Summary
यह प्रोटोकॉल इनोकुलम की तैयारी, क्रिस्टल वायलेट डाई का उपयोग करके माइक्रोटिटर प्लेटों पर बायोफिल्म परिमाणीकरण, बायोफिल्म में व्यवहार्य गणना और एसिनेटोबैक्टर के बायोफिल्म के विज़ुअलाइज़ेशन का वर्णन करता है।
Abstract
एसिनेटोबैक्टर नोसोकोमियल संक्रमण का कारण बनता है और इसका बायोफिल्म गठन अस्पताल के वातावरण जैसी शुष्क सतहों पर जीवित रहने में योगदान कर सकता है। इस प्रकार, बायोफिल्म परिमाणीकरण और विज़ुअलाइज़ेशन नोसोकोमियल संक्रमण पैदा करने के लिए एसिनेटोबैक्टर उपभेदों की क्षमता का आकलन करने के लिए महत्वपूर्ण तरीके हैं। माइक्रोप्लेट की सतह पर बनने वाले बायोफिल्म को मात्रा और सेल संख्या के संदर्भ में निर्धारित किया जा सकता है। बायोफिल्म वॉल्यूम को क्रिस्टल वायलेट का उपयोग करके धुंधला करके, धोने, इथेनॉल का उपयोग करके डिस्टेन करने के द्वारा निर्धारित किया जा सकता है, फिर माइक्रोप्लेट रीडर का उपयोग करके घुलनशील डाई को मापा जा सकता है। बायोफिल्म में एम्बेडेड कोशिकाओं की संख्या निर्धारित करने के लिए, बायोफिल्म को सेल स्क्रैपर्स का उपयोग करके खत्म कर दिया जाता है, खारा में काटा जाता है, कांच के मोतियों की उपस्थिति में सख्ती से उत्तेजित किया जाता है, और एसिनेटोबैक्टर एगर पर फैलाया जाता है। फिर, प्लेटों को 24-42 घंटे के लिए 30 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट किया जाता है। इनक्यूबेशन बाद, बायोफिल्म में कोशिकाओं की संख्या का अनुमान लगाने के लिए लाल कॉलोनियों की गणना की जाती है। यह व्यवहार्य गणना विधि मिश्रित प्रजातियों के बायोफिल्म में एसिनेटोबैक्टर कोशिकाओं की गिनती के लिए भी उपयोगी हो सकती है। फ्लोरोसेंट रंगों का उपयोग करके एसिनेटोबैक्टर बायोफिल्म की कल्पना की जा सकती है। सूक्ष्म विश्लेषण के लिए डिज़ाइन किया गया एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध माइक्रोप्लेट बायोफिल्म बनाने के लिए नियोजित किया जाता है। फिर, नीचे की सतह से जुड़े बायोफिल्म को SYTO9 और प्रोपिडियम आयोडाइड रंगों से रंगा जाता है, धोया जाता है, फिर कॉन्फोकल लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोपी के साथ कल्पना की जाती है।
Introduction
एसिनेटोबैक्टर को नोसोकोमियल संक्रमण का कारण माना जाता है, और इसका मानव संक्रमण, विशेष रूप से स्वास्थ्य सुविधाओं में, तेजीसे रिपोर्ट किया जाता है। यह अस्पतालों, स्वास्थ्य सुविधाओं और भोजन से जुड़े वातावरण 2,3,4 में व्यापक है। यह अस्पताल की सतहों जैसे बिस्तर रेल, बेडसाइड टेबल, वेंटिलेटर की सतह और सिंकसहित वातावरण में लंबे समय तक जीवित रह सकता है। पर्यावरणीय सतहों पर इस तरह की दृढ़ता एसिनेटोबैक्टर4 के नोसोकोमियल संक्रमण में योगदान देने वाले महत्वपूर्ण कारकों में से एक हो सकती है।
बायोफिल्म माइक्रोबियल जीवन का एक रूप है और एक माइक्रोबियल मैट्रिक्स है जो जीवित माइक्रोबियल कोशिकाओंऔर कोशिकाओं से बाह्य बहुलक पदार्थों (ईपीएस) से बना है। माइक्रोबियल कोशिकाएं मैट्रिक्स में एम्बेडेड होती हैं और अक्सर पर्यावरणीय तनाव जैसे गर्मी, लवण, सूखापन, एंटीबायोटिक्स, कीटाणुनाशक और कतरनी बलों 6,7 के लिए अत्यधिक प्रतिरोधी होती हैं।
एसिनेटोबैक्टर सतहों पर बायोफिल्म बना सकता है, यह सुझाव देता है कि यह अस्पताल की सतहों सहित पर्यावरणीय सतहों पर विस्तारित अस्तित्व में योगदान दे सकता है, और एंटीबायोटिक उपचार के लिए प्रतिरोध 8,9 को बढ़ा सकता है। इसके अलावा, एसिनेटोबैक्टर का बायोफिल्म गठन मानव नैदानिक परिणामों के साथ अत्यधिक जुड़ा हो सकताहै। इसलिए, एसिनेटोबैक्टर उपभेदों की बायोफिल्म फॉर्मेबिलिटी पर्यावरणीय अस्तित्व और मानव संक्रमण 8,10 की भविष्यवाणी करने में संकेतकों में से एक हो सकती है।
सतह से जुड़े बायोफिल्म को बायोफिल्म फॉर्मेबिलिटी का आकलन करने के लिए परिमाणित और कल्पना की जा सकती है। सतह से जुड़े बायोफिल्म की मात्रा निर्धारित करने के लिए, बायोफिल्म को आमतौर पर क्रिस्टल वायलेट जैसे बायोफिल्म-धुंधला रंगों से दाग दिया जाता है, और रंगों को घोल में संश्लेषित किया जाता है और ऑप्टिकल घनत्व11 के लिए मापा जाता है। बायोफिल्मफॉर्मेबिलिटी का आकलन करने के लिए बायोफिल्म का विज़ुअलाइज़ेशन एक और अच्छा तरीका है। कॉन्फोकल लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोपी (सीएलएसएम) विज़ुअलाइज़ेशन विधि फ्लोरोसेंट रंगों का उपयोग करके विशिष्टता को नियोजित करती है, एसईएम12,13 जैसी अन्य तकनीकों की तुलना में बायोफिल्म आकृति विज्ञान को चिह्नित करने के लिए अधिक उपयोगी हो सकती है।
बायोफिल्म में व्यवहार्य कोशिकाओं को बायोफिल्म11 में व्यवहार्य कोशिकाओं की संख्या का अनुमान लगाने के लिए गिना जा सकता है। बायोफिल्म में एम्बेडेड व्यवहार्य कोशिकाओं को अलग किया जाता है, पतला किया जाता है, अगर प्लेटों पर फैलाया जाता है, इनक्यूबेट किया जाता है, और गणना की जाती है। क्योंकि कोशिकाओं की अधिक संख्या संक्रामक खुराक को पूरा करने की संभावना है, यह बायोफिल्म पर अधिक विस्तृत जानकारी प्रदान कर सकता है, जैसे कि कोशिकाओं की संख्या13,14 से जुड़े संक्रमण क्षमता।
यह लेख चरण-दर-चरण प्रोटोकॉल प्रस्तुत करता है (1) सतह से जुड़े बायोफिल्म की मात्रा निर्धारित करना, (2) बायोफिल्म में व्यवहार्य कोशिकाओं की गणना करना, और (3) एसिनेटोबैक्टर के सीएलएसएम का उपयोग करके बायोफिल्म की कल्पना करना। प्रस्तुत प्रोटोकॉल एसिनेटोबैक्टर आइसोलेट्स की बायोफिल्म फॉर्मेबिलिटी का आकलन करने और उनके बायोफिल्म को चिह्नित करने के तरीकों का वर्णन करते हैं।
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Protocol
1. बैक्टीरियल इनोकुलम की तैयारी
- -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत ग्लिसरॉल स्टॉक शीशी को हटा दें।
- एक बाँझ पिपेट टिप का उपयोग करके शीशी से बैक्टीरियल तनाव (2-10 μL) को हटा दें।
नोट: इस प्रोटोकॉल में एसिनेटोबैक्टर उपभेदों, ए. बौवेटी (13-1-1), ए. जुनी (13-1-2), ए. पिट्टी (13-2-5), ए. बाउमैनी (13-2-9), ए. रेडियोरेसिस्टेंस (20-1), और ए. उर्सिंगी (24-1) का उपयोग किया जाता है। - बैक्टीरिया के साथ व्यावसायिक रूप से उपलब्ध रक्त आगर प्लेट (ट्राइप्टिक सोया एगर 5% भेड़ के रक्त के साथ पूरक, सामग्री की तालिका देखें) को टीका लगाएं।
नोट: अन्य मीडिया, जैसे पोषक तत्व अगर या मैककॉन्की एगर का भी उपयोग किया जा सकता है। - आंतरायिक ज्वलंत के साथ बाँझ लूप का उपयोग करके एगर की सतह को पतला करें।
- एक इनक्यूबेटर में एगर प्लेट को उल्टा रखें और 20-24 घंटे के लिए रात भर 30 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
- जीवाणु संस्कृति की एक एकल कॉलोनी को बाँझ सुई के साथ चुनें और संस्कृति के साथ 5 एमएल बाँझ मस्तिष्क हृदय जलसेक शोरबा (बीएचआई, सामग्री की तालिका देखें) को टीका लगाएं।
- टीका कृत शोरबा को 30 डिग्री सेल्सियस पर रात भर 20-24 घंटे के लिए लगभग 150 आरपीएम पर एक हिलते हुए इनक्यूबेटर में इनक्यूबेट करें।
- रात भर की संस्कृति के 1 एमएल को एक बाँझ माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें और कमरे के तापमान (आरटी) पर 10 मिनट के लिए 6,000 × ग्राम पर रात भर की संस्कृति को सेंट्रीफ्यूज करें।
- एक पिपेट के साथ सतह पर तैरनेवाला को हटा दें।
- एक भंवर का उपयोग करके, 1 एमएल बाँझ फॉस्फेट-बफर्ड खारा (पीबीएस) में गोली को फिर से निलंबित करें।
- आरटी पर 10 मिनट के लिए 6,000 × ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज करें और सतह पर तैरने वाले को हटा दें।
- 600 एनएम पर लगभग 0.1 के ऑप्टिकल घनत्व के लिए भंवर का उपयोग करके बाँझ दस गुना पतला बीएचआई में गोली को फिर से निलंबित करें।
नोट: लगभग 0.1 का ऑप्टिकल घनत्व लगभग 107 सीएफयू / एमएल के बराबर है।
2. क्रिस्टल वायलेट का उपयोग करबायोफिल्म परिमाणीकरण
- एक बाँझ पॉलीस्टाइनिन 96-वेल प्लेट के प्रत्येक कुएं में 200 μL इनोकुलम जोड़ें (सामग्री की तालिका देखें) और आंतरिक कुओं को सूखने से रोकने के लिए प्रत्येक बाहरी कुएं में 200 μL विआयनीकृत पानीजोड़ें।
- नकारात्मक नियंत्रण के रूप में एक ही प्लेट के प्रत्येक कुएं में 200 μL दस गुना पतला बीएचआई जोड़ें।
- प्लेट को 24 घंटे के लिए 25 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
- एक पिपेट के साथ सतह पर तैरनेवाला को हटा दें।
नोट: मल्टीचैनल पिपेट अक्सर कई नमूनों के लिए अधिक सुविधाजनक होता है। - ध्यान से प्रत्येक कुएं में 300 μL PBS जोड़ें और एक पिपेट के साथ सतह पर तैरनेवाला को हटा दें।
नोट: मल्टीचैनल पिपेट अक्सर कई नमूनों के लिए अधिक सुविधाजनक होता है। - चरण 2.5 को दो बार दोहराएं।
- प्रत्येक कुएं में 200 μL क्रिस्टल वायलेट समाधान (1%) ( सामग्री की तालिका देखें) जोड़ें और 30 मिनट के लिए RT पर इनक्यूबेट करें।
- चरण 2.4-2.6 दोहराएँ।
- प्रत्येक कुएं में 200 μL पूर्ण इथेनॉल जोड़ें और आरटी पर 15 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
- प्रत्येक कुएं से 100 μL क्षालन को एक नई 96-वेल प्लेट में स्थानांतरित करें।
- माइक्रोप्लेट रीडर का उपयोग करके 595 एनएम पर अवशोषण को मापें ( सामग्री की तालिका देखें)।
- जब अवशोषण 2.0 से अधिक हो जाता है, तो पूर्ण इथेनॉल में 2.0 से नीचे अवशोषण के लिए नमूने का उचित कमजोर पड़ने का प्रयास करें और इसे चरण 2.11 में मापें। फिर, कमजोर पड़ने वाले कारक द्वारा देखे गए मूल्य को गुणा करके नमूना (अंतिम मूल्य) के अवशोषण की गणना करें।
- एक ही कुएं की प्लेट पर परीक्षण नमूनों के प्रत्येक कुएं के मूल्य से नकारात्मक नियंत्रण के औसत मूल्य को घटाकर नमूनों के वास्तविक अवशोषण की गणना करें।
3. बायोफिल्म व्यवहार्यता गणना
- एक बाँझ पॉलीस्टाइनिन 12-वेल प्लेट15 के प्रत्येक कुएं में 1 एमएल इनोकुलम (चरण 1) जोड़ें। प्लेट को 24 घंटे के लिए 25 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। एक पिपेट के साथ सतह पर तैरनेवाला को हटा दें।
- ध्यान से प्रत्येक कुएं में 1.5 एमएल बाँझ पीबीएस जोड़ें और एक पिपेट के साथ सतह पर तैरनेवाला को हटा दें। प्रत्येक कुएं में 1 एमएल बाँझ पीबीएस जोड़ें।
- फिट किए गए सेल स्क्रैपर्स का उपयोग करके कुएं के तल और दीवार की सतहों को खुरचलें।
- काटे गए सेल सस्पेंशन को एक बाँझ प्लास्टिक ट्यूब (10-1) में स्थानांतरित करें जिसमें 9 एमएल खारा (0.85% एनएसीएल) और 10-20 ग्लास बीड्स ( सामग्री की तालिका देखें)।
नोट: कुएं की निचली सतह पर छोड़े गए किसी भी अवशिष्ट बायोफिल्म मलबे को इकट्ठा करने के लिए, इसे 10-1 ट्यूब से खारा का उपयोग करके पिपेट द्वारा पुन: निलंबित और स्थानांतरित किया जा सकता है। - भंवर 10-1 ट्यूब को अधिकतम गति से 60 सेकंड के लिए।
- 10-7 तक 9 एमएल खारा (0.85% एनएसीएल) युक्त अगली बाँझ ट्यूब (10-2) में 1 एमएल स्थानांतरित करके 10 गुना सीरियल कमजोर पड़ने का प्रयास करें।
- एसिनेटोबैक्टर एगर ( सामग्री की तालिका देखें) पर प्रत्येक तनुकरण से 100 μL फैलाएं और 24-42 घंटे के लिए 30 डिग्री सेल्सियस पर आगर प्लेटों को इनक्यूबेट करें।
- प्रत्येक प्लेट पर विशिष्ट लाल कॉलोनियों की संख्या को मैन्युअल रूप से 10 और 250 के बीच की सीमा में गिनें।
- नीचे दिए गए समीकरण का उपयोग करके प्रत्येक कुएं के बायोफिल्म में व्यवहार्य कोशिकाओं की संख्या की गणना करें:
व्यवहार्य कोशिकाएं = कमजोर पड़ने वाले कारकों × उपनिवेशों की संख्या × 10
4. कॉन्फोकल लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोपी (सीएलएसएम) का उपयोग करबायोफिल्म विज़ुअलाइज़ेशन।
- सूक्ष्म विश्लेषण के लिए एक बाँझ 96-वेल प्लेट के प्रत्येक कुएं में 200 μL इनोकुलम जोड़ें।
- प्लेट को 24 घंटे के लिए 25 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
- एक पिपेट के साथ सतह पर तैरनेवाला को हटा दें।
- ध्यान से प्रत्येक कुएं में 300 μL फ़िल्टर-निष्फल विआयनीकृत पानी जोड़ें और एक पिपेट के साथ सतह पर तैरनेवाला को हटा दें।
- चरण 4.4 दोहराएँ।
- SYTO 9 और प्रोपिडियम आयोडाइड ( सामग्री की तालिका देखें) का मिश्रण क्रमशः 10 μM और 60 μM की अंतिम सांद्रता के लिए फिल्टर-स्टरलाइज्ड विआयनीकृत पानी में पतला तैयार करें।
- मिश्रण को 200 μL पर प्रत्येक कुएं में जोड़ें और अंधेरे में आरटी पर 20-30 मिनट के लिए प्लेट को इनक्यूबेट करें।
- चरण 4.3-4.4 दोहराएँ
- सीएलएसएम का उपयोग करके नीचे की सतह से जुड़े बायोफिल्म को क्रमशः 488 एनएम और 561 एनएम की उत्तेजना तरंग दैर्ध्य और 499-535 एनएम और 568-712 एनएम की उत्सर्जन तरंग दैर्ध्य सीमा के साथ कल्पना करें।
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Representative Results
प्रोटोकॉल का पालन करते हुए, मूल रूप से रसोई की सतहों से अलग किए गए एसिनेटोबैक्टर आइसोलेट्स के बायोफिल्म का गठन एक पॉलीस्टाइनिन 96-वेल प्लेट पर किया गया था, जो क्रिस्टल वायलेट से सना हुआ था, और रंगों को इथेनॉल में घुलनशील किया गया था और बायोफिल्म द्रव्यमान के लिए मापा गया था (चित्रा 1)। ओडी 0.04 से 1.69 तक के उपभेदों के आधार पर बायोफिल्म की संख्या बहुत भिन्न होती है (चित्रा 1)। स्टेपानोविक एट अल.16 द्वारा स्थापित मानदंडों के आधार पर, ए बोवेटी को छोड़कर सभी आइसोलेट्स ने बायोफिल्म का गठन किया। रेडियोरेसिस्टेंस ने एक कमजोर बायोफिल्म का गठन किया। ए जूनी और ए बाउमनी ने मध्यम बायोफिल्म का गठन किया, जबकि ए पिट्टी और ए उर्सिंगी ने मजबूत बायोफिल्म का गठन किया।
बायोफिल्म में व्यवहार्य कोशिकाओं की गणना करने के लिए, बायोफिल्म को सेल स्क्रैपर्स का उपयोग करके स्क्रैप किया गया था, उच्च गति से भंवर, पतला किया गया था, और एसिनेटोबैक्टर चयनात्मक प्लेटों पर फैलाया गया था। इनक्यूबेशन बाद, बायोफिल्म कोशिकाओं की संख्या का अनुमान लगाने के लिए कॉलोनियों की संख्या की गणना की गई (चित्रा 2)। बोवेटी को छोड़कर सभी आइसोलेट्स में उनके बायोफिल्म में 7-8 लॉग सीएफयू के बराबर कोशिकाएं थीं। क्रिस्टल वायलेट परख द्वारा दिखाए गए बायोफिल्म गैर-बनाने वाले गुण के अनुरूप, ए बोवेटी में 4.4 लॉग सीएफयू पर सेल संख्या का बहुत कम स्तर था।
नीचे की सतह से जुड़े बायोफिल्म को सीएलएसएम (चित्रा 3) का उपयोग करके कल्पना की गई थी। ए. जूनी, ए. बाउमनी और ए. उर्सिंगी में अलग-अलग बायोफिल्म आकृति विज्ञान के साथ पर्याप्त मात्रा में बायोफिल्म पाए गए। जबकि ए पिट्टी क्रिस्टल वायलेट परख में एक मजबूत बायोफिल्म पूर्व था, यह नीचे की सतह पर ज्यादा बायोफिल्म नहीं बनाता था।
चित्रा 1: क्रिस्टल वायलेट परख का उपयोग करके पॉलीस्टाइनिन 96-वेल प्लेट पर गठित एसिनेटोबैक्टर के बायोफिल्म द्रव्यमान का माप। त्रुटि पट्टियाँ तीन प्रतियों से मानक विचलन का प्रतिनिधित्व करती हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 2: पॉलीस्टाइनिन 12-वेल प्लेट पर गठित एसिनेटोबैक्टर बायोफिल्म की व्यवहार्य गणना। त्रुटि पट्टियाँ डुप्लिकेट से मानक विचलन का प्रतिनिधित्व करती हैं. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्र 3: नीचे की सतह से जुड़े एसिनेटोबैक्टर बायोफिल्म का गठन सीएलएसएम द्वारा एसवाईटीओ 9 और प्रोपिडियम आयोडाइड रंगों का उपयोग करके कल्पना की गई 96-वेल प्लेट पर किया गया है। स्केल सलाखों: 50 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
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Discussion
वर्णित प्रोटोकॉल का उपयोग करते हुए, अलग-अलग डिग्री के साथ एसिनेटोबैक्टर आइसोलेट्स के बायोफिल्म गठन को मापा गया, कल्पना की गई, और बायोफिल्म में व्यवहार्य कोशिकाओं का अनुमान लगाया गया (चित्रा 1, चित्रा 2, और चित्रा 3)।
इस प्रोटोकॉल में, दो अलग-अलग तापमानों का उपयोग किया गया था, विकास के लिए 30 डिग्री सेल्सियस और एसिनेटोबैक्टर के बायोफिल्म गठन के लिए 25 डिग्री सेल्सियस। 30 डिग्री सेल्सियस का उपयोग किया गया था क्योंकि कई अध्ययनों ने एसिनेटोबैक्टर के इष्टतम विकास के लिए 30 डिग्री सेल्सियस से अधिक का उपयोग किया था, जो पर्याप्त इनोकुलम12,13,14,17 प्राप्त करने के लिए उपयुक्त होगा। हालांकि, यह तापमान आम तौर पर पर्यावरण के तापमान से अधिक होता है जहां बायोफिल्म का गठन होता है, जैसे कि अस्पताल की सतह या खाद्य प्रसंस्करण वातावरण। इसलिए, बायोफिल्म निर्माण के लिए 25 डिग्री सेल्सियस का उपयोग किया गया था, जो इन पर्यावरणीय परिस्थितियों को अधिक अनुकरण करेगा।
इस प्रोटोकॉल ने बायोफिल्म बनाने के लिए मूल बीएचआई के बजाय 10 गुना पतला बीएचआई का उपयोग किया (चरण 1.12)। कई सतहों, जैसे कि अस्पताल की सतहों या खाद्य प्रसंस्करण वातावरण, कम पोषक तत्व18,19 होने की संभावना है। इसके अलावा, दूषित सतहों पर सूक्ष्मजीव सफाई के बाद सतहों पर बने रहते हैं और कम पोषक तत्वोंकी स्थिति में बने रहते हैं। इसलिए, कम पोषक तत्व ों की स्थिति जैसे कि 10-गुना पतला बीएचआई मूल बीएचआई जैसे उच्च-पोषक तत्वों की स्थिति की तुलना में अधिक वांछनीय है।
क्रिस्टल वायलेट परख बायोफिल्म द्रव्यमान को मापने के लिए एक आम तौर पर स्वीकृत और अच्छी तरह से स्थापित विधि है, और इस अध्ययन से पता चला है कि इस विधि का उपयोग करके अलग-अलग स्तरों पर एसिनेटोबैक्टर की बायोफिल्म फॉर्मेबिलिटी स्पष्ट है।
बायोफिल्म में व्यवहार्य गिनती भी महत्वपूर्ण है क्योंकि बायोफिल्म में व्यवहार्य कोशिकाएं मानव संक्रमण के लिए जिम्मेदार होती हैं जो कोशिकाओं की अधिक संख्या से होने की अधिक संभावना होतीहैं। इसके अलावा, व्यवहार्य गिनती खराब बायोफिल्म उत्पादकों को अलग करने के लिए एक अच्छा उपकरण हो सकता है, जैसा कि ए बोवेटी और ए रेडियोरेसिस्टेंस (चित्रा 1 और चित्रा 2) में दिखाया गया है। रेडियोरेसिस्टेंस की व्यवहार्य गणना ए . बोवेटी की तुलना में बहुत अधिक थी, जबकि बायोफिल्म द्रव्यमान में थोड़ा अंतर पाया गया था, जो ए रेडियोरेसिस्टेंस द्वारा संक्रमण की उच्च क्षमता का सुझाव देता है (चित्रा 1 और चित्रा 2)। इसके अलावा, इस विधि का उपयोग बहु-प्रजाति बायोफिल्म में एसिनेटोबैक्टर के अनुपात का अनुमान लगाने के लिए किया जा सकता है, जो पर्यावरण में अधिक आम है।
एसिनेटोबैक्टर न केवल नीचे की सतह पर बल्कि साइडवॉल पर भी बायोफिल्म बनाता है, खासकर ट्यूब17,22 में वायु-तरल इंटरफ़ेस पर। माइक्रोटिटर प्लेट का उपयोग करके सीएलएसएम विश्लेषण नीचे-सतह से जुड़े बायोफिल्म तक सीमित है, जिससे कभी-कभी क्रिस्टल वायलेट परख द्वारा परिणामों की तुलना करना मुश्किल हो जाता है, जो दीवार की सतहों सहित सभी जलमग्न सतहों को मापता है। इन आइसोलेट्स में एयर-लिक्विड इंटरफेस पर बायोफिल्म की पर्याप्त मात्रा भी पाई गई, विशेष रूप से मजबूत बायोफिल्म निर्माता, ए पिट्टी। इसने अन्य आइसोलेट्स की तुलना में नीचे की सतह पर अपेक्षाकृत खराब बायोफिल्म का गठन किया (चित्रा 3)। इसलिए, साइडवॉल पर गठित बायोफिल्म की कल्पना करने के लिए एक सूक्ष्म विश्लेषण तकनीक को और विकसित किया जाना चाहिए।
इस अध्ययन में, तीन अलग-अलग परख, क्रिस्टल वायलेट, व्यवहार्य गिनती और सीएलएसएम, का उपयोग एसिनेटोबैक्टर के बायोफिल्म को चिह्नित करने के लिए किया गया था। क्रिस्टल वायलेट परख बायोफिल्म को निर्धारित करने के लिए अच्छी तरह से स्थापित विधि है, और बायोफिल्म फॉर्मेबिलिटी निर्धारित करने के मानदंडमौजूद हैं। हालांकि, यह न केवल जीवित कोशिकाओं और ईपीएस को मापता है, बल्कि मृत कोशिकाओं को भी मापता है, जो मानव संक्रमण और विषाणु के संदर्भ में कम सार्थक हैं। बायोफिल्म में जीवित कोशिकाओं को व्यवहार्य गणना विधि द्वारा मापा जा सकता है। हालांकि, बायोफिल्म फॉर्मेबिलिटी को व्यवहार्य गणना विधि द्वारा निर्धारित नहीं किया जा सकता है क्योंकि यह विधि ईपीएस को नहीं मापती है, जो बायोफिल्म संरचना में एक महत्वपूर्ण घटक है। इसलिए, इस विधि में बायोफिल्म फॉर्मेबिलिटी निर्धारित करने के लिए मानदंड या कट-ऑफ मान नहीं है। इसके अलावा, व्यवहार्य गणना विधि केवल कोशिकाओं की संवर्धनीयता को मापती है और कोशिकाओं को 'व्यवहार्य लेकिन संवर्धन योग्य स्थिति नहीं' के तहत मापती नहीं है। बायोफिल्म की उपस्थिति की पुष्टि सीएलएसएम विधि द्वारा की जा सकती है, जो प्रभावी रूप से बायोफिल्म की कल्पना करती है। हालांकि, यह केवल नीचे की सतह से जुड़े बायोफिल्म को मापता है, हालांकि बायोफिल्म अक्सर साइडवॉल पर भी बनते हैं। इसलिए, बायोफिल्म फॉर्मेबिलिटी निर्धारित करने के लिए क्रिस्टल वायलेट परख का उपयोग करने की सिफारिश की जाती है। फिर, बायोफिल्म में जीवित और संवर्धन योग्य कोशिकाओं को व्यवहार्य गणना विधि द्वारा निर्धारित किया जा सकता है, और नीचे की सतह से जुड़े बायोफिल्म की पुष्टि या सीएलएसएम विधि द्वारा विशेषता की जा सकती है।
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Disclosures
लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।
Acknowledgments
यह शोध कोरिया खाद्य अनुसंधान संस्थान (केएफआरआई) के मुख्य अनुसंधान कार्यक्रम (E0210702-03) द्वारा समर्थित था, जो विज्ञान और आईसीटी मंत्रालय द्वारा वित्त पोषित था।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96-well cell culture plate | SPL | 30096 | Polystyrene 96-well plate |
| BHI (Brain Heart Infusion) broth | Merck KGaA | 1.10493.0500 | |
| Blood Agar Base Plate | KisanBio | MB-B1005-P50 | Growth media for Acinetobacter |
| CHROMagar Acinetobacter | CHROMagar | AC092 | Selective plate for Acinetobacter |
| Crystal violet solution | Sigma-Aldrich | V5265 | |
| Filmtracer LIVE/DEAD biofilm viability kit | Invitrogen | L10316 | SYTO9 and propidium iodide |
| Microplate reader | Tecan | Infinite M200 PRO NanoQuant | Biofilm measurement |
| RBC Glass Plating Beads | RBC | RG001 | Glass beads |
| μ-Plate 96 Well Black | ibidi | 89621 | Microplate intended for CLSM |
References
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