时的细胞数量水平要低得多。
使用CLSM可视化底面附着的生物膜（图3）。在 黄芪、 鲍曼苜蓿和 熊芥 中发现了大量的生物膜，具有不同的生物膜形态。虽然 A. pittii 在结晶紫测定中是一种强生物膜形成者，但它在底面没有形成太多生物膜。
图 1：使用结晶紫测定法测量在聚苯乙烯 96 孔板上形成的 不动杆菌 的生物膜质量。 误差线表示与一式三份的标准偏差。 请点击这里查看此图的较大版本.
图 2：在聚苯乙烯 12 孔板上形成的 不动杆 菌生物膜的活菌计数。 误差线表示与重复项的标准偏差。 请点击这里查看此图的较大版本.
图 3：使用 SYTO 9 和碘化丙啶染料通过 CLSM 可视化的 96 孔板上形成的底表面附着 不动杆菌 生物膜。 比例尺：50 μm。 请点击这里查看此图的较大版本.
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Discussion
使用所描述的方案，测量、可视化不同程度的不动杆菌分离株的生物膜形成，并估计生物膜中的活细胞（图1、图2和图3）。
在该方案中，使用两种不同的温度，30°C用于生长，25°C用于不动杆菌的生物膜形成。使用30°C是因为许多研究使用超过30°C的不动杆菌的最佳生长，这对于获得足够的接种物是合适的12,13,14,17。然而，该温度通常高于会形成生物膜的环境温度，例如医院表面或食品加工环境。因此，使用25°C进行生物膜形成，这将更好地模拟这些环境条件。
该方案使用10倍稀释的BHI代替原始BHI形成生物膜（步骤1.12）。许多表面，如医院表面或食品加工环境，可能是低营养的18,19。此外，受污染表面上的微生物在清洁后仍留在表面上，并在低营养条件下持续存在20。因此，低营养条件（如10倍稀释的BHI）比高营养条件（如原始BHI）更可取。
结晶紫测定法是一种公认的、公认的测量生物膜质量的方法，本研究表明，通过使用这种方法， 不动杆菌 的生物膜形成性在不同水平上是可辨别的。
生物膜中的活细胞计数也很重要，因为生物膜中的活细胞是人类感染的原因，而人类感染更有可能由更多的细胞发生21。此外，活菌计数可能是区分不良生物膜产生者的良好工具，如 A. bouvetii 和 A. radioresistens 所示（图1 和 图2）。 A. radioresistens 的活菌数远高于 A. bouvetii，而生物膜质量差异不大，表明 A. radioresistens 感染的可能性更高（图 1 和 图 2）。此外，该方法可用于估计多物种生物膜中 不动杆菌 的比例，这在环境中更为常见。
不动杆菌不仅在底面形成生物膜，而且在侧壁上形成生物膜，特别是在管17,22的气液界面处。使用微量滴定板的CLSM分析仅限于底面附着的生物膜，这使得有时很难与结晶紫测定的结果进行比较，结晶紫测定法测量所有浸没表面，包括壁表面。在这些分离株中还发现了大量气液界面处的生物膜，尤其是强生物膜生产者 A. pittii。与其他分离株相比，它在底面形成的生物膜相对较差（图3）。因此，必须进一步开发一种显微分析技术，以可视化在侧壁形成的生物膜。
在这项研究中，使用了三种不同的测定法，即结晶紫、活菌计数和 CLSM，以表征 不动杆菌的生物膜。结晶紫测定法是定量生物膜的成熟方法，并且存在确定生物膜形成性的标准16。然而，它不仅测量活细胞和EPS，还测量死细胞，这在人类感染和毒力方面意义不大。生物膜中的活细胞可以通过活菌计数法进行测量。然而，生物膜的形成性不能通过活菌计数法确定，因为该方法不能测量EPS，而EPS是生物膜结构中的关键成分。因此，该方法不具备确定生物膜形成性的标准或临界值。此外，活菌计数方法仅测量细胞的可培养性，而不测量“活但不可培养状态”下的细胞11。生物膜的存在可以通过CLSM方法确认，该方法可以有效地可视化生物膜。然而，它只测量底面附着的生物膜，尽管生物膜也经常在侧壁上形成。因此，建议使用结晶紫测定法来确定生物膜的形成性。然后，可以通过活菌计数法对生物膜中的活细胞和可培养细胞进行定量，并通过CLSM方法确认或表征底表面附着的生物膜。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项研究得到了韩国食品研究所（KFRI）的主要研究计划（E0210702-03）的支持，该计划由科学和信息通信技术部资助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96-well cell culture plate | SPL | 30096 | Polystyrene 96-well plate |
| BHI (Brain Heart Infusion) broth | Merck KGaA | 1.10493.0500 | |
| Blood Agar Base Plate | KisanBio | MB-B1005-P50 | Growth media for Acinetobacter |
| CHROMagar Acinetobacter | CHROMagar | AC092 | Selective plate for Acinetobacter |
| Crystal violet solution | Sigma-Aldrich | V5265 | |
| Filmtracer LIVE/DEAD biofilm viability kit | Invitrogen | L10316 | SYTO9 and propidium iodide |
| Microplate reader | Tecan | Infinite M200 PRO NanoQuant | Biofilm measurement |
| RBC Glass Plating Beads | RBC | RG001 | Glass beads |
| μ-Plate 96 Well Black | ibidi | 89621 | Microplate intended for CLSM |
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