Summary
本稿では、マウス大動脈周囲脂肪組織からの間質血管分画由来前駆脂肪細胞を単離、培養、脂肪誘発し、血管周囲脂肪組織の機能や血管細胞との関係を研究することを可能とする。
Abstract
血管周囲脂肪組織(PVAT)は、血管を取り囲み、白色、ベージュ色、茶色の脂肪細胞の表現型を示す脂肪組織デポです。最近の発見により、血管の恒常性を調節し、心血管疾患の病因に関与するPVATの中心的な役割が明らかになりました。PVATの特性と調節を包括的に理解することは、将来の治療法の開発にとって非常に重要です。大動脈周囲脂肪細胞の初代培養は、PVAT機能や大動脈周囲脂肪細胞と血管細胞間のクロストークを研究する上で貴重です。この論文は、in vitroでの脂肪形成または脂肪形成のモデル化に有用であり得る、マウス大動脈周囲脂肪組織からの間質血管画分由来前駆脂肪細胞の単離、培養、および脂肪生成誘導のための経済的で実行可能なプロトコルを提示します。プロトコルは若いマウスからのperiaortic脂肪細胞を培養するためのティッシュ処理そしてセル微分を概説する。このプロトコルは、PVAT機能を調査するためのベンチサイドの技術的基盤を提供します。
Introduction
成熟脂肪細胞と間質血管分画(SVF)の混合物からなる血管周囲構造である血管周囲脂肪組織(PVAT)は、その分泌傍を介して隣接する血管壁と相互作用すると考えられています1。血管の恒常性を調節する重要な調節因子として、PVATの機能不全は心血管疾患の病因に関与しています2,3,4。脂肪細胞組織のSVFは、内皮細胞、免疫細胞、中皮細胞、神経細胞、脂肪幹細胞および前駆細胞(ASPC)など、いくつかの予想される細胞集団で構成されています5,6。脂肪組織のSVFに常在するASPCが成熟脂肪細胞を生じさせることはよく知られている5。SVFは、PVATにおける成熟脂肪細胞の重要な供給源であると推測されています。いくつかの研究により、PVAT-SVFは特定の誘導条件下で成熟脂肪細胞に分化できることが示されています6,7,8。
現在、脂肪組織からSVFを単離するための分離システムには2つあり、1つは酵素的消化、もう1つは非酵素的である9。酵素法は、典型的には、有核前駆細胞の収量を高くする10。現在までに、創傷治癒、泌尿生殖器、および心血管疾患における血管再生および血管新生の促進におけるSVFの利点は、特に皮膚科および形成外科において広く実証されています111,13。しかし、PVAT由来のSVFの臨床応用の見通しは十分に調査されておらず、これはPVATからSVFを分離するための標準化された方法の欠如に起因する可能性があります。このプロトコルの目的は、胸部大動脈を取り巻くマウスPVATからのSVF由来の前駆脂肪細胞の分離、培養、および脂肪誘発のための標準化されたアプローチを確立し、PVAT機能のさらなる調査を可能にすることです。このプロトコルは若いマウスから得られるperiaortic脂肪細胞を培養するためのティッシュの処理およびセル微分技術を最大限に活用する。
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Protocol
動物プロトコルは、上海交通大学医学部附属上海胸部病院の動物実験委員会(承認番号:KS23010)によって承認され、関連する倫理規制に準拠していました。この実験では、4〜8週齢の雄および雌のC57BL / 6マウスが優先されます。
1. 手術器具、緩衝液、培地の調製
- オートクレーブ手術器具(手術用ハサミや標準鉗子など)を121°Cで30分間。マイクロサージェリー器具を75%アルコールで消毒します。
- 1% v/v ペニシリン-ストレプトマイシンを添加した滅菌リン酸緩衝生理食塩水(PBS)と、10% v/v ペニシリン-ストレプトマイシンを添加した別の 10 mL の PBS を調製します。
注:以下のセクションでは、特に言及されていない場合、PBSは通常の滅菌PBSを指します。 - Krebs Ringer HEPES BSAバッファーを調製します:1%ウシ血清アルブミン(BSA)、20 mM HEPESをKrebs Ringer溶液に溶解します。
- Krebs Ringer HEPES BSAバッファーに溶解した1型コラゲナーゼ(1 mg/mL)およびディスパーゼII(4 mg/mL)の新鮮な消化液を調製します。0.2μmのフィルターで溶液を滅菌します。
- コラーゲンでコーティングされた12ウェルプレートを調製します。
- コラーゲン溶液(1 mg/mL)を滅菌脱イオン水で40 μg/mLの濃度に希釈します。希釈したコラーゲン溶液1mLを各ウェルの表面に添加し、6〜10μg/cm2の濃度にする。コーティングを室温で1時間インキュベートします。
- 残りの溶液を取り除き、各ウェルを1 mLのPBSで2回すすぎます。プレートをすぐに使用するか、クラスII層流フードでプレートを風乾させ、コーティングされたプレートを2〜8°Cで保管します。 保管の際は、コーティングされたプレートをパラフィルムで密封してください。
- 培地を調製します:高グルコースダルベッコ修飾ワシ培地(DMEM)、10%ウシ胎児血清(FBS)、1%v/vペニシリン-ストレプトマイシン。4°Cで最大2週間保管してください。
- 高グルコースDMEM、10% FBS、1% v/v ペニシリン-ストレプトマイシン、1 nM トリヨードチロニン、1 μM ロシグリタゾン、1 μM インスリン、0.5 mM 3-イソブチル-1-メチルキサンチン(IBMX)、および1 μMデキサメタゾン。4°Cで最大2週間保管してください。
- 維持培地を調製します:高グルコースDMEM、10%FBS、1%v/vペニシリン-ストレプトマイシン、1 nMトリヨードチロニン、1 μMロシグリタゾン、および1 μMインスリン。4°Cで最大2週間保管してください。
2. 血管周囲脂肪組織(PVAT)の解剖・単離
- 2%イソフルラン麻酔下での子宮頸部脱臼または二酸化炭素の過剰摂取によりマウスを安楽死させる。皮膚消毒のために75%アルコールをスプレーします。
- マウスを仰臥位(上向き)に置きます。
- 皮膚を持ち上げ、小さな切開を行い、骨盤から首までの腹側正中線に沿って外科用ハサミで皮膚と腹筋を鈍く分離します。正中線の両側に沿って横隔膜と肋骨を切断して、心臓と肺を露出させます。
- 肝臓、脾臓、腸、腎臓を慎重に取り除きます。腸壁を切らないでください。
- 肺と食道を切除します。
- 片手で鉗子で心臓をそっと持ち上げ、もう片方の手で手術用ハサミで大動脈を脊椎から分離します。次に、心臓と大動脈を、1%v/vペニシリン-ストレプトマイシンを含むPBSを含む60mmシャーレに入れます。
- マイクロサージェリー鉗子とマイクロサージェリーハサミをアルコールから取り除き、25 mLのPBSですすぎ、余分なアルコールを取り除きます。実体顕微鏡下で、心臓と大動脈から胸腺やその他の組織を取り除き、次に心臓を取り除き、大動脈にPVATを残します。
- PVATを含む大動脈を、1%v/vペニシリン-ストレプトマイシンを含むPBSを含む清潔な60mmペトリ皿に移します。
- 顕微鏡手術用鉗子を使用してPVATを剥がし、1組の鉗子で大動脈を固定し、もう1組の鉗子で脂肪組織を引き抜きます。血管周囲脂肪組織への損傷を最小限に抑えながら、血管組織を可能な限り除去します。
- 胸部大動脈を取り囲むPVATを、氷上に置かれた1%v/vペニシリン-ストレプトマイシンを添加した高グルコースDMEMを含む2 mL微量遠心チューブに集めます。
3. 間質血管分画(SVF)の単離
- 採取した組織を、10%v/vペニシリン-ストレプトマイシンを含むPBSおよび1%v/vペニシリン-ストレプトマイシンを含むPBSで順次すすぎます。
注:このステップ以降、すべての実験は、クラスII層流フードの無菌条件下で実施する必要があります。 - 組織を滅菌済みの60 mmシャーレに移し、消化液200 μLを加え、滅菌ハサミを使用して1 mm3 個に細かく刻みます。
- プラスチック製のピペットチップを使用して混合物を15 mLの遠心チューブに移し、端を滅菌シザーカットで広げ、6 mLの消化液を加えて消化反応を開始します。
注:1回の消化反応液(3 mLの消化溶液)は、6匹のマウスのPVATデポに十分です。 - オービタルシェーカー(効果的な混合のために150rpmの頻度)を備えたインキュベーターで37°Cで30〜45分間組織をインキュベートします。チューブをラックに平らに結び、チューブを水平に振らせます。5〜10分ごとに10秒間、手で激しく上下に振ってください。
注:組織片が残っていない均質な黄色がかった消化液が見られる場合は、消化を中止できます。 - 消化した組織を70 μmのセルストレーナーを通して50 mLの遠心チューブに濾します。セルストレーナーを等量の培地ですすぎ、細胞収量を最大化し、消化を停止します。
- ろ液を新しい15 mL遠心チューブに移し、1,800 × g で10分間遠心分離します。チューブを逆さにして上清を廃棄し、ペレットを5 mLのPBSに再懸濁します。1,800 × g で5分間遠心分離します。
- チューブを逆さにして上清を廃棄し、ペレットを適量の培地に再懸濁します。
注:6匹のマウスから採取した細胞ペレットを1 mLの培地に再懸濁し、12ウェルプレートの1ウェルに播種します。 - 細胞をコラーゲンでコーティングした12ウェルプレートに播種し、湿度の高い雰囲気中で37°C、5%CO2 で一晩インキュベートします。
- 翌日、培地を吸引し、1% v/v ペニシリン-ストレプトマイシンを含む予熱(37°C)PBSで細胞を洗浄して細胞破片と赤血球を除去し、各ウェルに1 mLの新鮮な培地を戻します。
4. 大動脈周囲脂肪組織からのSVF由来前駆脂肪細胞の脂肪生成誘導
- 細胞が60~70%のコンフルエントに達するまで、1日おきに培地を交換してください。
注:セルが60〜70%のコンフルエントに達するまでに通常3〜4日かかります。 - 細胞が60〜70%のコンフルエントに達したら、培地を吸引し、褐色脂肪誘導培地と交換します。脂肪分化の誘導の日を分化の0日目と考えてください。
- 72時間後(分化の3日目)後、培地を維持培地でリフレッシュします。細胞が実験に使用されるまで、2日ごとに維持培地を交換してください。
- 脂肪生成細胞をオイルレッドO染色14 やウェスタンブロッティング15などの適切な方法で分析します。
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Representative Results
上記のプロトコルを用いて、マウス胸部大動脈を取り巻くPVATを慎重に単離しました(図1A-D)。滅菌ハサミを使用してPVATを洗浄し、細かく刻んだ後(図1E、F)、組織断片を1型コラゲナーゼ(1 mg/mL)およびディスパーゼII(4 mg/mL)を含む消化溶液中で消化し、シェーカー上で37°Cで30〜45分間インキュベートしました(図1G)。消化した組織を70 μmのセルストレーナーで50 mLの遠心チューブに濾しました(図1H)。遠心分離後に細胞ペレットを回収しました(図1I)。
SVF由来の前駆脂肪細胞の脂肪形成能を確認するために、1 nMのトリヨードチロニン、1 μMのロシグリタゾン、1 μMのインスリン、0.5 mM IBMX、および1 μMのデキサメタゾンを含む褐色脂肪誘発培地で細胞を誘導しました。成熟脂肪細胞は、7〜10日間の褐色脂肪誘発後に観察され、オイルレッドO染色された脂質に富む液胞の形成を特徴としています(図2A)。さらに、ウェスタンブロッティング解析では、アディポネクチン、Fabp4、Pgc1α、Pparγ、Ucp1、ミトコンドリアタンパク質Cox IVなどの脂肪細胞特異的タンパク質の発現レベルが上昇していることが示されました(図2B、C)。これらのデータから、マウス大動脈周囲脂肪組織由来のSVF由来前駆脂肪細胞が強い脂肪形成能を示すことが示唆された。
図1:マウス大動脈周囲脂肪組織からの間質血管分画の単離 。 (A)心臓と大動脈は、外科用鉗子とハサミを使用して慎重に解剖されます。白と黄色の矢印は、それぞれ心臓と大動脈を示します。(B)胸部大動脈を取り囲むPVATは、鉗子を使用して慎重に剥がされます。(C)胸部大動脈を取り囲むPVATを除去した後に残った大動脈。(D)PVATは、1%v/vペニシリン-ストレプトマイシンを含む高グルコースDMEMを含む2 mL微量遠心チューブに収集されます。(E)PVATは、10%v/vペニシリン-ストレプトマイシンを含むPBSおよび1%v/vペニシリン-ストレプトマイシンを含むPBSで順次すすぎます。(F)滅菌ハサミを使用してPVATを1mm3 個に細かく刻みます。(g)みじん切りにしたPVATを6mLの消化液を含む15mLの遠心分離管に移し、150rpmで振とうしながら37°Cで30〜45分間組織をインキュベートします。(H)消化を停止し、懸濁液を70 μmのセルストレーナーで50 mLの遠心チューブにろ過します。(I)濾液を1,800× g で10分間遠心分離する。SVFが分離されました。略語:PVAT =血管周囲脂肪組織;SVF = 間質血管分画。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図2:マウス大動脈周囲脂肪組織からの間質血管分画の脂肪形成分化 。 (A)8日目に大動脈周囲前駆脂肪細胞から分化した初代脂肪細胞の光学顕微鏡とオイルレッドO染色の代表画像。スケールバー = 200 μm。 (B,C)8日目に大動脈周囲前駆脂肪細胞から分化した初代脂肪細胞のアディポネクチン、Fabp4、Pgc1α、Pparγ、Cox IV、およびUcp1のタンパク質レベルのウェスタンブロッティング分析。対応のない両側スチューデントの t検定を使用して、2つのグループ間の有意差を計算しました。値はSEM±平均値です。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
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Discussion
本研究では、マウス大動脈周囲脂肪組織からSVF由来前駆脂肪細胞を単離し、脂肪誘発するための実用的かつ実行可能なアプローチを提案する。このプロトコルの利点は、シンプルで経済的であることです。組織が不十分な場合、SVF密度が低くなり、増殖状態が悪くなり、最終的に脂肪生成効率に影響を与える可能性があるため、十分な数のマウスが単離を成功させるために重要です。さらに、SVFの脂肪形成能は年齢とともに低下するため、マウスの年齢は考慮すべき重要な要素です。血管系の汚染を最小限に抑えながら、PVATを迅速かつ慎重に分離することが重要です。1型コラゲナーゼにジスパーゼIIを添加することで、細胞の消化速度と収量を向上させることができるため、消化液も重要な成分です。細胞の生存率に影響を与える可能性があるため、過剰消化を避けるために消化プロセスに細心の注意を払うことが重要です。無菌技術に従い、プロトコル全体を通して適切な培養条件を維持することが不可欠です。
大動脈周囲脂肪細胞の初代培養は、PVATの特性と機能を研究する上で貴重です。遺伝子改変マウスの大動脈周囲脂肪組織からのSVF由来前駆脂肪細胞の単離および脂肪誘発は、in vitroでPVATの分化と脂肪形成の重要な制御因子を探索するためのプラットフォームを提供します。PVATは、過酸化水素、アディポネクチン、アンジオテンシン1〜7、パルミチン酸メチル、硫化水素、一酸化窒素、レプチン3などの血管活性分子を生成することにより、血管収縮と血管リモデリングを外向きから内側に調節します。この提示された方法は、大動脈周囲脂肪細胞と内皮細胞16、血管平滑筋細胞(VSMC)17、外膜線維芽細胞18、またはマクロファージ19の間のクロストークのさらなる研究を可能にし、高血圧、アテローム性動脈硬化症、狭窄症、動脈瘤などの心血管疾患の病因におけるPVATの中心的な役割についての洞察を提供します20,21,22。
さらに、前駆脂肪細胞の単離と脂肪生成誘導は、PVAT系統とPVATの不均一性を研究するための基盤です。PVATは血管間および血管内の不均一な床であり、明確な転写プロファイルとして現れ、明確な生理学的および病理学的機能的特徴に寄与する可能性があります20,23。Changらは、VSMC特異的PPARγ欠失を有するマウスは、大動脈および腸間膜領域にPVATを欠損していることを報告し、PVATが局所血管壁と同じ胚起源を共有している可能性を示唆した24。異なる胚起源からのPVATは異なる表現型を持つ可能性があるという証拠があります25,26。外胚葉由来の神経堤細胞に由来する上行大動脈および大動脈弓を取り囲むPVAT(AA-PVAT)は、形態学的および転写学的に褐色脂肪組織(BAT)に類似している27。これに対応して、神経堤細胞由来のPVATのSVFは、in vitroで白色脂肪細胞よりも褐色脂肪細胞に分化しやすい傾向がある28。しかし、腹部大動脈PVATは、主に白色脂肪組織様表現型を示す29。PVATのBAT様表現型またはPVATのbeigingは、抗炎症および抗病理学的リモデリング効果と関連しており、PVAT表現型調節による心血管疾患の治療に光を当てています19,30。このプロトコルは、ベンチサイドで技術的な基盤を提供します。
それにもかかわらず、このプロトコルにはいくつかの制限があります。PVATは入手が限られているため、PVAT-SVFの抽出にはより多くのマウスが必要です。SVFの需要が高い状況では、実験の進行を加速させるために複数の担当者を関与させる必要があるかもしれません。不死化前駆脂肪細胞と比較して、SVF由来の前駆脂肪細胞は追加の人的および物的資源を必要とします。
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Disclosures
著者は、金銭的またはその他の利益相反を宣言していません。
Acknowledgments
本研究は、中国国家自然科学基金会(82130012および81830010)および上海胸部病院の基礎研究育成プロジェクト(グラント番号:2022YNJCQ03)の支援を受けて行われました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2 μm syringe filters | PALL | 4612 | |
| 12-well plate | Labselect | 11210 | |
| 15 mL centrifuge tube | Labserv | 310109003 | |
| 3,3',5-triiodo-L-thyronine (T3) | Sigma-Aldrich | T-2877 | 1 nM |
| 50 mL centrifuge tube | Labselect | CT-002-50A | |
| anti-adiponectin | Abcam | ab22554 | 1:1,000 working concentration |
| anti-COX IV | CST | 4850 | 1:1,000 working concentration |
| anti-FABP4 | CST | 2120 | 1:1,000 working concentration |
| anti-PGC1α | Abcam | ab191838 | 1:1,000 working concentration |
| anti-PPARγ | Invitrogen | MA5-14889 | 1:1,000 working concentration |
| anti-UCP1 | Abcam | ab10983 | 1:1,000 working concentration |
| anti-α-Actinin | CST | 6487 | 1:1,000 working concentration |
| BSA | Beyotime | ST023-200g | 1% |
| C57BL/6 mice aged 4-8 weeks of both sexes | Shanghai Model Organisms Center, Inc. | ||
| Cell Strainer 70 µm, nylon | Falcon | 352350 | |
| Collagen from calf skin | Sigma-Aldrich | C8919 | |
| Collagenase, Type 1 | Worthington | LS004196 | 1 mg/mL |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D1756 | 1 μM |
| Dispase II | Sigma-Aldrich | D4693-1G | 4 mg/mL |
| Fetal bovine serum | Gibco | 16000-044 | 10% |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034-25G | 20 mM |
| High glucose DMEM | Hyclone | SH30022.01 | |
| IBMX | Sigma-Aldrich | I7018 | 0.5 mM |
| Incubator with orbital shaker | Shanghai longyue Instrument Eruipment Co.,Ltd. | LYZ-103B | |
| Insulin (cattle) | Sigma-Aldrich | 11070-73-8 | 1 μM |
| Isoflurane | RWD | R510-22-10 | |
| Krebs-Ringer's Solution | Pricella | PB180347 | protect from light |
| Microsurgical forceps | Beyotime | FS233 | |
| Microsurgical scissor | Beyotime | FS217 | |
| Oil Red O | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd | A600395-0050 | |
| PBS (Phosphate-buffered saline) | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd | B548117-0500 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 115-035-146 | 1:5,000 working concentration |
| Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 111-035-144 | 1:5,000 working concentration |
| Rosiglitazone | Sigma-Aldrich | R2408 | 1 μM |
| Standard forceps | Beyotime | FS225 | |
| Surgical scissor | Beyotime | FS001 |
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