Summary
このプロトコルは Acinetobacterのbiofilmsのinoculum、水紫色の染料、biofilmsの生存可能な計算および視覚化を使用してmicrotitterの版のbiofilmの定量化の準備を記述する。
Abstract
アシネトバクター は院内感染を引き起こし、そのバイオフィルム形成は病院環境などの乾燥した表面での生存に寄与する可能性があります。したがって、バイオフィルムの定量化と可視化は、 アシネトバクター 株が院内感染を引き起こす可能性を評価するための重要な方法です。マイクロプレートの表面に形成されるバイオフィルムは、体積と細胞数で定量化できます。バイオフィルムの量は、クリスタルバイオレットを使用した染色、洗浄、エタノールによる脱色、およびマイクロプレートリーダーを使用した可溶化色素の測定によって定量化できます。バイオフィルムに埋め込まれた細胞の数を定量化するために、バイオフィルムを細胞スクレーパーを使用してスクラップし、生理食塩水で回収し、ガラスビーズの存在下で激しく攪拌し、アシネトバクター寒天培地に広げます。次に、プレートを30°Cで24〜42時間インキュベートします。インキュベーション後、赤いコロニーを列挙して、バイオフィルム内の細胞数を推定します。この実行可能な計数法は、混合種バイオフィルム中の アシネトバクター 細胞を計数するのにも有用です。 アシネトバクター のバイオフィルムは、蛍光色素を用いて可視化することができます。顕微鏡分析用に設計された市販のマイクロプレートを使用して、バイオフィルムを形成します。次に、底面に付着したバイオフィルムをSYTO9およびヨウ化プロピジウム色素で染色し、洗浄した後、共焦点レーザー走査型顕微鏡で可視化します。
Introduction
アシネトバクターは院内感染を引き起こすことが知られており、特に医療施設でのヒト感染の報告が増えています1。病院、医療施設、食品関連環境で広く普及しています2,3,4。ベッドの手すり、ベッドサイドテーブル、人工呼吸器の表面、シンク4などの病院の表面を含む環境で長期間生存できます。このような環境表面への残留性は、アシネトバクター4の院内感染に寄与する重要な要因の1つである可能性があります。
バイオフィルムは微生物の生命形態であり、生きた微生物細胞と細胞由来の細胞外高分子物質(EPS)で構成される微生物マトリックスである5。微生物細胞はマトリックスに埋め込まれており、多くの場合、熱、塩分、乾燥、抗生物質、消毒剤、せん断力などの環境ストレスに対して高い耐性があります6,7。
アシネトバクターは表面にバイオフィルムを形成する可能性があり、病院の表面を含む環境表面での生存期間の延長や、抗生物質治療に対する耐性の強化に寄与する可能性があることを示唆しています8,9。さらに、アシネトバクターのバイオフィルム形成は、ヒトの臨床転帰と大きく関連している可能性があります8。したがって、アシネトバクター株のバイオフィルム形成性は、環境生存とヒト感染を予測する際の指標の1つである可能性があります8,10。
表面に付着したバイオフィルムを定量化して可視化し、バイオフィルムの形成性を評価することができます。表面付着したバイオフィルムを定量するために、バイオフィルムは通常、クリスタルバイオレットなどのバイオフィルム染色色素で染色され、色素は溶液中で溶出し、光学濃度について測定されます11。バイオフィルムの可視化は、バイオフィルムの形成性を評価するためのもう一つの良いアプローチである11。蛍光色素を用いた特異性を用いた共焦点レーザー走査型顕微鏡(CLSM)可視化法は、SEM12,13などの他の技術と比較して、バイオフィルムの形態を特徴付けるのに有用である可能性があります。
バイオフィルム中の生細胞をカウントして、バイオフィルム中の生細胞の数を推定することができる11。バイオフィルムに埋め込まれた生細胞を剥離し、希釈し、寒天プレート上に広げ、インキュベートし、列挙します。細胞数が多いほど感染線量を満たす可能性が高いため、細胞数に関連する感染電位など、バイオフィルムに関するより詳細な情報を提供することができる13,14。
本稿では、(1)表面付着バイオフィルムの定量化、(2)バイオフィルム中の生細胞のカウント、(3) アシネトバクターのCLSMを用いたバイオフィルムの可視化のプロトコールを段階的に紹介します。提示されたプロトコルは、 アシネトバクター 分離株のバイオフィルム形成性を評価し、それらのバイオフィルムを特徴付ける方法を説明しています。
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Protocol
1.細菌接種物の調製
- -80°Cで保存したグリセロールストックバイアルを取り出します。
- 滅菌ピペットチップを使用してバイアルから細菌株(2〜10 μL)を除去します。.
注:アシネトバクター株、A. bouvetii(13-1-1)、A. junii(13-1-2)、A. pittii(13-2-5)、A. baumannii(13-2-9)、A. radioresistens (20-1)、およびA. ursingii(24-1)は、このプロトコルで使用されます。 - 市販の血液寒天プレート(5%羊の血液を添加したトリプシン大豆寒天、 材料表参照)に細菌を接種します。
注:栄養寒天やマッコンキー寒天などの他の培地も使用できます。 - 断続的に燃え上がる滅菌ループを使用して寒天の表面を縞模様にして薄くします。
- 寒天プレートを逆さまにしてインキュベーターに入れ、30°Cで一晩20〜24時間インキュベートします。
- 滅菌針で細菌培養の単一コロニーを選別し、5 mLの滅菌脳心臓輸液ブロス(BHI、 材料表を参照)を培養液に接種します。
- 接種した培養液を30°Cの振とうインキュベーターで一晩、約150rpmで20〜24時間インキュベートします。
- 1 mLの一晩培養液を滅菌微量遠心チューブに移し、6,000 × g で室温(RT)で10分間、一晩培養液を遠心分離します。
- ピペットで上澄みを取り除きます。
- ボルテックスを使用して、ペレットを1 mLの滅菌リン酸緩衝生理食塩水(PBS)に再懸濁します。
- 室温で6,000 × g で10分間遠心分離し、上清を除去します。
- ペレットを滅菌した10倍希釈BHIに、600 nmで約0.1の光学濃度にボルテックスを使用して再懸濁します。
注:約0.1の光学濃度は、約107 CFU / mLに相当します。
2. クリスタルバイオレットを用いたバイオフィルムの定量
- 滅菌ポリスチレン96ウェルプレート( 材料表参照)の各ウェルに200μLの接種物を追加し、最も外側のウェルのそれぞれに200μLの脱イオン水を加えて、内側のウェルが乾燥するのを防ぎます15。
- 10倍希釈したBHIを200 μLをネガティブコントロールとして同じプレートの各ウェルに加えます。
- プレートを25°Cで24時間インキュベートします。
- ピペットで上澄みを取り除きます。
注:マルチチャンネルピペットは、多くの場合、複数のサンプルに便利です。 - 各ウェルに300 μLのPBSを慎重に添加し、ピペットで上清を除去します。
注:マルチチャンネルピペットは、多くの場合、複数のサンプルに便利です。 - 手順 2.5 をさらに 2 回繰り返します。
- 200 μLのクリスタルバイオレット溶液(1%)( 材料表を参照)を各ウェルに加え、室温で30分間インキュベートします。
- 手順2.4〜2.6を繰り返します。
- 各ウェルに200 μLの無水エタノールを加え、室温で15分間インキュベートします。
- 各ウェルから新しい 96 ウェルプレートに 100 μL の溶出液を移します。
- マイクロプレートリーダーを使用して595 nmでの吸光度を測定します( 材料表を参照)。
- 吸光度が2.0を超える場合は、無水エタノールで2.0未満の吸光度にサンプルを適切に希釈し、ステップ2.11と同様に測定します。そして、観察値に希釈係数を掛けて試料の吸光度(最終値)を算出します。
- 同じウェルプレート上の試験サンプルの各ウェルの値からネガティブコントロールの平均値を差し引いて、サンプルの真の吸光度を計算します。
3. バイオフィルム生存率カウント
- 滅菌ポリスチレン製12ウェルプレート15の各ウェルに1mLの接種物(ステップ1)を添加する。プレートを25°Cで24時間インキュベートします。ピペットで上澄みを取り除きます。
- 1.5 mLの滅菌PBSを各ウェルに慎重に添加し、ピペットで上清を除去します。各ウェルに滅菌PBSを1 mL添加します。
- 取り付けられたセルスクレーパーを使用して、ウェルの底面と壁面をこすり落とします。
- 回収した細胞懸濁液を、9 mLの生理食塩水(0.85% NaCl)と10〜20個のガラスビーズを含む滅菌プラスチックチューブ(10-1)に移します( 材料表を参照)。
注:ウェルの底面に残ったバイオフィルムの破片を回収するには、10-1 チューブから生理食塩水を使用してピペットで再懸濁し、移送することができます。 - 10-1チューブを最大速度で60秒間ボルテックスします。
- 10-7までの生理食塩水(0.85%NaCl)9 mLを含む次の滅菌チューブ(10-2)に1 mLを移して、10倍段階希釈します。
- 各希釈液から100 μLをアシネトバクター寒天培地に広げ( 材料表を参照)、寒天プレートを30°Cで24〜42時間インキュベートします。
- 各プレート上の典型的な赤いコロニーの数を10〜250の範囲で手動で数えます。
- 以下の式を使用して、各ウェルのバイオフィルム内の生細胞の数を計算します。
生細胞 = コロニー数 × 希釈係数 × 10
4. 共焦点レーザー走査型顕微鏡(CLSM)を用いたバイオフィルムの可視化
- 顕微鏡分析用の滅菌済み96ウェルプレートの各ウェルに200μLの接種物を加えます。
- プレートを25°Cで24時間インキュベートします。
- ピペットで上澄みを取り除きます。
- 300 μLのろ過滅菌脱イオン水を各ウェルに慎重に加え、ピペットで上清を取り除きます。
- 手順4.4を繰り返します。
- SYTO 9 とヨウ化プロピジウムの混合物( 材料表を参照)を、フィルター滅菌した脱イオン水でそれぞれ最終濃度 10 μM および 60 μM に希釈して調製します。
- 混合物を200 μLの各ウェルに加え、暗所の室温でプレートを20〜30分間インキュベートします。
- 手順4.3〜4.4を繰り返します
- 励起波長488 nmと561 nm、発光波長範囲がそれぞれ499-535 nmと568-712 nmのCLSMを使用して、底面に付着したバイオフィルムを可視化します。
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Representative Results
プロトコールに従って、厨房の表面から単離された アシネトバクター 分離株のバイオフィルムをポリスチレン製の96ウェルプレート上に形成し、クリスタルバイオレットで染色し、色素をエタノールに可溶化し、バイオフィルムの質量を測定しました(図1)。バイオフィルムの数は、OD0.04から1.69の範囲で株によって大きく異なります(図1)。Stepanovićらによって確立された基準に基づいて16、 A. bouvetii を除くすべての分離株がバイオフィルムを形成しました。 A.放射性レジステンは 弱いバイオフィルムを形成した。A. junii と A. baumannii は中程度のバイオフィルムを形成し、A. pittii と A. ursingii は強いバイオフィルムを形成した。
バイオフィルム中の生細胞を数えるために、バイオフィルムを細胞スクレーパーで削り取り、高速でボルテックスし、希釈し、 アシネトバクター 選択プレート上に広げました。インキュベーション後、コロニー数をカウントし、バイオフィルム細胞の数を推定しました(図2)。 A. bouvetii を除くすべての分離株は、バイオフィルムに7-8 Log CFUに相当する細胞を持っていました。クリスタルバイオレットアッセイで示されたバイオフィルムの非形成特性と一致して、 A. bouvetiiは4.4 Log CFUではるかに低いレベルの細胞数を示しました。
底面に付着したバイオフィルムをCLSMを用いて可視化しました(図3)。 A. junii、 A. baumannii、 A. ursingii では、バイオフィルムの形態が異なるバイオフィルムが大量に見つかりました。 A. pittii はクリスタルバイオレットアッセイでは強力なバイオフィルム形成者であったが、底面にはあまりバイオフィルムを形成しなかった。
図1:結晶バイオレットアッセイを用いたポリスチレン96ウェルプレート上に形成された アシネトバクター のバイオフィルム量の測定。 誤差範囲は、3 つの標準偏差を表します。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図2:ポリスチレン製の12ウェルプレート上に形成された アシネトバクター バイオフィルムの生存数。 エラーバーは、重複からの標準偏差を表します。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図3:SYTO 9とヨウ化プロピジウム色素を用いてCLSMで可視化した96ウェルプレート上に形成された底面に付着した アシネトバクター バイオフィルム。 スケールバー:50 μm。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
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Discussion
記載されたプロトコルを使用して、さまざまな程度の アシネトバクター 分離株のバイオフィルム形成を測定、視覚化し、バイオフィルム内の生細胞を推定しました(図1、図 2、 および図3)。
このプロトコルでは、アシネトバクターの増殖に30°C、バイオフィルム形成に25°Cの2つの異なる温度を使用しました。30°Cが用いられたのは、多くの研究がアシネトバクターの最適な増殖のために30°C以上を使用したためであり、これは十分な接種菌を得るのに適切であろう12,13,14,17。ただし、この温度は一般に、病院の表面や食品加工環境など、バイオフィルムの形成が発生する環境の温度よりも高くなります。したがって、バイオフィルムの形成には25°Cが使用され、これらの環境条件をよりシミュレートできます。
このプロトコルでは、元のBHIの代わりに10倍希釈BHIを使用してバイオフィルムを形成しました(ステップ1.12)。病院の表面や食品加工環境など、多くの表面は低栄養である可能性が高い18,19。さらに、汚染された表面の微生物は、洗浄後も表面に残り、低栄養状態20で残留する。したがって、10倍希釈BHIなどの低栄養条件は、元のBHIなどの高栄養条件よりも望ましい。
クリスタルバイオレットアッセイは、バイオフィルムの質量を測定するための一般的に受け入れられ、確立された方法であり、この研究は、この方法を使用することで 、アシネトバクター のバイオフィルム形成性がさまざまなレベルで識別できることを示しました。
バイオフィルム中の生細胞は、より多くの細胞数によって発生する可能性が高いヒト感染の原因となるため、バイオフィルム中の生菌数も重要である21。さらに、生存可能数は、A. bouvetii と A. radioresistens で実証されているように、貧弱なバイオフィルム生産者を区別するための優れたツールである可能性があります(図 1 および 図 2)。A. radioresistensの生存可能数はA. bouvetiiのものよりはるかに多かったが、バイオフィルムの質量にはほとんど差が見られず、A. radioresistensによる感染の可能性が高いことが示唆された(図1および図2)。また、この方法は、環境中でより一般的な多種バイオフィルム中のアシネトバクターの割合を推定するために使用できます。
アシネトバクターは、底面だけでなく側壁、特にチューブ17,22内の気液界面にもバイオフィルムを形成する。マイクロタイタープレートを用いたCLSM分析は、底面に付着したバイオフィルムに限定されるため、壁面を含むすべての水没面を測定するクリスタルバイオレットアッセイの結果と比較することが困難な場合があります。気液界面にかなりの量のバイオフィルムが、これらの分離株、特に強力なバイオフィルム生産者であるA.pittiiにも見られました。他の分離株と比較して、底面に比較的貧弱なバイオフィルムを形成しました(図3)。そのため、側壁に形成されたバイオフィルムを可視化するための顕微鏡分析技術をさらに発展させる必要があります。
この研究では、ア シネトバクターのバイオフィルムを特徴付けるために、クリスタルバイオレット、生存数、およびCLSMの3つの異なるアッセイが使用されました。クリスタルバイオレットアッセイは、バイオフィルムを定量化するための確立された方法であり、バイオフィルムの形成性を決定するための基準が存在します16。しかし、生細胞やEPSだけでなく、ヒトへの感染や病原性の観点からはあまり意味のない死細胞も測定します。バイオフィルム中の生細胞は、生菌カウント法で測定できます。しかし、バイオフィルムの形成性は、バイオフィルム構造の重要な成分であるEPSを測定しないため、バイブルカウント法では判断できません。したがって、この方法には、バイオフィルム形成性を決定するための基準またはカットオフ値がありません。また、生存カウント法は細胞の培養可能性のみを測定し、「生存可能だが培養できない状態」の細胞は測定しない11。バイオフィルムの存在は、バイオフィルムを効果的に可視化するCLSM法で確認することができます。ただし、底面に付着したバイオフィルムのみを測定しますが、側壁にもバイオフィルムが形成されることがよくあります。したがって、バイオフィルムの形成性を決定するためにクリスタルバイオレットアッセイを使用することをお勧めします。そして、バイオフィルム中の生細胞および培養細胞を生計数法で定量し、底面付着バイオフィルムをCLSM法で確認または特徴付けることができる。
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Disclosures
著者は何も開示していません。
Acknowledgments
本研究は、韓国食品技術研究院(KFRI)の科学技術情報通信部(E0210702-03)主研究プログラムの支援を受けて行われました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96-well cell culture plate | SPL | 30096 | Polystyrene 96-well plate |
| BHI (Brain Heart Infusion) broth | Merck KGaA | 1.10493.0500 | |
| Blood Agar Base Plate | KisanBio | MB-B1005-P50 | Growth media for Acinetobacter |
| CHROMagar Acinetobacter | CHROMagar | AC092 | Selective plate for Acinetobacter |
| Crystal violet solution | Sigma-Aldrich | V5265 | |
| Filmtracer LIVE/DEAD biofilm viability kit | Invitrogen | L10316 | SYTO9 and propidium iodide |
| Microplate reader | Tecan | Infinite M200 PRO NanoQuant | Biofilm measurement |
| RBC Glass Plating Beads | RBC | RG001 | Glass beads |
| μ-Plate 96 Well Black | ibidi | 89621 | Microplate intended for CLSM |
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