マウス大動脈周囲脂肪組織からの間質血管分画由来前駆脂肪細胞の単離・培養・脂肪誘発
Summary
本稿では、マウス大動脈周囲脂肪組織からの間質血管分画由来前駆脂肪細胞を単離、培養、脂肪誘発し、血管周囲脂肪組織の機能や血管細胞との関係を研究することを可能とする。
Abstract
血管周囲脂肪組織(PVAT)は、血管を取り囲み、白色、ベージュ色、茶色の脂肪細胞の表現型を示す脂肪組織デポです。最近の発見により、血管の恒常性を調節し、心血管疾患の病因に関与するPVATの中心的な役割が明らかになりました。PVATの特性と調節を包括的に理解することは、将来の治療法の開発にとって非常に重要です。大動脈周囲脂肪細胞の初代培養は、PVAT機能や大動脈周囲脂肪細胞と血管細胞間のクロストークを研究する上で貴重です。この論文は、in vitroでの脂肪形成または脂肪形成のモデル化に有用であり得る、マウス大動脈周囲脂肪組織からの間質血管画分由来前駆脂肪細胞の単離、培養、および脂肪生成誘導のための経済的で実行可能なプロトコルを提示します。プロトコルは若いマウスからのperiaortic脂肪細胞を培養するためのティッシュ処理そしてセル微分を概説する。このプロトコルは、PVAT機能を調査するためのベンチサイドの技術的基盤を提供します。
Introduction
成熟脂肪細胞と間質血管分画(SVF)の混合物からなる血管周囲構造である血管周囲脂肪組織(PVAT)は、その分泌傍を介して隣接する血管壁と相互作用すると考えられています1。血管の恒常性を調節する重要な調節因子として、PVATの機能不全は心血管疾患の病因に関与しています2,3,4。脂肪細胞組織のSVFは、内皮細胞、免疫細胞、中皮細胞、神経細胞、脂肪幹細胞および前駆細胞(ASPC)など、いくつかの予想される細胞集団で構成されています5,6。脂肪組織のSVFに常在するASPCが成熟脂肪細胞を生じさせることはよく知られている5。SVFは、PVATにおける成熟脂肪細胞の重要な供給源であると推測されています。いくつかの研究により、PVAT-SVFは特定の誘導条件下で成熟脂肪細胞に分化できることが示されています6,7,8。
現在、脂肪組織からSVFを単離するための分離システムには2つあり、1つは酵素的消化、もう1つは非酵素的である9。酵素法は、典型的には、有核前駆細胞の収量を高くする10。現在までに、創傷治癒、泌尿生殖器、および心血管疾患における血管再生および血管新生の促進におけるSVFの利点は、特に皮膚科および形成外科において広く実証されています111,13。しかし、PVAT由来のSVFの臨床応用の見通しは十分に調査されておらず、これはPVATからSVFを分離するための標準化された方法の欠如に起因する可能性があります。このプロトコルの目的は、胸部大動脈を取り巻くマウスPVATからのSVF由来の前駆脂肪細胞の分離、培養、および脂肪誘発のための標準化されたアプローチを確立し、PVAT機能のさらなる調査を可能にすることです。このプロトコルは若いマウスから得られるperiaortic脂肪細胞を培養するためのティッシュの処理およびセル微分技術を最大限に活用する。
Protocol
動物プロトコルは、上海交通大学医学部附属上海胸部病院の動物実験委員会(承認番号:KS23010)によって承認され、関連する倫理規制に準拠していました。この実験では、4〜8週齢の雄および雌のC57BL / 6マウスが優先されます。 1. 手術器具、緩衝液、培地の調製 オートクレーブ手術器具(手術用ハサミや標準鉗子など)を121°Cで30分間。マイクロサージェリ…
Representative Results
上記のプロトコルを用いて、マウス胸部大動脈を取り巻くPVATを慎重に単離しました(図1A-D)。滅菌ハサミを使用してPVATを洗浄し、細かく刻んだ後(図1E、F)、組織断片を1型コラゲナーゼ(1 mg/mL)およびディスパーゼII(4 mg/mL)を含む消化溶液中で消化し、シェーカー上で37°Cで30〜45分間インキュベートしました(図1G)?…
Discussion
本研究では、マウス大動脈周囲脂肪組織からSVF由来前駆脂肪細胞を単離し、脂肪誘発するための実用的かつ実行可能なアプローチを提案する。このプロトコルの利点は、シンプルで経済的であることです。組織が不十分な場合、SVF密度が低くなり、増殖状態が悪くなり、最終的に脂肪生成効率に影響を与える可能性があるため、十分な数のマウスが単離を成功させるために重要です。さらに?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
本研究は、中国国家自然科学基金会(82130012および81830010)および上海胸部病院の基礎研究育成プロジェクト(グラント番号:2022YNJCQ03)の支援を受けて行われました。
Materials
| 0.2 μm syringe filters | PALL | 4612 | |
| 12-well plate | Labselect | 11210 | |
| 15 mL centrifuge tube | Labserv | 310109003 | |
| 3,3',5-triiodo-L-thyronine (T3) | Sigma-Aldrich | T-2877 | 1 nM |
| 50 mL centrifuge tube | Labselect | CT-002-50A | |
| anti-adiponectin | Abcam | ab22554 | 1:1,000 working concentration |
| anti-COX IV | CST | 4850 | 1:1,000 working concentration |
| anti-FABP4 | CST | 2120 | 1:1,000 working concentration |
| anti-PGC1α | Abcam | ab191838 | 1:1,000 working concentration |
| anti-PPARγ | Invitrogen | MA5-14889 | 1:1,000 working concentration |
| anti-UCP1 | Abcam | ab10983 | 1:1,000 working concentration |
| anti-α-Actinin | CST | 6487 | 1:1,000 working concentration |
| BSA | Beyotime | ST023-200g | 1% |
| C57BL/6 mice aged 4-8 weeks of both sexes | Shanghai Model Organisms Center, Inc. | ||
| Cell Strainer 70 µm, nylon | Falcon | 352350 | |
| Collagen from calf skin | Sigma-Aldrich | C8919 | |
| Collagenase, Type 1 | Worthington | LS004196 | 1 mg/mL |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D1756 | 1 μM |
| Dispase II | Sigma-Aldrich | D4693-1G | 4 mg/mL |
| Fetal bovine serum | Gibco | 16000-044 | 10% |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034-25G | 20 mM |
| High glucose DMEM | Hyclone | SH30022.01 | |
| IBMX | Sigma-Aldrich | I7018 | 0.5 mM |
| Incubator with orbital shaker | Shanghai longyue Instrument Eruipment Co.,Ltd. | LYZ-103B | |
| Insulin (cattle) | Sigma-Aldrich | 11070-73-8 | 1 μM |
| Isoflurane | RWD | R510-22-10 | |
| Krebs-Ringer's Solution | Pricella | PB180347 | protect from light |
| Microsurgical forceps | Beyotime | FS233 | |
| Microsurgical scissor | Beyotime | FS217 | |
| Oil Red O | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd | A600395-0050 | |
| PBS (Phosphate-buffered saline) | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd | B548117-0500 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 115-035-146 | 1:5,000 working concentration |
| Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 111-035-144 | 1:5,000 working concentration |
| Rosiglitazone | Sigma-Aldrich | R2408 | 1 μM |
| Standard forceps | Beyotime | FS225 | |
| Surgical scissor | Beyotime | FS001 |
References
- Akoumianakis, I., Antoniades, C. The interplay between adipose tissue and the cardiovascular system: is fat always bad. Cardiovascular Research. 113 (9), 999-1008 (2017).
- Huang, C. L., et al. Thoracic perivascular adipose tissue inhibits VSMC apoptosis and aortic aneurysm formation in mice via the secretome of browning adipocytes. Acta Pharmacologica Sinica. 44 (2), 345-355 (2023).
- Xia, N., Li, H. The role of perivascular adipose tissue in obesity-induced vascular dysfunction. British Journal of Pharmacology. 174 (20), 3425-3442 (2017).
- Brown, N. K., et al. Perivascular adipose tissue in vascular function and disease: a review of current research and animal models. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 34 (8), 1621-1630 (2014).
- Ferrero, R., Rainer, P., Deplancke, B. Toward a consensus view of mammalian adipocyte stem and progenitor cell heterogeneity. Trends in Cell Biology. 30 (12), 937-950 (2020).
- Angueira, A. R., et al. Defining the lineage of thermogenic perivascular adipose tissue. Nature Metabolism. 3 (4), 469-484 (2021).
- Boucher, J. M., et al. Rab27a regulates human perivascular adipose progenitor cell differentiation. Cardiovascular Drugs and Therapy. 32 (5), 519-530 (2018).
- Saxton, S. N., Withers, S. B., Heagerty, A. M. Emerging roles of sympathetic nerves and inflammation in perivascular adipose tissue. Cardiovascular Drugs and Therapy. 33 (2), 245-259 (2019).
- Ferroni, L., De Francesco, F., Pinton, P., Gardin, C., Zavan, B. Methods to isolate adipose tissue-derived stem cells. Methods in Cell Biology. 171, 215-228 (2022).
- Senesi, L., et al. Mechanical and enzymatic procedures to isolate the stromal vascular fraction from adipose tissue: preliminary results. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 7, 88 (2019).
- Andia, I., Maffulli, N., Burgos-Alonso, N. Stromal vascular fraction technologies and clinical applications. Expert Opinion on Biological Therapy. 19 (12), 1289-1305 (2019).
- Suh, A., et al. Adipose-derived cellular and cell-derived regenerative therapies in dermatology and aesthetic rejuvenation. Ageing Research Reviews. 54, 100933 (2019).
- Bellei, B., Migliano, E., Picardo, M. Therapeutic potential of adipose tissue-derivatives in modern dermatology. Experimental Dermatology. 31 (12), 1837-1852 (2022).
- Kraus, N. A., et al. Quantitative assessment of adipocyte differentiation in cell culture. Adipocyte. 5 (4), 351-358 (2016).
- Figueroa, A. M., Stolzenbach, F., Tapia, P., Cortés, V. Differentiation and imaging of brown adipocytes from the stromal vascular fraction of interscapular adipose tissue from newborn mice. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (192), (2023).
- Ma, Y., et al. Methotrexate improves perivascular adipose tissue/endothelial dysfunction via activation of AMPK/eNOS pathway. Molecular Medicine Reports. 15 (4), 2353-2359 (2017).
- Li, X., Ballantyne, L. L., Yu, Y., Funk, C. D. Perivascular adipose tissue-derived extracellular vesicle miR-221-3p mediates vascular remodeling. FASEB Journal. 33 (11), 12704-12722 (2019).
- Ruan, C. C., et al. Perivascular adipose tissue-derived complement 3 is required for adventitial fibroblast functions and adventitial remodeling in deoxycorticosterone acetate-salt hypertensive rats. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 30 (12), 2568-2574 (2010).
- Adachi, Y., et al. Beiging of perivascular adipose tissue regulates its inflammation and vascular remodeling. Nature Communications. 13 (1), 5117 (2022).
- Ye, M., et al. Developmental and functional characteristics of the thoracic aorta perivascular adipocyte. Cellular and Molecular Life Sciences. 76 (4), 777-789 (2019).
- Stanek, A., Brożyna-Tkaczyk, K., Myśliński, W. The role of obesity-induced perivascular adipose tissue (PVAT) dysfunction in vascular homeostasis. Nutrients. 13 (11), 3843 (2021).
- Queiroz, M., Sena, C. M. Perivascular adipose tissue in age-related vascular disease. Ageing Research Reviews. 59, 101040 (2020).
- Fitzgibbons, T. P., et al. Similarity of mouse perivascular and brown adipose tissues and their resistance to diet-induced inflammation. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 301 (4), H1425-H1437 (2011).
- Chang, L., et al. Loss of perivascular adipose tissue on peroxisome proliferator-activated receptor-γ deletion in smooth muscle cells impairs intravascular thermoregulation and enhances atherosclerosis. Circulation. 126 (9), 1067-1078 (2012).
- Piacentini, L., et al. Genome-wide expression profiling unveils autoimmune response signatures in the perivascular adipose tissue of abdominal aortic aneurysm. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 39 (2), 237-249 (2019).
- Wang, Z., et al. RNA sequencing reveals perivascular adipose tissue plasticity in response to angiotensin II. Pharmacological Research. 178, 106183 (2022).
- Shi, K., et al. Ascending aortic perivascular adipose tissue inflammation associates with aortic valve disease. Journal of Cardiology. 80 (3), 240-248 (2022).
- Fu, M., et al. Neural crest cells differentiate into brown adipocytes and contribute to periaortic arch adipose tissue formation. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 39 (8), 1629-1644 (2019).
- Gil-Ortega, M., Somoza, B., Huang, Y., Gollasch, M., Fernández-Alfonso, M. S. Regional differences in perivascular adipose tissue impacting vascular homeostasis. Trends in Endocrinology & Metabolism. 26 (7), 367-375 (2015).
- Bar, A., et al. In vivo magnetic resonance imaging-based detection of heterogeneous endothelial response in thoracic and abdominal aorta to short-term high-fat diet ascribed to differences in perivascular adipose tissue in mice. Journal of the American Heart Association. 9 (21), e016929 (2020).
Cite This Article
Liang, M., Huang, Y., Jiang, Y., Hu, Y., Cai, Z., He, B. Isolation, Culture, and Adipogenic Induction of Stromal Vascular Fraction-derived Preadipocytes from Mouse Periaortic Adipose Tissue. J. Vis. Exp. (197), e65703, doi:10.3791/65703 (2023).