Summary
यहां, हम माउस पेरिओर्टिक एडीपोज ऊतक से स्ट्रोमल संवहनी अंश-व्युत्पन्न प्रीडिपोसाइट्स के अलगाव, संस्कृति और एडिपोजेनिक प्रेरण का वर्णन करते हैं, जिससे पेरिवास्कुलर वसा ऊतक समारोह और संवहनी कोशिकाओं के साथ इसके संबंध के अध्ययन की अनुमति मिलती है।
Abstract
पेरिवास्कुलर वसा ऊतक (पीवीएटी) एक वसा ऊतक डिपो है जो रक्त वाहिकाओं को घेरता है और सफेद, बेज और भूरे रंग के एडिपोसाइट्स के फेनोटाइप को प्रदर्शित करता है। हाल की खोजों ने संवहनी होमियोस्टैसिस को विनियमित करने और हृदय रोगों के रोगजनन में भाग लेने में पीवीएटी की केंद्रीय भूमिका पर प्रकाश डाला है। भविष्य के उपचारों के विकास के लिए पीवीएटी गुणों और विनियमन की व्यापक समझ का बहुत महत्व है। पेरिओर्टिक एडिपोसाइट्स की प्राथमिक संस्कृतियां पीवीएटी फ़ंक्शन और पेरिओर्टिक एडिपोसाइट्स और संवहनी कोशिकाओं के बीच क्रॉसटॉक का अध्ययन करने के लिए मूल्यवान हैं। यह पेपर माउस पेरिओर्टिक एडीपोज ऊतक से स्ट्रोमल संवहनी अंश-व्युत्पन्न प्रीडिपोसाइट्स के अलगाव, संस्कृति और एडिपोजेनिक प्रेरण के लिए एक किफायती और व्यवहार्य प्रोटोकॉल प्रस्तुत करता है, जो विट्रो में एडिपोजेनेसिस या लिपोजेनेसिस मॉडलिंग के लिए उपयोगी हो सकता है। प्रोटोकॉल युवा चूहों से पेरिओर्टिक एडिपोसाइट्स की खेती के लिए ऊतक प्रसंस्करण और सेल भेदभाव को रेखांकित करता है। यह प्रोटोकॉल पीवीएटी फ़ंक्शन की जांच के लिए बेंच साइड पर तकनीकी आधारशिला प्रदान करेगा।
Introduction
पेरिवास्कुलर वसा ऊतक (पीवीएटी), एक पेरिवस्कुलर संरचना जो परिपक्व एडिपोसाइट्स और स्ट्रोमल संवहनी अंश (एसवीएफ) के मिश्रण से बनी होती है, माना जाता है कि यह अपने स्राव पैराक्रिनेली1 के माध्यम से आसन्न पोत की दीवार के साथ बातचीत करती है। संवहनी होमियोस्टैसिस के एक महत्वपूर्ण नियामक के रूप में, पीवीएटी डिसफंक्शन को कार्डियोवैस्कुलर बीमारियों 2,3,4 के रोगजनन में फंसाया गया है। एडिपोसाइट्स ऊतक के एसवीएफ में एंडोथेलियल कोशिकाओं, प्रतिरक्षा कोशिकाओं, मेसोथेलियम कोशिकाओं, न्यूरोनल कोशिकाओं और वसा स्टेम और पूर्वज कोशिकाओं (एएसपीसी) 5,6 सहित कई अपेक्षित सेल आबादी शामिल हैं। यह सर्वविदित है कि वसा ऊतक के एसवीएफ में रहने वाले एएसपीसी परिपक्व एडिपोसाइट्स5 को जन्म दे सकते हैं। एसवीएफ को पीवीएटी में परिपक्व एडिपोसाइट्स का एक महत्वपूर्ण स्रोत माना जाता है। कई अध्ययनों से पता चला है कि पीवीएटी-एसवीएफ विशिष्टप्रेरण स्थितियों 6,7,8 के तहत परिपक्व एडिपोसाइट्स में अंतर कर सकता है।
वर्तमान में, वसा ऊतक से एसवीएफ को अलग करने के लिए दो अलगाव प्रणालियां हैं, एक एंजाइमेटिक पाचन है और दूसरा गैर-एंजाइमेटिक9 है। एंजाइमेटिक तरीकों से आमतौर पर न्यूक्लियेटेडपूर्वज कोशिकाओं की उच्च उपज होती है। आज तक, घाव भरने, मूत्रजननांगी और हृदय रोगों में संवहनी पुनर्जनन और नियोवैस्कुलराइजेशन को बढ़ावा देने में एसवीएफ के लाभों को व्यापक रूपसे प्रदर्शित किया गया है, विशेष रूप से त्वचाविज्ञान और प्लास्टिक सर्जरी12,13 में। हालांकि, पीवीएटी-व्युत्पन्न एसवीएफ की नैदानिक अनुप्रयोग संभावनाओं का अच्छी तरह से पता नहीं लगाया गया है, जिसे पीवीएटी से एसवीएफ के अलगाव के लिए एक मानकीकृत विधि की कमी के लिए जिम्मेदार ठहराया जा सकता है। इस प्रोटोकॉल का उद्देश्य वक्ष महाधमनी के आसपास माउस पीवीएटी से एसवीएफ-व्युत्पन्न प्रीएडिपोसाइट्स के अलगाव, संस्कृति और एडिपोजेनिक प्रेरण के लिए एक मानकीकृत दृष्टिकोण स्थापित करना है, जिससे पीवीएटी फ़ंक्शन की आगे की जांच को सक्षम किया जा सके। यह प्रोटोकॉल युवा चूहों से प्राप्त पेरिओर्टिक एडिपोसाइट्स के संवर्धन के लिए ऊतक प्रसंस्करण और सेल भेदभाव तकनीकों का अनुकूलन करता है।
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Protocol
पशु प्रोटोकॉल शंघाई जिओ टोंग यूनिवर्सिटी स्कूल ऑफ मेडिसिन (अनुमोदन संख्या: KS23010) से संबद्ध शंघाई चेस्ट अस्पताल में संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित किए गए थे और प्रासंगिक नैतिक नियमों के अनुपालन में थे। इस प्रयोग के लिए 4-8 सप्ताह की आयु के पुरुष और महिला C57BL/6 चूहों को प्राथमिकता दी जानी चाहिए।
1. सर्जिकल उपकरण, बफर और संस्कृति मीडिया की तैयारी
- 30 मिनट के लिए 121 डिग्री सेल्सियस पर आटोक्लेव सर्जिकल उपकरण (जैसे, सर्जिकल कैंची और मानक बल)। 75% अल्कोहल के साथ माइक्रोसर्जिकल उपकरणों को कीटाणुरहित करें।
- बाँझ फॉस्फेट-बफर्ड सेलाइन (पीबीएस) तैयार करें जो 1% वी / वी पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन और 10% वी / वी पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन के साथ पूरक पीबीएस के एक और 10 एमएल पूरक हैं।
नोट: निम्नलिखित अनुभागों में, यदि विशेष रूप से उल्लेख नहीं किया गया है, तो पीबीएस नियमित बाँझ पीबीएस को संदर्भित करता है। - क्रेब्स रिंगर एचईपीईएस बीएसए बफर तैयार करें: 1% गोजातीय सीरम एल्बुमिन (बीएसए), क्रेब्स रिंगर समाधान में 20 एमएम एचईपीईएस घुल गया।
- ताजा पाचन समाधान तैयार करें: टाइप 1 कोलेजनेस (1 मिलीग्राम / एमएल) और डिस्पैस II (4 मिलीग्राम / एमएल) क्रेब्स रिंगर एचईपीईएस बीएसए बफर में घुल गया। 0.2 μm फ़िल्टर का उपयोग कर के समाधान को निष्फल करें।
- एक कोलेजन-लेपित 12-वेल प्लेट तैयार करें।
- बाँझ विआयनीकृत पानी के साथ कोलेजन समाधान (1 मिलीग्राम / एमएल) को 40 μg / mL की एकाग्रता तक पतला करें। 6-10 μg /cm2 की सांद्रता प्राप्त करने के लिए प्रत्येक कुएं की सतह पर पतला कोलेजन घोल का 1 मिलीलीटर जोड़ें। कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए कोटिंग को इनक्यूबेट करें।
- शेष घोल को निकालें और प्रत्येक को 1 एमएल पीबीएस के साथ 2 गुना अच्छी तरह से कुल्ला करें। प्लेट का तुरंत उपयोग करें, या प्लेट को द्वितीय श्रेणी के लामिनार प्रवाह हुड में हवा में सुखाएं और लेपित प्लेट को 2-8 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। भंडारण करते समय, पैराफिल्म के साथ लेपित प्लेटों को सील करें।
- कल्चर माध्यम तैयार करें: उच्च-ग्लूकोज डलबेकको-संशोधित ईगल्स मीडियम (डीएमईएम), 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस), 1% वी / वी पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन। 2 सप्ताह तक 4 डिग्री सेल्सियस पर रखें।
- लिपोजेनिक प्रेरण माध्यम तैयार करें: उच्च ग्लूकोज डीएमईएम, 10% एफबीएस, 1% वी / वी पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन, 1 एनएम ट्राइआयोडोथायरोनिन, 1 μM रोज़िग्लिटाज़ोन, 1 μM इंसुलिन, 0.5 mM 3-isobutyl-1-methylxanthine (IBMX), और 1 μM डेक्सामेथासोन। 2 सप्ताह तक 4 डिग्री सेल्सियस पर रखें।
- रखरखाव माध्यम तैयार करें: उच्च ग्लूकोज डीएमईएम, 10% एफबीएस, 1% वी / वी पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन, 1 एनएम ट्राइआयोडोथायरोनिन, 1 μM रोज़िग्लिटाज़ोन, और 1 μM इंसुलिन। 2 सप्ताह तक 4 डिग्री सेल्सियस पर रखें।
2. पेरिवास्कुलर वसा ऊतक (पीवीएटी) का विच्छेदन और अलगाव।
- 2% आइसोफ्लुरेन एनेस्थीसिया के तहत या कार्बन डाइऑक्साइड ओवरडोज के साथ गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था द्वारा माउस को इच्छामृत्यु करें। त्वचा कीटाणुशोधन के लिए 75% अल्कोहल के साथ स्प्रे करें।
- माउस को लापरवाह स्थिति में रखें (ऊपर की ओर मुंह करके)।
- त्वचा को उठाएं, एक छोटा चीरा लगाएं, और श्रोणि से गर्दन तक उदर मध्य रेखा के साथ सर्जिकल कैंची के साथ त्वचा और पेट की मांसपेशियों को स्पष्ट रूप से अलग करें। मध्य रेखा के दोनों किनारों के साथ डायाफ्राम और पसलियों को काटकर हृदय और फेफड़ों को उजागर करें।
- जिगर, प्लीहा, आंत्र और गुर्दे को ध्यान से हटा दें। आंतों की दीवार काटने से बचें।
- फेफड़ों और अन्नप्रणाली को हटा दें।
- धीरे से एक हाथ में बल के साथ दिल को उठाएं और दूसरे हाथ में सर्जिकल कैंची के साथ महाधमनी को रीढ़ से अलग करें। फिर, हृदय और महाधमनी को पीबीएस के साथ 60 मिमी पेट्री डिश में रखें जिसमें 1% वी / वी पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन होता है।
- अल्कोहल से माइक्रोसर्जिकल फोर्सऔर माइक्रोसर्जिकल कैंची निकालें और अतिरिक्त शराब को हटाने के लिए पीबीएस के 25 एमएल में कुल्ला करें। एक स्टीरियो माइक्रोस्कोप के तहत, हृदय और महाधमनी से थाइमस और अन्य ऊतक को हटा दें, फिर हृदय को हटा दें, महाधमनी को पीवीएटी के साथ छोड़ दें।
- पीवीएटी के साथ महाधमनी को पीबीएस के साथ एक साफ 60 मिमी पेट्री डिश में स्थानांतरित करें जिसमें 1% वी / वी पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन होता है।
- पीवीएटी को स्ट्रिप करने के लिए माइक्रोसर्जिकल फोर्स का उपयोग करें, जिसमें एक जोड़ी बल महाधमनी को ठीक करता है और दूसरा वसा ऊतक को खींचता है। पेरिवास्कुलर वसा ऊतक को नुकसान को कम करते हुए जितना संभव हो सके वाहिका ऊतक को हटा दें।
- वक्ष महाधमनी के आसपास के पीवीएटी को 2 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में इकट्ठा करें जिसमें उच्च ग्लूकोज डीएमईएम होता है जो बर्फ पर रखे 1% वी / वी पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन के साथ पूरक होता है।
3. स्ट्रोमल संवहनी अंश (एसवीएफ) का अलगाव।
- एकत्रित ऊतकों को पीबीएस के साथ क्रमिक रूप से कुल्ला करें जिसमें 10% वी / वी पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन और पीबीएस युक्त 1% वी / वी पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन होता है।
नोट: इस कदम के बाद, सभी प्रयोगों को कक्षा II लामिनार प्रवाह हुड में बाँझ परिस्थितियों में किया जाना चाहिए। - ऊतकों को एक बाँझ 60 मिमी पेट्री डिश में स्थानांतरित करें, पाचन समाधान के 200 μL जोड़ें, और बाँझ कैंची का उपयोग करके उन्हें 1 मिमी3 टुकड़ों में कीमा करें।
- प्लास्टिक पिपेट टिप का उपयोग करके मिश्रण को 15 एमएल सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें, अंत को बाँझ कैंची कट द्वारा चौड़ा किया जाए, और पाचन प्रतिक्रिया शुरू करने के लिए 6 एमएल पाचन समाधान जोड़ें।
नोट: एक पाचन प्रतिक्रिया (पाचन समाधान का 3 मिलीलीटर) छह चूहों से पीवीएटी डिपो के लिए पर्याप्त है। - 30-45 मिनट के लिए ऑर्बिटल शेकर (प्रभावी मिश्रण के लिए 150 आरपीएम आवृत्ति) के साथ इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर ऊतकों को इनक्यूबेट करें। ट्यूबों को क्षैतिज रूप से हिलाने के लिए ट्यूबों को एक रैक पर सपाट बांधें। हर 5-10 मिनट में 10 सेकंड के लिए हाथ से जोर से ऊपर और नीचे हिलाएं।
नोट: पाचन को बंद किया जा सकता है जब एक सजातीय, पीले रंग का पाचन तरल पदार्थ देखा जाता है जिसमें कोई ऊतक टुकड़े नहीं बचे होते हैं। - पचे हुए ऊतकों को 70 μm सेल छन्नी के माध्यम से 50 मिलीलीटर सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में छान लें। सेल उपज को अधिकतम करने और पाचन को रोकने के लिए कल्चर माध्यम की समान मात्रा के साथ सेल छन्नी को कुल्ला करें।
- छानना को एक नए 15 एमएल सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें और 10 मिनट के लिए 1,800 × ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज करें। सुपरनैटेंट को छोड़ने के लिए ट्यूब को उलटा करें और पीबीएस के 5 एमएल में छर्रों को फिर से निलंबित करें। 5 मिनट के लिए 1,800 × ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज।
- ट्यूब को उलटकर सतह पर तैरनेवाला को छोड़ दें और उचित मात्रा में कल्चर माध्यम में छर्रों को फिर से निलंबित करें।
नोट: प्रत्येक छह चूहों से एकत्र किए गए सेल छर्रों को 1 एमएल कल्चर माध्यम में फिर से निलंबित किया जाता है और 12-वेल प्लेट के एक कुएं में बीज दिया जाता है। - कोशिकाओं को कोलेजन-लेपित 12-वेल प्लेट में बीज दें और रात भर 5% सीओ2 के साथ आर्द्र वातावरण में 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
- अगले दिन, कल्चर माध्यम को एस्पिरेट करें, सेल मलबे और लाल रक्त कोशिकाओं को हटाने के लिए 1% वी / वी पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन युक्त प्रीवार्म्ड (37 डिग्री सेल्सियस) पीबीएस के साथ कोशिकाओं को धोएं, और प्रत्येक अच्छी तरह से 1 एमएल ताजा संस्कृति माध्यम जोड़ें।
4. पेरिओर्टिक वसा ऊतक से एसवीएफ-व्युत्पन्न प्रीडिपोसाइट्स का एडिपोजेनिक प्रेरण।
- हर दूसरे दिन संस्कृति माध्यम को बदलें जब तक कि कोशिकाएं ~ 60-70% संगम तक न पहुंच जाएं।
नोट: आमतौर पर कोशिकाओं को 60-70% संगम तक पहुंचने में 3-4 दिन लगते हैं। - जब कोशिकाएं 60-70% संगम तक पहुंच जाती हैं, तो संस्कृति माध्यम को एस्पिरेट करें और इसे ब्राउन एडिपोजेनिक प्रेरण माध्यम से बदलें। विभेदन के दिन 0 के रूप में एडिपोजेनिक भेदभाव के प्रेरण के दिन पर विचार करें।
- 72 घंटे (भेदभाव के दिन 3) के बाद, रखरखाव माध्यम के साथ माध्यम को ताज़ा करें। जब तक कोशिकाओं का उपयोग प्रयोगों के लिए नहीं किया जाता है, तब तक हर 2 दिनों में रखरखाव माध्यम बदलें।
- एक उपयुक्त तरीके से एडिपोजेनिक कोशिकाओं का विश्लेषण करें, जैसे कि ऑयल रेड ओ स्टेनिंग14 और वेस्टर्न ब्लॉटिंग15।
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Representative Results
ऊपर वर्णित इस प्रोटोकॉल का उपयोग करते हुए, हमने माउस थोरैसिक महाधमनी (चित्रा 1 ए-डी) के आसपास पीवीएटी को सावधानीपूर्वक अलग किया। बाँझ कैंची (चित्रा 1 ई, एफ) का उपयोग करके पीवीएटी को छोटे टुकड़ों में धोने और मिसने के बाद, ऊतक के टुकड़ों को टाइप 1 कोलेजनेस (1 मिलीग्राम / एमएल) और डिस्पेस II (4 मिलीग्राम / एमएल) युक्त पाचन समाधान में पचाया गया और 30-45 मिनट के लिए शेकर पर 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट किया गया (चित्रा 1 जी)। पचे हुए ऊतकों को 70 μm सेल छन्नी के माध्यम से 50 मिलीलीटर सेंट्रीफ्यूज ट्यूब (चित्रा 1H) में तनावपूर्ण किया गया था। सेंट्रीफ्यूजेशन के बाद सेल छर्रों को एकत्र किया गया था (चित्रा 1 आई)।
एसवीएफ-व्युत्पन्न प्रीडिपोसाइट्स की एडिपोजेनिक क्षमता की पुष्टि करने के लिए, हमने 1 एनएम ट्राइआयोडोथायरोनिन, 1 μM रोज़िग्लिटाज़ोन, 1 μM इंसुलिन, 0.5 mM IBMX, और 1 μM डेक्सामेथासोन युक्त ब्राउन एडिपोजेनिक प्रेरण माध्यम के साथ कोशिकाओं को प्रेरित किया। ब्राउन एडिपोजेनिक प्रेरण के 7-10 दिनों के बाद परिपक्व एडिपोसाइट्स देखे गए, जो ऑयल रेड ओ-सना हुआ लिपिड समृद्ध रिक्तिका (चित्रा 2 ए) के गठन की विशेषता है। पश्चिमी सोख्ता विश्लेषण ने एडिपोसाइट्स-विशिष्ट प्रोटीन के बढ़े हुए अभिव्यक्ति स्तर को दिखाया, जिसमें एडिपोनेक्टिन, फैबपी 4, पीजीसी 1, पीपार, यूसीपी 1, और माइटोकॉन्ड्रियल प्रोटीन कॉक्स IV (चित्रा 2 बी, सी) शामिल हैं। इन आंकड़ों से पता चलता है कि माउस पेरिओर्टिक एडीपोज ऊतक से एसवीएफ-व्युत्पन्न प्रीडिपोसाइट्स मजबूत एडिपोजेनिक क्षमता प्रदर्शित करते हैं।
चित्र 1: माउस पेरीओर्टिक वसा ऊतक से स्ट्रोमल संवहनी अंश का अलगाव । (ए) हृदय और महाधमनी को सर्जिकल बल और कैंची का उपयोग करके सावधानीपूर्वक विच्छेदित किया जाता है। सफेद और पीले तीर क्रमशः हृदय और महाधमनी का संकेत देते हैं। (बी) वक्ष महाधमनी के आसपास के पीवीएटी को बल का उपयोग करके सावधानीपूर्वक हटा दिया जाता है। (सी) वक्ष महाधमनी के आसपास पीवीएटी को हटाने के बाद महाधमनी छोड़ दी गई। (डी) पीवीएटी को 2 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में एकत्र किया जाता है जिसमें 1% वी / वी पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन के साथ उच्च ग्लूकोज डीएमईएम होता है। (ई) पीवीएटी को पीबीएस के साथ क्रमिक रूप से धोया जाता है जिसमें 10% वी / वी पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन और पीबीएस होता है जिसमें 1% वी / वी पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन होता है। (एफ) बाँझ कैंची का उपयोग करके पीवीएटी को 1 मिमी3 टुकड़ों में जोड़ना। (छ) कीमा युक्त पीवीएटी को 15 मिलीलीटर सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करना जिसमें 6 मिलीलीटर पाचन घोल होता है, और 150 आरपीएम पर झटकों के साथ 30-45 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर ऊतकों को इनक्यूबेट करना होता है। (एच) पाचन को रोकें और निलंबन को 70 μm सेल स्ट्रेनर के माध्यम से 50 एमएल सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में फ़िल्टर करें। (i) 10 मिनट के लिए 1,800 × ग्राम पर छानना सेंट्रीफ्यूज; एसवीएफ को अलग-थलग कर दिया गया है। संक्षेप: पीवीएटी = पेरिवास्कुलर वसा ऊतक; एसवीएफ = स्ट्रोमल संवहनी अंश। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 2: माउस पेरिओर्टिक एडीपोज ऊतक से स्ट्रोमल संवहनी अंश का एडिपोजेनिक भेदभाव। (ए) दिन 8 पर पेरिओर्टिक प्रीएडिपोसाइट्स से विभेदित प्राथमिक एडिपोसाइट्स के प्रकाश माइक्रोस्कोप और ऑयल रेड ओ धुंधलापन की प्रतिनिधि छवियां। स्केल बार = 200 μm. (B,C) दिन 8 पर पेरिओर्टिक प्रीडिपोसाइट्स से विभेदित प्राथमिक एडिपोसाइट्स के लिए एडिपोनेक्टिन, फैब4, पीजीसी 1ए, पीपार, कॉक्स IV और यूसीपी 1 के प्रोटीन स्तरों का पश्चिमी सोख्ता विश्लेषण। दो समूहों के बीच महत्वपूर्ण अंतर की गणना करने के लिए अप्रकाशित दो-पूंछ वाले छात्र के टी-टेस्ट का उपयोग किया गया था। मान SEM ± माध्य हैं. कृपया इस आंकड़े का बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
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Discussion
हम माउस पेरिओर्टिक एडीपोज ऊतक से एसवीएफ-व्युत्पन्न प्रीएडिपोसाइट्स के अलगाव और एडिपोजेनिक प्रेरण के लिए एक व्यावहारिक और व्यवहार्य दृष्टिकोण का प्रस्ताव करते हैं। इस प्रोटोकॉल के फायदे यह है कि यह सरल और किफायती है। सफल अलगाव के लिए चूहों की पर्याप्त संख्या महत्वपूर्ण है, क्योंकि अपर्याप्त ऊतक के परिणामस्वरूप कम एसवीएफ घनत्व और खराब विकास स्थिति हो सकती है, जो अंततः लिपोजेनिक दक्षता को प्रभावित करती है। इसके अतिरिक्त, माउस की उम्र पर विचार करने के लिए एक महत्वपूर्ण कारक है क्योंकि एसवीएफ की एडिपोजेनिक क्षमता उम्र के साथ कम हो जाती है। वाहिका के संदूषण को कम करते हुए पीवीएटी का तेजी से और सावधानीपूर्वक पृथक्करण महत्वपूर्ण है। पाचन समाधान भी एक प्रमुख घटक है क्योंकि टाइप 1 कोलेजनेस में डिस्पेस II के अलावा पाचन दर और कोशिकाओं की उपज में सुधार हो सकता है। ओवरडाइजेशन से बचने के लिए पाचन प्रक्रिया पर पूरा ध्यान देना महत्वपूर्ण है क्योंकि यह संभावित रूप से सेल व्यवहार्यता को प्रभावित कर सकता है। बाँझ तकनीकों का पालन करना और प्रोटोकॉल के दौरान उचित संस्कृति की स्थिति बनाए रखना आवश्यक है।
पीवीएटी गुणों और कार्यों का अध्ययन करने के लिए पेरिओर्टिक एडिपोसाइट्स की प्राथमिक संस्कृतियां मूल्यवान हैं। आनुवंशिक रूप से संशोधित चूहों के पेरिओर्टिक वसा ऊतक से एसवीएफ-व्युत्पन्न प्रीडिपोसाइट्स का अलगाव और एडिपोजेनिक प्रेरण विट्रो में पीवीएटी भेदभाव और एडिपोजेनेसिस के महत्वपूर्ण नियामक की खोज के लिए एक मंच प्रदान करता है। पीवीएटी हाइड्रोजन पेरोक्साइड, एडिपोनेक्टिन, एंजियोटेंसिन 1-7, मिथाइल पामिटेट, हाइड्रोजन सल्फाइड, नाइट्रिक ऑक्साइड और लेप्टिन3 जैसे वासोएक्टिव अणुओं को उत्पन्न करने के माध्यम से वाहिकासंकीर्णन और संवहनी रीमॉडेलिंग का एक मॉड्यूलेटर है। यह प्रस्तुत विधि पेरिओर्टिक एडिपोसाइट्स और एंडोथेलियल कोशिकाओं 16, संवहनी चिकनी मांसपेशी कोशिकाओं (वीएसएमसी) 17, एडवेंटियल फाइब्रोब्लास्ट18, या मैक्रोफेज19 के बीच क्रॉसस्टॉक के आगे के अध्ययन की अनुमति देती है, जो उच्च रक्तचाप, एथेरोस्क्लेरोसिस, स्टेनोसिस और एन्यूरिज्म20,21,22 जैसे हृदय रोगों के रोगजनन में पीवीएटी की केंद्रीय भूमिकाओं में अंतर्दृष्टि प्रदान करती है।
इसके अलावा, प्रीडिपोसाइट्स का अलगाव और एडिपोजेनिक प्रेरण पीवीएटी वंश और पीवीएटी विषमता का अध्ययन करने के आधार हैं। पीवीएटी विषम अंतर-और इंट्रावस्कुलर बेड हैं, जो अलग-अलग ट्रांसक्रिप्शनल प्रोफाइल के रूप में प्रकट होते हैं, जो अलग-अलग शारीरिक और पैथोलॉजिकल कार्यात्मक विशेषताओंमें योगदान कर सकते हैं। चांग एट अल ने बताया कि वीएसएमसी-विशिष्ट पीपीएआर विलोपन वाले चूहों में महाधमनी और मेसेंटेरिक क्षेत्रों में पीवीएटी की कमी थी, यह दर्शाता है कि पीवीएटी स्थानीय संवहनी दीवार24 के साथ एक ही भ्रूण उत्पत्ति साझा कर सकता है। इस बात के प्रमाण हैं कि विभिन्न भ्रूण मूल से पीवीएटी में अलग-अलग फेनोटाइप25,26 हो सकते हैं। एक्टोडर्मल मूल की तंत्रिका शिखा कोशिकाओं से प्राप्त आरोही महाधमनी और महाधमनी आर्क (एए-पीवीएटी) के आसपास का पीवीएटी, ब्राउन एडीपोज ऊतक (बीएटी) 27 के समान रूपात्मक और ट्रांसक्रिप्टोमिक रूप से अधिक समान है। तदनुसार, तंत्रिका शिखा कोशिकाओं से प्राप्त पीवीएटी का एसवीएफ विट्रो28 में सफेद एडिपोसाइट्स की तुलना में भूरे रंग के एडिपोसाइट्स में अधिक आसानी से अंतर करता है। पेट की महाधमनी पीवीएटी, हालांकि, मुख्य रूप से एक सफेद वसा ऊतक जैसे फेनोटाइप29 को प्रदर्शित करती है। पीवीएटी का एक बीएटी जैसा फेनोटाइप या पीवीएटी का बीगिंग एंटीइंफ्लेमेटरी और एंटीपैथोलॉजिकल रीमॉडेलिंग प्रभावों से जुड़ा हुआ है, जो पीवीएटी फेनोटाइप मॉड्यूलेशन19,30 के माध्यम से कार्डियोवैस्कुलर बीमारी के उपचार पर प्रकाश डालता है। यह प्रोटोकॉल बेंच साइड पर तकनीकी आधारशिला प्रदान करेगा।
फिर भी, इस प्रोटोकॉल की कुछ सीमाएं हैं। पीवीएटी की सीमित उपलब्धता के कारण, पीवीएटी-एसवीएफ निकालने के लिए बड़ी संख्या में चूहों की आवश्यकता होती है। उन स्थितियों में जहां एसवीएफ की उच्च मांग है, प्रयोगात्मक प्रगति में तेजी लाने के लिए एक से अधिक व्यक्तियों को संलग्न करना आवश्यक हो सकता है। अमर प्रीडिपोसाइट्स की तुलना में, एसवीएफ-व्युत्पन्न प्रीडिपोसाइट्स को अतिरिक्त मानव और भौतिक संसाधनों की आवश्यकता होती है।
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Disclosures
लेखकों के पास घोषित करने के लिए वित्तीय या अन्यथा हितों का कोई टकराव नहीं है।
Acknowledgments
इस काम को चीन के राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (82130012 और 81830010) और शंघाई चेस्ट अस्पताल के बुनियादी अनुसंधान के लिए पोषण परियोजनाओं (अनुदान संख्या: 2022YNJCQ03) द्वारा समर्थित किया गया था।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2 μm syringe filters | PALL | 4612 | |
| 12-well plate | Labselect | 11210 | |
| 15 mL centrifuge tube | Labserv | 310109003 | |
| 3,3',5-triiodo-L-thyronine (T3) | Sigma-Aldrich | T-2877 | 1 nM |
| 50 mL centrifuge tube | Labselect | CT-002-50A | |
| anti-adiponectin | Abcam | ab22554 | 1:1,000 working concentration |
| anti-COX IV | CST | 4850 | 1:1,000 working concentration |
| anti-FABP4 | CST | 2120 | 1:1,000 working concentration |
| anti-PGC1α | Abcam | ab191838 | 1:1,000 working concentration |
| anti-PPARγ | Invitrogen | MA5-14889 | 1:1,000 working concentration |
| anti-UCP1 | Abcam | ab10983 | 1:1,000 working concentration |
| anti-α-Actinin | CST | 6487 | 1:1,000 working concentration |
| BSA | Beyotime | ST023-200g | 1% |
| C57BL/6 mice aged 4-8 weeks of both sexes | Shanghai Model Organisms Center, Inc. | ||
| Cell Strainer 70 µm, nylon | Falcon | 352350 | |
| Collagen from calf skin | Sigma-Aldrich | C8919 | |
| Collagenase, Type 1 | Worthington | LS004196 | 1 mg/mL |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D1756 | 1 μM |
| Dispase II | Sigma-Aldrich | D4693-1G | 4 mg/mL |
| Fetal bovine serum | Gibco | 16000-044 | 10% |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034-25G | 20 mM |
| High glucose DMEM | Hyclone | SH30022.01 | |
| IBMX | Sigma-Aldrich | I7018 | 0.5 mM |
| Incubator with orbital shaker | Shanghai longyue Instrument Eruipment Co.,Ltd. | LYZ-103B | |
| Insulin (cattle) | Sigma-Aldrich | 11070-73-8 | 1 μM |
| Isoflurane | RWD | R510-22-10 | |
| Krebs-Ringer's Solution | Pricella | PB180347 | protect from light |
| Microsurgical forceps | Beyotime | FS233 | |
| Microsurgical scissor | Beyotime | FS217 | |
| Oil Red O | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd | A600395-0050 | |
| PBS (Phosphate-buffered saline) | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd | B548117-0500 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 115-035-146 | 1:5,000 working concentration |
| Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 111-035-144 | 1:5,000 working concentration |
| Rosiglitazone | Sigma-Aldrich | R2408 | 1 μM |
| Standard forceps | Beyotime | FS225 | |
| Surgical scissor | Beyotime | FS001 |
References
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