Summary
이 프로토콜은 접종물의 준비, 크리스탈 바이올렛 염료를 사용한 마이크로타이터 플레이트의 생물막 정량화, 생물막의 생존 가능한 수 및 아시네토박터의 생물막 시각화에 대해 설명합니다.
Abstract
아시네토박터는 병원 내 감염을 일으키며 생물막 형성은 병원 환경과 같은 건조한 표면에서 생존에 기여할 수 있습니다. 따라서 생물막 정량화 및 시각화는 아시네토박터 균주가 병원 내 감염을 일으킬 가능성을 평가하는 중요한 방법입니다. 마이크로플레이트 표면에 형성되는 생물막은 부피와 세포 수 측면에서 정량화할 수 있습니다. 생물막 부피는 크리스탈 바이올을 사용하여 염색하고, 세척하고, 에탄올을 사용하여 탈염한 다음, 마이크로플레이트 리더를 사용하여 가용화된 염료를 측정하여 정량화할 수 있습니다. 생물막에 묻힌 세포의 수를 정량화하기 위해 세포 스크레이퍼를 사용하여 생물막을 긁어내고, 식염수에서 수확하고, 유리 구슬의 존재 하에서 격렬하게 교반하고, 아시네토박터 한천에 퍼뜨립니다. 그런 다음 플레이트를 30°C에서 24-42시간 동안 배양합니다. 배양 후에, 빨간 식민지는 biofilms에 있는 세포의 수를 추정하기 위하여 열거됩니다. 이 실행 가능한 계수 방법은 혼합 종 생물막에서 아시네토박터 세포를 계수하는 데에도 유용할 수 있습니다. 아시네토박터 생물막은 형광 염료를 사용하여 시각화할 수 있습니다. 현미경 분석을 위해 설계된 상업적으로 이용 가능한 마이크로플레이트는 생물막을 형성하는 데 사용됩니다. 그런 다음 바닥 표면에 부착된 생물막을 SYTO9 및 프로피듐 요오드화물 염료로 염색하고 세척한 다음 컨포칼 레이저 스캐닝 현미경으로 시각화합니다.
Introduction
아시네토박터는 병원 내 감염을 일으키는 것으로 알려져 있으며, 특히 의료 시설에서 인체 감염이 점점 더 많이 보고되고 있습니다1. 병원, 의료 시설 및 식품 관련 환경에 널리 퍼져 있습니다 2,3,4. 침대 레일, 침대 옆 탁자, 인공 호흡기 표면 및 싱크대와 같은 병원 표면을 포함한 환경에서 장기간 생존할 수 있습니다4. 환경 표면에서의 이러한 지속성은 아시네토박터4의 병원 감염에 기여하는 중요한 요인 중 하나일 수 있습니다.
생물막은 미생물 생명체의 한 형태이며 살아있는 미생물 세포와 세포의 세포외 고분자 물질(EPS)로 구성된 미생물 매트릭스입니다5. 미생물 세포는 매트릭스에 내장되어 있으며 종종 열, 염분, 건조, 항생제, 소독제 및 전단력과 같은 환경 스트레스에 매우 강합니다 6,7.
아시네토박터는 표면에 생물막을 형성할 수 있으며, 이는 병원 표면을 포함한 환경 표면에서 생존 연장에 기여하고 항생제 치료에 대한 내성을 향상시키는 데 기여할 수 있음을 시사합니다 8,9. 또한 아시네토박터의 생물막 형성은 인간의 임상 결과와 밀접한 관련이 있을 수 있다8. 따라서 아시네토박터 균주의 생물막 형성성은 환경 생존 및 인간 감염을 예측하는 지표 중 하나가 될 수 있다 8,10.
표면 부착 생물막은 정량화하고 시각화하여 생물막 형성성을 평가할 수 있습니다. 표면 부착 생물막을 정량화하기 위해, 생물막은 일반적으로 크리스탈 바이올렛과 같은 생물막 염색 염료에 의해 염색되고, 염료는 용액에서 용출되고 광학 밀도11에 대해 측정된다. 생물막의 시각화는 생물막 형성성을 평가하는 또 다른 좋은 접근법이다11. 형광 염료를 사용하여 특이성을 사용하는 공초점 레이저 스캐닝 현미경(CLSM) 시각화 방법은 SEM12,13과 같은 다른 기술에 비해 생물막 형태를 특성화하는 데 더 유용할 수 있습니다.
생물막에서 생존 가능한 세포는 생물막에서 생존 가능한 세포의 수를 추정하기 위해 계수될 수있다 11. biofilms에서 끼워넣어진 생존 가능한 세포는 분리되고, 묽게 되고, 한천 격판덮개에 퍼지고, 배양되고, 열거됩니다. 세포의 수가 많을수록 전염성 투여량을 충족시킬 가능성이 높기 때문에 세포 수13,14와 관련된 감염 가능성과 같은 생물막에 대한 자세한 정보를 제공할 수 있습니다.
이 기사에서는 (1) 표면 부착 생물막을 정량화하고, (2) 생물막에서 생존 가능한 세포를 계산하고, (3) 아시네토박터의 CLSM을 사용하여 생물막을 시각화하는 단계별 프로토콜을 제시합니다. 제시된 프로토콜은 아시네토박터 분리물의 생물막 형성성을 평가하고 이들의 생물막을 특성화하는 방법을 설명합니다.
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Protocol
1. 세균 접종물의 제조
- -80°C에서 보관된 글리세롤 스톡 바이알을 제거합니다.
- 멸균 피펫 팁을 사용하여 바이알에서 박테리아 균주(2-10 μL)를 제거합니다.
참고: 이 프로토콜에는 아시네토박터 균주, A. bouvetii (13-1-1), A. junii (13-1-2), A. pittii (13-2-5), A. baumannii (13-2-9), A. radioresistens (20-1) 및 A. ursingii (24-1)가 사용됩니다. - 시판되는 혈액 한천 플레이트(5% 양의 혈액이 보충된 트립틱 대두 한천, 재료 표 참조)에 박테리아를 접종합니다.
알림: 영양 한천 또는 MacConkey 한천과 같은 다른 매체도 사용할 수 있습니다. - 간헐적으로 연소되는 멸균 루프를 사용하여 한천 표면을 줄무늬로 만들어 얇게 만듭니다.
- 한천 플레이트를 인큐베이터에 거꾸로 놓고 30°C에서 밤새 20-24시간 동안 배양합니다.
- 멸균 바늘로 박테리아 배양액의 단일 콜로니를 선택하고 5mL의 멸균 뇌 심장 주입액(BHI, 재료 표 참조)을 배양액과 함께 접종합니다.
- 접종한 육수를 30°C의 진탕 인큐베이터에서 약 150rpm으로 20-24시간 동안 밤새 배양합니다.
- 하룻밤 배양액 1mL를 멸균 마이크로 원심분리기 튜브로 옮기고 실온(RT)에서 10분 동안 6,000× g 의 야간 배양액을 원심분리합니다.
- 피펫으로 상층액을 제거합니다.
- 소용돌이를 사용하여 펠릿을 1mL 멸균 인산염 완충 식염수(PBS)에 재현탁시킵니다.
- 상온에서 10분 동안 6,000× g 으로 원심분리하고 상층액을 제거합니다.
- 소용돌이를 사용하여 멸균된 10배 희석된 BHI에 펠릿을 600nm에서 약 0.1의 광학 밀도로 재현탁시킵니다.
참고: 약 0.1의 광학 밀도는 약 107 CFU/mL에 해당합니다.
2. 크리스탈 바이올렛을 이용한 생물막 정량화
- 멸균 폴리스티렌 96웰 플레이트의 각 웰에 200μL 접종물을 추가하고( 재료 표 참조) 가장 바깥쪽 웰 각각에 200μL의 탈이온수를 추가하여 내부 웰이 건조되는 것을 방지합니다15.
- 200μL의 10배 희석된 BHI를 음성 대조군과 동일한 플레이트의 각 웰에 추가합니다.
- 플레이트를 25°C에서 24시간 동안 배양합니다.
- 피펫으로 상층액을 제거합니다.
참고: 멀티채널 피펫은 종종 여러 샘플에 더 편리합니다. - 각 웰에 300μL PBS를 조심스럽게 추가하고 피펫으로 상층액을 제거합니다.
참고: 멀티채널 피펫은 종종 여러 샘플에 더 편리합니다. - 2.5단계를 두 번 더 반복합니다.
- 200μL 크리스탈 바이올렛 용액(1%)( 재료 표 참조)을 각 웰에 추가하고 실온에서 30분 동안 배양합니다.
- 2.4-2.6단계를 반복합니다.
- 각 웰에 200μL의 절대 에탄올을 추가하고 RT에서 15분 동안 배양합니다. 위아래로 여러 번 피펫팅하여 완전히 혼합합니다.
- 각 웰에서 100μL 용출액을 새로운 96웰 플레이트로 옮깁니다.
- 마이크로플레이트 리더를 사용하여 595nm에서 흡광도를 측정합니다( 재료 표 참조).
- 흡광도가 2.0을 초과하는 경우 절대 에탄올에서 시료를 흡광도 2.0 이하로 적절하게 희석하고 2.11단계와 같이 측정한다. 그런 다음 관찰된 값에 희석 계수를 곱하여 샘플의 흡광도(최종 값)를 계산합니다.
- 동일한 웰 플레이트에 있는 테스트 샘플의 각 웰 값에서 음성 대조군의 평균값을 빼서 샘플의 실제 흡광도를 계산합니다.
3. 생물막 생존력 카운트
- 멸균 폴리스티렌 12웰 플레이트(15)의 각 웰에 1mL 접종물(1단계)을 추가합니다. 플레이트를 25°C에서 24시간 동안 배양합니다. 피펫으로 상층액을 제거합니다.
- 각 웰에 1.5mL 멸균 PBS를 조심스럽게 추가하고 피펫으로 상층액을 제거합니다. 각 웰에 1mL의 멸균 PBS를 추가합니다.
- 장착된 셀 스크레이퍼를 사용하여 우물의 바닥과 벽 표면을 긁어냅니다.
- 수확한 세포 현탁액을 9mL 식염수(0.85% NaCl)와 10-20개의 유리 비드가 들어 있는 멸균 플라스틱 튜브(10-1)로 옮깁니다( 재료 표 참조).
알림: 웰 바닥 표면에 남아 있는 잔류 생물막 파편을 수집하기 위해 10-1 튜브의 식염수를 사용하여 피펫으로 재현탁 및 이송할 수 있습니다. - 최대 속도로 10-1 튜브를 60초 동안 소용돌이칩니다.
- 9mL 식염수(0.85% NaCl)를 최대 10-7까지 포함하는 다음 멸균 튜브(10-2)에 1mL를 옮겨 10배 연속 희석합니다.
- 각 희석액에서 100 μL를 아시네토박터 한천( 재료 표 참조)에 펴 바르고 한천 플레이트를 30°C에서 24-42시간 동안 배양합니다.
- 각 플레이트의 일반적인 빨간색 콜로니 수를 10에서 250 사이의 범위에서 수동으로 계산합니다.
- 아래 방정식을 사용하여 각 웰의 생물막에서 생존 가능한 세포의 수를 계산하십시오.
생존 세포 = 콜로니 수 × 희석 계수 × 10
4. 컨포칼 레이저 스캐닝 현미경(CLSM)을 사용한 생물막 시각화
- 현미경 분석을 위한 멸균 96웰 플레이트의 각 웰에 200μL 접종물을 추가합니다.
- 플레이트를 25°C에서 24시간 동안 배양합니다.
- 피펫으로 상층액을 제거합니다.
- 300μL 필터 멸균 탈이온수를 각 웰에 조심스럽게 추가하고 피펫으로 상층액을 제거합니다.
- 4.4단계를 반복합니다.
- 필터 멸균된 탈이온수에 각각 10μM 및 60μM의 최종 농도로 희석한 SYTO 9와 프로피듐 요오드화물( 재료 표 참조)의 혼합물을 준비합니다.
- 혼합물을 200 μL의 각 웰에 추가하고 어두운 곳에서 RT에서 20-30 분 동안 플레이트를 배양합니다.
- 4.3-4.4단계를 반복합니다.
- 여기 파장이 각각 488nm 및 561nm이고 방출 파장 범위가 499-535nm 및 568-712nm인 CLSM을 사용하여 바닥 표면 부착 생물막을 시각화합니다.
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Representative Results
프로토콜에 따라, 원래 부엌 표면에서 분리된 아시네토박터 분리물의 생물막을 폴리스티렌 96웰 플레이트에 형성하고 크리스탈 바이올렛으로 염색하고, 염료를 에탄올에 용해시키고 생물막 질량을 측정했습니다(그림 1). biofilms의 수는 OD 0.04에서 1.69 (숫자 1)에 배열하는 긴장에 매우 따라서 변화했습니다. Stepanović et al.16에 의해 확립된 기준에 기초하여, A. bouvetii 를 제외한 모든 분리물은 생물막을 형성했습니다. A. 방사성 저항제 는 약한 생물막을 형성했습니다. A. junii 와 A. baumannii 는 강한 biofilms를 형성하는 그러나, A. pittii 와 A. ursingii 는 온건한 biofilms를 형성했습니다.
생물막에서 생존 가능한 세포를 계산하기 위해 세포 스크레이퍼를 사용하여 생물막을 긁어내고, 고속으로 소용돌이치고, 희석하고, 아시네토박터 선택적 플레이트에 퍼뜨렸습니다. 배양 후, 콜로니의 수를 계산하여 생물막 세포의 수를 추정했습니다(그림 2). A. bouvetii 를 제외한 모든 분리물은 생물막에 7-8 Log CFU에 해당하는 세포를 가지고 있었습니다. 크리스탈 바이올렛 분석에 의해 나타난 생물막 비형성 특성과 일치하게, A. bouvetii 는 4.4 Log CFU에서 훨씬 낮은 수준의 세포 수를 가졌습니다.
바닥 표면 부착 생물막은 CLSM을 사용하여 시각화되었습니다(그림 3). 상당한 양의 생물막이 A. junii, A. baumannii 및 A. ursingii 에서 뚜렷한 생물막 형태를 갖는 것으로 밝혀졌습니다. A. pittii 는 크리스탈 바이올렛 분석에서 강력한 생물막 형성제였지만 바닥 표면에 많은 생물막을 형성하지 않았습니다.
그림 1: 결정 보라색 분석을 사용하여 폴리스티렌 96웰 플레이트에 형성된 아시네토박터 의 생물막 질량 측정. 오차 막대는 삼중으로부터의 표준 편차를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 폴리스티렌 12웰 플레이트에 형성된 아시네토박터 생물막의 생존 가능한 개수. 오차 막대는 복제본과의 표준 편차를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: SYTO 9 및 프로피듐 요오드화물 염료를 사용하여 CLSM으로 시각화한 96웰 플레이트에 형성된 바닥 표면 부착 아시네토박터 생물막. 스케일 바: 50 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
기술된 프로토콜을 사용하여, 다양한 정도의 아시네토박터 분리물의 생물막 형성을 측정하고, 시각화하고, 생물막에서 생존 가능한 세포를 추정하였다(도 1, 도 2 및 도 3).
이 프로토콜에서는 성장을 위한 30°C와 아시네토박터의 생물막 형성을 위한 25°C의 두 가지 다른 온도를 사용했습니다. 많은 연구에서 아시네토박터의 최적 성장을 위해 30°C 이상을 사용했기 때문에 30°C를 사용하였는데, 이는 충분한 접종물12,13,14,17을 얻기에 적합할 것이다. 그러나 이 온도는 일반적으로 병원 표면이나 식품 가공 환경과 같이 생물막 형성이 발생하는 환경의 온도보다 높습니다. 따라서 생물막 형성에 25°C를 사용하여 이러한 환경 조건을 더 많이 시뮬레이션했습니다.
이 프로토콜은 생물막을 형성하기 위해 원래 BHI 대신 10배 희석된 BHI를 사용했습니다(1.12단계). 병원 표면이나 식품 가공 환경과 같은 많은 표면은 영양분이 부족할 가능성이 높습니다18,19. 또한, 오염된 표면의 미생물은 세척 후에도 표면에 잔류하여 영양분이 적은 조건(20)에서 잔류한다. 따라서 10배 희석된 BHI와 같은 저영양 조건이 원래 BHI와 같은 고영양 조건보다 더 바람직합니다.
크리스탈 바이올렛 분석은 생물막 질량을 측정하기 위해 일반적으로 인정되고 잘 확립된 방법이며, 이 연구는 이 방법을 사용하여 아시네토박터 의 생물막 형성성이 다양한 수준에서 식별될 수 있음을 보여주었습니다.
생물막의 생존 가능한 세포는 더 많은 수의 세포에 의해 발생할 가능성이 더 높은 인간 감염을 담당하기 때문에 생물막의 생존 가능한 수는 또한 중요하다21. 더하여, 생존 가능한 조사는 A. bouvetii와 A. radioresistens에서 설명되는 것과 같이, 빈약한 biofilm 생산자를 구별하는 좋은 공구일지도 모릅니다 (숫자 1와 숫자 2). A. 방사성 저항군의 생존 가능한 수는 A. bouvetii의 수보다 훨씬 높았지만, 생물막 질량에서는 거의 차이가 발견되지 않아 A. 방사성 저항군의 감염 가능성이 더 높다는 것을 시사합니다(그림 1 및 그림 2). 또한 이 방법은 환경에서 더 흔한 다종 생물막에서 아시네토박터의 비율을 추정하는 데 사용할 수 있습니다.
아시네토박터는 바닥면뿐만 아니라 측벽상에도, 특히 튜브(17,22)의 공기-액체 계면에 생물막을 형성한다. 마이크로타이터 플레이트를 사용한 CLSM 분석은 바닥 표면에 부착된 생물막으로 제한되기 때문에 벽 표면을 포함한 모든 수중 표면을 측정하는 결정 보라색 분석의 결과와 비교하기 어려운 경우가 있습니다. 공기-액체 계면에 상당한 양의 생물막이 또한 이들 고립물, 특히 강한 생물막 생산자인 A. pittii에서 발견되었다. 그것은 다른 고립물에 비해 바닥 표면에 상대적으로 열악한 생물막을 형성했습니다 (그림 3). 그러므로, 측벽에 형성된 생물막을 구상하기 위하여 현미경 분석 기술은 더 개발되어야 합니다.
이 학문에서는, 3개의 다른 분석실험, 수정같은 제비꽃, 생존할 수 있는 조사 및 CLSM는, 아시네토박터의 biofilms를 성격을 나타내기 위하여 이용되었습니다. 크리스탈 바이올렛 분석은 생물막을 정량화하는 잘 정립된 방법이며, 생물막 형성성을 결정하는 기준이 존재한다16. 그러나 살아있는 세포와 EPS뿐만 아니라 죽은 세포도 측정하므로 인간 감염 및 독성 측면에서 의미가 적습니다. 생물막에 있는 살아있는 세포는 생존할 수 있는 계수 방법에 의해 측정될 수 있습니다. 그러나, 생물막 형성성은 생물막 구조의 중요한 구성 요소인 EPS를 측정하지 않기 때문에 생존 가능한 계수 방법에 의해 결정될 수 없습니다. 따라서 이 방법은 생물막 형성성을 결정하기 위한 기준 또는 컷오프 값을 갖지 않습니다. 또한, 생존 가능한 계수 방법은 세포의 배양 가능성만 측정하고 '생존 가능하지만 배양 가능하지 않은 상태'11 상태의 세포는 측정하지 않습니다. 생물막의 존재는 생물막을 효과적으로 시각화하는 CLSM 방법으로 확인할 수 있습니다. 그러나, 그것은 biofilms가 측벽에서 수시로 또한 형성되는 그러나, 단지 밑바닥 표면 붙어 있던 biofilms만 측정합니다. 따라서 크리스탈 바이올렛 분석을 사용하여 생물막 형성성을 결정하는 것이 좋습니다. 그런 다음 생물막의 살아있는 세포와 배양 가능한 세포를 생존 가능한 계수 방법으로 정량화할 수 있으며 바닥 표면 부착 생물막은 CLSM 방법으로 확인하거나 특성화할 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 공개할 것이 없습니다.
Acknowledgments
본 연구는 과학기술정보통신부의 지원을 받아 한국식품연구원(KFRI)의 본과제(E0210702-03)의 지원을 받았다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96-well cell culture plate | SPL | 30096 | Polystyrene 96-well plate |
| BHI (Brain Heart Infusion) broth | Merck KGaA | 1.10493.0500 | |
| Blood Agar Base Plate | KisanBio | MB-B1005-P50 | Growth media for Acinetobacter |
| CHROMagar Acinetobacter | CHROMagar | AC092 | Selective plate for Acinetobacter |
| Crystal violet solution | Sigma-Aldrich | V5265 | |
| Filmtracer LIVE/DEAD biofilm viability kit | Invitrogen | L10316 | SYTO9 and propidium iodide |
| Microplate reader | Tecan | Infinite M200 PRO NanoQuant | Biofilm measurement |
| RBC Glass Plating Beads | RBC | RG001 | Glass beads |
| μ-Plate 96 Well Black | ibidi | 89621 | Microplate intended for CLSM |
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