Summary
Questo protocollo descrive la preparazione dell'inoculo, la quantificazione del biofilm su piastre per microtitolazione utilizzando un colorante crystal violet, la conta vitale nei biofilm e la visualizzazione dei biofilm di Acinetobacter.
Abstract
L'Acinetobacter provoca infezioni nosocomiali e la sua formazione di biofilm può contribuire alla sopravvivenza su superfici asciutte come gli ambienti ospedalieri. Pertanto, la quantificazione e la visualizzazione del biofilm sono metodi importanti per valutare il potenziale dei ceppi di Acinetobacter di causare infezioni nosocomiali. I biofilm che si formano sulla superficie della micropiastra possono essere quantificati in termini di volume e numero di cellule. I volumi del biofilm possono essere quantificati mediante colorazione con crystal violet, lavaggio, decolorazione con etanolo, quindi misurazione del colorante solubilizzato con un lettore di micropiastre. Per quantificare il numero di cellule incorporate nei biofilm, i biofilm vengono raschiati utilizzando raschietti cellulari, raccolti nella soluzione salina, agitati vigorosamente in presenza di perle di vetro e sparsi su Acinetobacter agar. Successivamente, le piastre vengono incubate a 30 °C per 24-42 ore. Dopo l'incubazione, le colonie rosse vengono enumerate per stimare il numero di cellule nei biofilm. Questo metodo di conteggio può essere utile anche per contare le cellule di Acinetobacter nei biofilm di specie miste. I biofilm di Acinetobacter possono essere visualizzati utilizzando coloranti fluorescenti. Una micropiastra disponibile in commercio progettata per l'analisi microscopica viene impiegata per formare biofilm. Quindi, i biofilm attaccati alla superficie inferiore vengono colorati con SYTO9 e coloranti allo ioduro di propidio, lavati, quindi visualizzati con microscopia a scansione laser confocale.
Introduction
È noto che l'Acinetobacter causa infezioni nosocomiali e la sua infezione umana, soprattutto nelle strutture sanitarie, è sempre più segnalata1. È diffuso negli ospedali, nelle strutture sanitarie e negli ambienti associati al cibo 2,3,4. Può sopravvivere per un lungo periodo in ambienti come le superfici ospedaliere come le sponde dei letti, i comodini, la superficie dei ventilatori e i lavandini4. Tale persistenza sulle superfici ambientali può essere uno dei fattori significativi che contribuiscono alle infezioni nosocomiali di Acinetobacter4.
Il biofilm è una forma di vita microbica ed è una matrice microbica composta da cellule microbiche vive e sostanze polimeriche extracellulari (EPS) provenienti dalle cellule5. Le cellule microbiche sono incorporate nella matrice e sono spesso altamente resistenti agli stress ambientali come calore, sali, secchezza, antibiotici, disinfettanti e forze di taglio 6,7.
L'Acinetobacter può formare biofilm sulle superfici, suggerendo che può contribuire a prolungare la sopravvivenza sulle superfici ambientali, comprese le superfici ospedaliere, e a migliorare la resistenza al trattamento antibiotico 8,9. Inoltre, la formazione di biofilm di Acinetobacter potrebbe essere altamente associata agli esiti clinici nell'uomo8. Pertanto, la formabilità del biofilm dei ceppi di Acinetobacter potrebbe essere uno degli indicatori nel predire la sopravvivenza ambientale e le infezioni umane 8,10.
I biofilm attaccati alla superficie possono essere quantificati e visualizzati per valutare la formabilità del biofilm. Per quantificare i biofilm attaccati alla superficie, i biofilm vengono normalmente colorati con coloranti coloranti per biofilm come il crystal violet e i coloranti vengono eluiti in soluzione e misurati per la densità ottica11. La visualizzazione dei biofilm è un altro buon approccio per valutare la formabilità del biofilm11. Il metodo di visualizzazione della microscopia laser a scansione confocale (CLSM) che impiega la specificità utilizzando coloranti fluorescenti potrebbe essere più utile per caratterizzare la morfologia del biofilm rispetto ad altre tecniche come SEM12,13.
Le cellule vitali nei biofilm possono essere contate per stimare il numero di cellule vitali nei biofilm11. Le cellule vitali incorporate nei biofilm vengono staccate, diluite, distribuite su piastre di agar, incubate ed enumerate. Poiché è probabile che il numero maggiore di cellule soddisfi la dose infettiva, può fornire informazioni più dettagliate sui biofilm, come i potenziali di infezione associati al numero di cellule13,14.
Questo articolo presenta protocolli passo-passo per (1) quantificare i biofilm attaccati alla superficie, (2) contare le cellule vitali nei biofilm e (3) visualizzare i biofilm utilizzando il CLSM di Acinetobacter. I protocolli presentati descrivono i metodi per valutare la formabilità del biofilm degli isolati di Acinetobacter e caratterizzare i loro biofilm.
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Protocol
1. Preparazione dell'inoculo batterico
- Rimuovere il flaconcino di glicerolo conservato a -80 °C.
- Rimuovere il ceppo batterico (2-10 μL) dal flaconcino utilizzando un puntale sterile per pipetta.
NOTA: In questo protocollo vengono utilizzati ceppi di Acinetobacter, A. bouvetii (13-1-1), A. junii (13-1-2), A. pittii (13-2-5), A. baumannii (13-2-9), A. radioresistens (20-1) e A. ursingii (24-1). - Inoculare una piastra di agar di sangue disponibile in commercio (agar di soia triptica integrato con il 5% di sangue di pecora, vedere Tabella dei materiali) con i batteri.
NOTA: È possibile utilizzare anche altri terreni, come l'agar nutriente o l'agar MacConkey. - Striare la superficie dell'agar utilizzando un anello sterile con fiamma intermittente per diluirla.
- Porre la piastra di agar capovolta in un'incubatrice e incubare a 30 °C per una notte per 20-24 ore.
- Prelevare una singola colonia della coltura batterica con un ago sterile e inoculare 5 mL di brodo sterile per infusione di cuore cerebrale (BHI, vedere Tabella dei materiali) con la coltura.
- Incubare il brodo inoculato in un'incubatrice agitata a 30 °C per una notte per 20-24 ore a circa 150 giri/min.
- Trasferire 1 mL di coltura notturna in una provetta sterile per microcentrifuga e centrifugare la coltura durante la notte a 6.000 × g per 10 minuti a temperatura ambiente (RT).
- Rimuovere il surnatante con una pipetta.
- Utilizzando un vortice, risospendere il pellet in 1 mL di soluzione fisiologica sterile tamponata con fosfato (PBS).
- Centrifugare a 6.000 × g per 10 minuti a RT e rimuovere il surnatante.
- Risospendere il pellet in BHI sterile diluito dieci volte utilizzando il vortice a una densità ottica di circa 0,1 a 600 nm.
NOTA: La densità ottica di circa 0,1 è equivalente a circa 10,7 CFU/mL.
2. Quantificazione del biofilm mediante crystal violet
- Aggiungere 200 μL di inoculo a ciascun pozzetto di una piastra sterile in polistirene a 96 pozzetti (vedere la tabella dei materiali) e aggiungere 200 μL di acqua deionizzata a ciascuno dei pozzetti più esterni per evitare che i pozzetti interni si secchino15.
- Aggiungere 200 μL di BHI diluito dieci volte a ciascun pozzetto della stessa piastra come controllo negativo.
- Incubare la piastra a 25 °C per 24 ore.
- Rimuovere il surnatante con una pipetta.
NOTA: La pipetta multicanale è spesso più conveniente per più campioni. - Aggiungere con cautela 300 μL di PBS a ciascun pozzetto e rimuovere il surnatante con una pipetta.
NOTA: La pipetta multicanale è spesso più conveniente per più campioni. - Ripetere il passaggio 2.5 altre due volte.
- Aggiungere 200 μL di soluzione di cristallo violetto (1%) (vedere Tabella dei materiali) in ciascun pozzetto e incubare a RT per 30 minuti.
- Ripetere i passaggi 2.4-2.6.
- Aggiungere 200 μL di etanolo assoluto a ciascun pozzetto e incubare per 15 minuti a RT. Miscelare accuratamente pipettando su e giù più volte.
- Trasferire l'eluizione da 100 μL da ciascun pozzetto a una nuova piastra a 96 pozzetti.
- Misurare l'assorbanza a 595 nm utilizzando un lettore per micropiastre (vedere la tabella dei materiali).
- Quando l'assorbanza supera 2,0, effettuare una corretta diluizione del campione all'assorbanza inferiore a 2,0 in etanolo assoluto e misurarla come al punto 2.11. Quindi, calcolare l'assorbanza del campione (valore finale) moltiplicando il valore osservato per il fattore di diluizione.
- Calcolare l'assorbanza reale dei campioni sottraendo il valore medio del controllo negativo dal valore di ciascun pozzetto dei campioni di prova sulla stessa piastra di pozzetto.
3. Conteggio della vitalità del biofilm
- Aggiungere 1 mL di inoculo (fase 1) a ciascun pozzetto di una piastra sterile in polistirene a 12 pozzetti15. Incubare la piastra a 25 °C per 24 ore. Rimuovere il surnatante con una pipetta.
- Aggiungere con cautela 1,5 mL di PBS sterile a ciascun pozzetto e rimuovere il surnatante con una pipetta. Aggiungere 1 mL di PBS sterile a ciascun pozzetto.
- Raschiare via le superfici del fondo e delle pareti del pozzo utilizzando raschietti per celle montati.
- Trasferire la sospensione cellulare raccolta in una provetta di plastica sterile (10-1) contenente 9 mL di soluzione fisiologica (0,85% NaCl) e 10-20 perle di vetro (vedere Tabella dei materiali).
NOTA: Per raccogliere eventuali detriti residui di biofilm lasciati sulla superficie inferiore del pozzo, è possibile risospenderlo e trasferirlo tramite pipetta utilizzando soluzione fisiologica dalla provetta 10-1 . - Vorticare il tubo 10-1 per 60 s alla massima velocità.
- Effettuare una diluizione seriale di 10 volte trasferendo 1 mL nella provetta sterile successiva (10-2) contenente 9 mL di soluzione fisiologica (0,85 % NaCl) fino a 10-7.
- Distribuire 100 μL da ciascuna diluizione su Acinetobacter agar (vedere Tabella dei materiali) e incubare le piastre di agar a 30 °C per 24-42 h.
- Contare manualmente il numero delle tipiche colonie rosse su ogni piatto nell'intervallo compreso tra 10 e 250.
- Calcola il numero di cellule vitali nel biofilm di ciascun pozzetto utilizzando l'equazione seguente:
Cellule vitali = Numero di colonie × Fattori di diluizione × 10
4. Visualizzazione del biofilm mediante microscopia confocale a scansione laser (CLSM)
- Aggiungere 200 μL di inoculo a ciascun pozzetto di una piastra sterile a 96 pozzetti destinata all'analisi microscopica.
- Incubare la piastra a 25 °C per 24 ore.
- Rimuovere il surnatante con una pipetta.
- Aggiungere con cautela 300 μL di acqua deionizzata sterilizzata con filtro a ciascun pozzetto e rimuovere il surnatante con una pipetta.
- Ripetere il passaggio 4.4.
- Preparare la miscela di SYTO 9 e ioduro di propidio (vedere Tabella dei materiali) diluita in acqua deionizzata sterilizzata con filtro fino a una concentrazione finale di 10 μM e 60 μM, rispettivamente.
- Aggiungere la miscela a ciascun pozzetto a 200 μL e incubare la piastra per 20-30 minuti a RT al buio.
- Ripetere i passaggi 4.3-4.4
- Visualizzare i biofilm attaccati alla superficie inferiore utilizzando CLSM con la lunghezza d'onda di eccitazione di 488 nm e 561 nm e l'intervallo di lunghezze d'onda di emissione di 499-535 nm e 568-712 nm, rispettivamente.
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Representative Results
Seguendo il protocollo, i biofilm di isolati di Acinetobacter, originariamente isolati dalle superfici delle cucine, sono stati formati su una piastra di polistirene a 96 pozzetti, colorata con crystal violet, e i coloranti sono stati solubilizzati in etanolo e misurati per la massa del biofilm (Figura 1). Il numero di biofilm variava notevolmente a seconda dei ceppi che variavano da OD 0,04 a 1,69 (Figura 1). Sulla base dei criteri stabiliti da Stepanović et al.16, tutti gli isolati, ad eccezione di A. bouvetii, hanno formato biofilm. A. radioresistens ha formato un debole biofilm. A. junii e A. baumannii hanno formato biofilm moderati, mentre A. pittii e A. ursingii hanno formato biofilm forti.
Per contare le cellule vitali nei biofilm, i biofilm sono stati raschiati via utilizzando raschietti cellulari, vorticati ad alta velocità, diluiti e diffusi sulle piastre selettive di Acinetobacter . Dopo l'incubazione, il numero di colonie è stato contato per stimare il numero di cellule del biofilm (Figura 2). Tutti gli isolati, ad eccezione di A. bouvetii, avevano cellule equivalenti a 7-8 Log CFU nei loro biofilm. Coerentemente con la proprietà non formante del biofilm mostrata dal saggio del cristallo violetto, A. bouvetii aveva un livello molto più basso di numero di cellule a 4,4 Log CFU.
I biofilm attaccati alla superficie inferiore sono stati visualizzati utilizzando CLSM (Figura 3). Una notevole quantità di biofilm è stata trovata in A. junii, A. baumannii e A. ursingii con morfologie di biofilm distinte. Mentre A. pittii era un forte biofilm formato nel saggio del viola cristallo, non ha formato molto biofilm sulla superficie inferiore.
Figura 1: Misurazione della massa del biofilm di Acinetobacter formato su una piastra di polistirene a 96 pozzetti utilizzando il saggio del cristallo violetto. Le barre di errore rappresentano la deviazione standard dalla triplice. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Conteggi vitali di biofilm di Acinetobacter formati su una piastra di polistirene a 12 pozzetti. Le barre di errore rappresentano la deviazione standard dal duplicato. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Biofilm di Acinetobacter attaccati alla superficie inferiore formati su una piastra a 96 pozzetti visualizzata da CLSM utilizzando SYTO 9 e coloranti allo ioduro di propidio. Barre graduate: 50 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Utilizzando il protocollo descritto, è stata misurata, visualizzata la formazione di biofilm di isolati di Acinetobacter con vari gradi e sono state stimate le cellule vitali nei biofilm (Figura 1, Figura 2 e Figura 3).
In questo protocollo sono state utilizzate due diverse temperature, 30 °C per la crescita e 25 °C per la formazione del biofilm di Acinetobacter. È stata utilizzata una temperatura di 30 °C perché molti studi hanno utilizzato una temperatura superiore a 30 °C per la crescita ottimale di Acinetobacter, che sarebbe stata appropriata per ottenere una quantità sufficiente di inoculo12,13,14,17. Tuttavia, questa temperatura è generalmente superiore alle temperature dell'ambiente in cui si verificherebbe la formazione di biofilm, come le superfici ospedaliere o gli ambienti di lavorazione degli alimenti. Pertanto, sono stati utilizzati 25 °C per la formazione del biofilm, che simulerebbe maggiormente queste condizioni ambientali.
Questo protocollo ha utilizzato un BHI diluito 10 volte invece del BHI originale per formare biofilm (passaggio 1.12). È probabile che molte superfici, come le superfici ospedaliere o gli ambienti di lavorazione degli alimenti, siano a basso contenuto di nutrienti18,19. Inoltre, i microrganismi sulle superfici contaminate rimangono sulle superfici dopo la pulizia e persistono in condizioni di scarsità di nutrienti20. Pertanto, le condizioni a basso contenuto di nutrienti come il BHI diluito 10 volte sono più desiderabili rispetto alle condizioni ad alto contenuto di nutrienti come il BHI originale.
Il test del viola cristallino è un metodo generalmente accettato e consolidato per misurare la massa del biofilm e questo studio ha dimostrato che la formabilità del biofilm di Acinetobacter è distinguibile a vari livelli utilizzando questo metodo.
La conta vitale nel biofilm è importante anche perché le cellule vitali nei biofilm sono responsabili di infezioni umane che hanno maggiori probabilità di verificarsi da parte di un numero maggiore di cellule21. Inoltre, il conteggio vitale può essere un buon strumento per distinguere i poveri produttori di biofilm, come dimostrato in A. bouvetii e A. radioresistens (Figura 1 e Figura 2). La conta vitale di A. radioresistens era molto più alta di quella di A. bouvetii, mentre è stata riscontrata poca differenza nella massa del biofilm, suggerendo un maggiore potenziale di infezione da parte di A. radioresistens (Figura 1 e Figura 2). Inoltre, questo metodo può essere utilizzato per stimare la proporzione di Acinetobacter nei biofilm multispecie, che è più comune nell'ambiente.
L'Acinetobacter forma biofilm non solo sulla superficie inferiore ma anche sulla parete laterale, in particolare all'interfaccia aria-liquido nei tubi17,22. L'analisi CLSM utilizzando una piastra per microtitolazione è limitata ai biofilm attaccati alla superficie inferiore, il che rende talvolta difficile il confronto con i risultati del saggio del cristallo violetto, che misura tutte le superfici sommerse, comprese le superfici delle pareti. In questi isolati è stata trovata anche una notevole quantità di biofilm all'interfaccia aria-liquido, in particolare il forte produttore di biofilm, A. pittii. Ha formato un biofilm relativamente povero sulla superficie inferiore rispetto ad altri isolati (Figura 3). Pertanto, è necessario sviluppare ulteriormente una tecnica di analisi microscopica per visualizzare i biofilm formati sulla parete laterale.
In questo studio, sono stati utilizzati tre diversi saggi, crystal violet, viable count e CLSM, per caratterizzare i biofilm di Acinetobacter. Il saggio del cristallo violetto è il metodo consolidato per quantificare i biofilm e i criteri per determinare la formabilità del biofilm esistono16. Tuttavia, misura non solo le cellule vive e l'EPS, ma anche le cellule morte, che sono meno significative in termini di infezione umana e virulenza. Le cellule vive nei biofilm possono essere misurate con il metodo della conta vitale. Tuttavia, la formabilità del biofilm non può essere determinata con il metodo del conteggio vitale perché questo metodo non misura l'EPS, un componente critico nella struttura del biofilm. Pertanto, questo metodo non ha i criteri o il valore di cut-off per determinare la formabilità del biofilm. Inoltre, il metodo di conteggio vitale misura solo la coltivabilità delle cellule e non misura le cellule in "stato vitale ma non coltivabile"11. La presenza di biofilm può essere confermata dal metodo CLSM, che visualizza efficacemente i biofilm. Tuttavia, misura solo i biofilm attaccati alla superficie inferiore, sebbene i biofilm si formino spesso anche sulle pareti laterali. Pertanto, si raccomanda di utilizzare il saggio del cristallo violetto per determinare la formabilità del biofilm. Quindi, le cellule vive e coltivabili nei biofilm possono essere quantificate con il metodo del conteggio vitale e i biofilm attaccati alla superficie inferiore possono essere confermati o caratterizzati con il metodo CLSM.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Questa ricerca è stata supportata dal Main Research Program (E0210702-03) del Korea Food Research Institute (KFRI), finanziato dal Ministero della Scienza e delle TIC.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96-well cell culture plate | SPL | 30096 | Polystyrene 96-well plate |
| BHI (Brain Heart Infusion) broth | Merck KGaA | 1.10493.0500 | |
| Blood Agar Base Plate | KisanBio | MB-B1005-P50 | Growth media for Acinetobacter |
| CHROMagar Acinetobacter | CHROMagar | AC092 | Selective plate for Acinetobacter |
| Crystal violet solution | Sigma-Aldrich | V5265 | |
| Filmtracer LIVE/DEAD biofilm viability kit | Invitrogen | L10316 | SYTO9 and propidium iodide |
| Microplate reader | Tecan | Infinite M200 PRO NanoQuant | Biofilm measurement |
| RBC Glass Plating Beads | RBC | RG001 | Glass beads |
| μ-Plate 96 Well Black | ibidi | 89621 | Microplate intended for CLSM |
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