Summary
Burada, perivasküler yağ dokusu fonksiyonunun ve vasküler hücrelerle ilişkisinin incelenmesine izin vererek, fare periaortik yağ dokusundan stromal vasküler fraksiyondan türetilen preadipositlerin izolasyonunu, kültürünü ve adipojenik indüksiyonunu açıklıyoruz.
Abstract
Perivasküler yağ dokusu (PVAT), kan damarlarını çevreleyen ve beyaz, bej ve kahverengi adipositlerin fenotiplerini sergileyen bir yağ dokusu deposudur. Son keşifler, PVAT'ın vasküler homeostazın düzenlenmesinde ve kardiyovasküler hastalıkların patogenezine katılmadaki merkezi rolüne ışık tutmuştur. PVAT özelliklerinin ve regülasyonunun kapsamlı bir şekilde anlaşılması, gelecekteki tedavilerin geliştirilmesi için büyük önem taşımaktadır. Periaortik adipositlerin primer kültürleri, PVAT fonksiyonunu ve periaortik adipositler ile vasküler hücreler arasındaki karışmayı incelemek için değerlidir. Bu makale, fare periaortik yağ dokusundan stromal vasküler fraksiyondan türetilen preadipositlerin izolasyonu, kültürü ve adipojenik indüksiyonu için ekonomik ve uygulanabilir bir protokol sunmaktadır ve bu, in vitro adipogenez veya lipogenezin modellenmesi için yararlı olabilir. Protokol, genç farelerden periaortik adipositlerin kültürlenmesi için doku işleme ve hücre farklılaşmasını ana hatlarıyla belirtir. Bu protokol, PVAT işlevinin araştırılması için tezgah tarafında teknolojik temel taşı sağlayacaktır.
Introduction
Olgun adipositler ve stromal vasküler fraksiyonun (SVF) karışımından oluşan perivasküler bir yapı olan perivasküler yağ dokusunun (PVAT), sekretomu aracılığıyla komşu damar duvarı ile parakrineal olarak etkileşime girdiğine inanılmaktadır1. Vasküler homeostazın kritik bir düzenleyicisi olarak, PVAT disfonksiyonu kardiyovasküler hastalıkların patogenezinde rol oynar 2,3,4. Adiposit dokusunun SVF'si, endotel hücreleri, bağışıklık hücreleri, mezotelyum hücreleri, nöronal hücreler ve adipoz kök ve progenitör hücreler (ASPC'ler) dahil olmak üzere birkaç beklenen hücre popülasyonundan oluşur5,6. Yağ dokusunun SVF'sinde bulunan ASPC'lerin olgun adipositlere yol açabileceği iyi bilinmektedir5. SVF'nin PVAT'ta kritik bir olgun adiposit kaynağı olduğu sonucuna varılmıştır. Birkaç çalışma, PVAT-SVF'nin belirli indüksiyon koşulları altında olgun adipositlere farklılaşabileceğini göstermiştir 6,7,8.
Şu anda, SVF'yi yağ dokusundan izole etmek için biri enzimatik sindirim ve diğeri enzimatik olmayan olmak üzere iki izolasyon sistemi vardır9. Enzimatik yöntemler tipik olarak daha yüksek çekirdekli progenitör hücre verimi ile sonuçlanır10. Bugüne kadar, SVF'nin yara iyileşmesi, ürogenital ve kardiyovasküler hastalıklarda vasküler rejenerasyonu ve neovaskülarizasyonu desteklemedeki faydaları, özellikle dermatoloji ve plastik cerrahide12,13 yaygın olarak gösterilmiştir11. Bununla birlikte, PVAT'tan türetilen SVF'nin klinik uygulama beklentileri iyi araştırılmamıştır, bu da SVF'nin PVAT'tan izolasyonu için standart bir yöntemin olmamasına bağlanabilir. Bu protokolün amacı, torasik aortu çevreleyen fare PVAT'ından SVF'den türetilen preadipositlerin izolasyonu, kültürü ve adipojenik indüksiyonu için standart bir yaklaşım oluşturmak ve PVAT fonksiyonunun daha fazla araştırılmasını sağlamaktır. Bu protokol, genç farelerden elde edilen periaortik adipositlerin kültürlenmesi için doku işleme ve hücre farklılaşma tekniklerini optimize eder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Hayvan protokolleri, Şanghay Jiao Tong Üniversitesi Tıp Fakültesi'ne bağlı Şanghay Göğüs Hastanesi'ndeki Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından onaylandı (onay numarası: KS23010) ve ilgili etik düzenlemelere uygundu. Bu deney için 4-8 haftalık erkek ve dişi C57BL/6 fareler tercih edilmelidir.
1. Cerrahi aletlerin, tamponların ve kültür ortamlarının hazırlanması
- Cerrahi aletler (örn. cerrahi makas ve standart forseps) 121 °C'de 30 dakika boyunca otoklavlayın. Mikrocerrahi aletleri% 75 alkol ile dezenfekte edin.
- % 1 v / v penisilin-streptomisin ve% 10 v / v penisilin-streptomisin ile desteklenmiş 10 mL PBS ile desteklenmiş steril fosfat tamponlu salin (PBS) hazırlayın.
NOT: Aşağıdaki bölümlerde, özellikle belirtilmemişse, PBS, normal steril PBS'yi ifade eder. - Krebs Ringer HEPES BSA tamponunu hazırlayın:% 1 sığır serum albümini (BSA), Krebs Ringer çözeltisinde çözülmüş 20 mM HEPES.
- Taze sindirim çözeltisi hazırlayın: tip 1 kollajenaz (1 mg / mL) ve dispas II (4 mg / mL) Krebs Ringer HEPES BSA tamponunda çözülür. Çözeltiyi 0,2 μm'lik bir filtre kullanarak sterilize edin.
- Kollajen kaplı 12 oyuklu bir plaka hazırlayın.
- Kollajen çözeltisini (1 mg/mL) steril deiyonize su ile 40 μg/mL konsantrasyonuna seyreltin. 6-10 μg/cm2'lik bir konsantrasyon elde etmek için her bir oyuğun yüzeyine 1 mL seyreltilmiş kollajen çözeltisi ekleyin. Kaplamayı oda sıcaklığında 1 saat inkübe edin.
- Kalan çözeltiyi çıkarın ve her bir kuyuyu 2 kez 1 mL PBS ile durulayın. Plakayı hemen kullanın veya plakayı sınıf II laminer akış başlığında havayla kurutun ve kaplanmış plakayı 2-8 °C'de saklayın. Saklarken, kaplanmış plakaları parafilm ile kapatın.
- Kültür ortamı hazırlayın: yüksek glikozlu Dulbecco's-Modifiye Eagles Medium (DMEM),% 10 fetal sığır serumu (FBS),% 1 v / v penisilin-streptomisin. 4 °C'de 2 haftaya kadar saklayın.
- Lipitojenik indüksiyon ortamı hazırlayın: yüksek glikozlu DMEM, %10 FBS, %1 v/v penisilin-streptomisin, 1 nM triiyodotironin, 1 μM rosiglitazon, 1 μM insülin, 0.5 mM 3-izobütil-1-metilksantin (IBMX) ve 1 μM deksametazon. 4 °C'de 2 haftaya kadar saklayın.
- Bakım ortamı hazırlayın: yüksek glikozlu DMEM, %10 FBS, %1 v/v penisilin-streptomisin, 1 nM triiyodotironin, 1 μM rosiglitazon ve 1 μM insülin. 4 °C'de 2 haftaya kadar saklayın.
2. Perivasküler yağ dokusunun diseksiyonu ve izolasyonu (PVAT)
- Fareyi% 2 izofluran anestezisi altında servikal çıkık veya aşırı dozda karbondioksit ile ötenazi yapın. Cilt dezenfeksiyonu için% 75 alkol püskürtün.
- Fareyi sırtüstü pozisyonda (yukarı bakacak şekilde) yerleştirin.
- Cildi kaldırın, küçük bir kesi yapın ve ventral orta hat boyunca pelvisten boyuna kadar cerrahi makasla cildi ve karın kaslarını künt bir şekilde ayırın. Orta hattın her iki tarafındaki diyaframı ve kaburgaları keserek kalbi ve akciğerleri ortaya çıkarın.
- Karaciğeri, dalak, bağırsakları ve böbreği dikkatlice çıkarın. Bağırsak duvarını kesmekten kaçının.
- Akciğerleri ve yemek borusunu çıkarın.
- Bir elinizde forseps ile kalbi nazikçe kaldırın ve diğer elinizde cerrahi makasla aort damarını omurgadan ayırın. Ardından, kalbi ve aortu %1 v/v penisilin-streptomisin içeren PBS'li 60 mm'lik bir Petri kabına yerleştirin.
- Mikrocerrahi forsepsleri ve mikrocerrahi makasları alkolden çıkarın ve fazla alkolü çıkarmak için 25 mL PBS'de durulayın. Stereo mikroskop altında, timus ve diğer dokuları kalpten ve aorttan çıkarın, ardından kalbi çıkarın ve aortu PVAT'lerle bırakın.
- PVAT'lı aortu %1 v/v penisilin-streptomisin içeren PBS'li 60 mm'lik temiz bir Petri kabına aktarın.
- PVAT'ları soymak için mikrocerrahi forseps kullanın, bir çift forseps aortu sabitler ve diğeri yağ dokusunu çeker. Perivasküler yağ dokusuna verilen zararı en aza indirirken damar dokusunu mümkün olduğunca çıkarın.
- Torasik aortu çevreleyen PVAT'ı, buz üzerine yerleştirilmiş %1 v/v penisilin-streptomisin ile desteklenmiş yüksek glikozlu DMEM içeren 2 mL'lik mikrosantrifüj tüpüne toplayın.
3. Stromal vasküler fraksiyonun (SVF) izolasyonu
- Toplanan dokular %10 v/v penisilin-streptomisin içeren PBS ve %1 v/v penisilin-streptomisin içeren PBS ile sırayla durulayın.
NOT: Bu adımdan itibaren, tüm deneyler steril koşullar altında sınıf II laminer akış başlığında gerçekleştirilmelidir. - Dokuları steril 60 mm'lik bir Petri kabına aktarın, 200 μL sindirim solüsyonu ekleyin ve steril makas kullanarak 1 mm3 parçaya kıyın.
- Karışımı plastik bir pipet ucu kullanarak 15 mL'lik bir santrifüj tüpüne aktarın, ucu steril bir makas kesimi ile genişletildi ve sindirim reaksiyonunu başlatmak için 6 mL sindirim solüsyonu ekleyin.
NOT: Altı fareden PVAT depoları için bir sindirim reaksiyonu (3 mL sindirim solüsyonu) yeterlidir. - Dokuları 37 °C'de orbital çalkalayıcı (etkili karıştırma için 150 rpm frekans) ile bir inkübatörde 30-45 dakika inkübe edin. Tüplerin yatay olarak sallanmasını sağlamak için tüpleri bir rafa düz bir şekilde bağlayın. Her 5-10 dakikada bir 10 saniye boyunca elle kuvvetlice yukarı ve aşağı sallayın.
NOT: Doku parçası kalmayan homojen, sarımsı bir sindirim sıvısı görüldüğünde sindirim kesilebilir. - Sindirilmiş dokuları 70 μm'lik bir hücre süzgecinden 50 mL'lik bir santrifüj tüpüne süzün. Hücre verimini en üst düzeye çıkarmak ve sindirimi durdurmak için hücre süzgecini eşit hacimde kültür ortamı ile durulayın.
- Süzüntüyü yeni bir 15 mL'lik santrifüj tüpüne aktarın ve 10 dakika boyunca 1.800 × g'da santrifüjleyin. Süpernatanı atmak için tüpü ters çevirin ve peletleri 5 mL PBS'de yeniden süspanse edin. 1.800 × g'da 5 dakika santrifüjleyin.
- Tüpü ters çevirerek süpernatanı atın ve peletleri uygun bir hacimde kültür ortamında yeniden süspanse edin.
NOT: Her altı fareden toplanan hücre peletleri, 1 mL kültür ortamında yeniden süspanse edilir ve 12 oyuklu bir plakanın bir oyuğuna ekilir. - Hücreleri kollajen kaplı 12 oyuklu bir plakaya tohumlayın ve gece boyunca %5CO2 içeren nemli bir atmosferde 37 °C'de inkübe edin.
- Ertesi gün, kültür ortamını aspire edin, hücre kalıntılarını ve kırmızı kan hücrelerini çıkarmak için hücreleri% 1 v / v penisilin-streptomisin içeren önceden ısıtılmış (37 ° C) PBS ile yıkayın ve her bir kuyucuğa 1 mL taze kültür ortamı ekleyin.
4. Periaortik yağ dokusundan SVF kaynaklı preadipositlerin adipojenik indüksiyonu
- Hücreler ~% 60-70 birleşmeye ulaşana kadar kültür ortamını her gün değiştirin.
NOT: Hücrelerin %60-70 birleşmeye ulaşması genellikle 3-4 gün sürer. - Hücreler% 60-70 birleşmeye ulaştığında, kültür ortamını aspire edin ve kahverengi adipojenik indüksiyon ortamı ile değiştirin. Adipojenik farklılaşmanın indüksiyon gününü farklılaşmanın 0. günü olarak düşünün.
- 72 saat sonra (farklılaşmanın 3. günü), ortamı bakım ortamıyla yenileyin. Hücreler deneyler için kullanılana kadar bakım ortamını her 2 günde bir değiştirin.
- Adipojenik hücreleri, Yağ Kırmızısı O boyama14 ve batı lekeleme15 gibi uygun bir şekilde analiz edin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Yukarıda açıklanan bu protokolü kullanarak, fare torasik aortlarını çevreleyen PVAT'leri dikkatlice izole ettik (Şekil 1A-D). PVAT'lar steril makas kullanılarak yıkandıktan ve küçük parçalara ayrıldıktan sonra (Şekil 1E,F), doku parçaları tip 1 kollajenaz (1 mg/mL) ve dispas II (4 mg/mL) içeren bir sindirim solüsyonunda sindirildi ve 37 °C'de bir çalkalayıcı üzerinde 30-45 dakika inkübe edildi (Şekil 1G). Sindirilen dokular 70 μm'lik bir hücre süzgecinden 50 mL'lik bir santrifüj tüpüne süzüldü (Şekil 1H). Santrifüjlemeden sonra hücre peletleri toplandı (Şekil 1I).
SVF'den türetilen preadipositlerin adipojenik potansiyelini doğrulamak için, hücreleri 1 nM triiyodotironin, 1 μM rosiglitazon, 1 μM insülin, 0.5 mM IBMX ve 1 μM deksametazon içeren kahverengi adipojenik indüksiyon ortamı ile indükledik. Olgun adipositler, 7-10 günlük kahverengi adipojenik indüksiyondan sonra, Yağ Kırmızısı O-boyanmış lipid açısından zengin vakuollerin oluşumu ile karakterize edildi (Şekil 2A). Western blotlama analizi ayrıca adiponektin, Fabp4, Pgc1α, Pparγ, Ucp1 ve mitokondriyal protein Cox IV dahil olmak üzere adiposit spesifik proteinlerin artan ekspresyon seviyelerini gösterdi (Şekil 2B, C). Bu veriler, fare periaortik yağ dokusundan SVF'den türetilen preadipositlerin güçlü adipojenik potansiyel sergilediğini göstermektedir.
Şekil 1: Fare periaortik yağ dokusundan stromal vasküler fraksiyonun izolasyonu . (A) Kalp ve aort, cerrahi forseps ve makas kullanılarak dikkatlice diseke edilir. Beyaz ve sarı ok uçları sırasıyla kalbi ve aortu gösterir. (B) Torasik aortu çevreleyen PVAT'lar forseps kullanılarak dikkatlice sıyrılır. (C) Torasik aortu çevreleyen PVAT'ın çıkarılmasından sonra kalan aort. (D) PVAT'ler,% 1 v / v penisilin-streptomisin içeren yüksek glikozlu DMEM içeren 2 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpünde toplanır. (E) PVAT'ler, %10 v/v penisilin-streptomisin içeren PBS ve %1 v/v penisilin-streptomisin içeren PBS ile sırayla durulanır. (F) PVAT'ların steril makas kullanılarak 1 mm3 parçaya kıyılması. (G) Kıyılmış PVAT'ların 6 mL sindirim çözeltisi içeren 15 mL'lik bir santrifüj tüpüne aktarılması ve dokuların 37 °C'de 30-45 dakika boyunca 150 rpm'de çalkalanarak inkübe edilmesi. (H) Sindirimi durdurun ve süspansiyonu 70 μm'lik bir hücre süzgecinden 50 mL'lik bir santrifüj tüpüne süzün. (I) Süzüntüyü 10 dakika boyunca 1.800 × g'da santrifüjleyin; SVF izole edildi. Kısaltmalar: PVAT = perivasküler yağ dokusu; SVF = stromal vasküler fraksiyon. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Stromal vasküler fraksiyonun fare periaortik yağ dokusundan adipojenik farklılaşması . (A) 8. günde periaortik preadipositlerden farklılaşan primer adipositlerin ışık mikroskobu ve Yağ Kırmızısı O boyamasının temsili görüntüleri. Ölçek çubukları = 200 μm. (B,C) 8. günde periaortik preadipositlerden farklılaşan primer adipositler için adiponektin, Fabp4, Pgc1α, Pparγ, Cox IV ve Ucp1 protein seviyelerinin Western blotting analizi. İki grup arasındaki anlamlı farklılıkları hesaplamak için eşleştirilmemiş iki kuyruklu Student t-testi kullanıldı. Değerler ortalama ± SEM'dir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Fare periaortik yağ dokusundan SVF'den türetilen preadipositlerin izolasyonu ve adipojenik indüksiyonu için pratik ve uygulanabilir bir yaklaşım öneriyoruz. Bu protokolün avantajları basit ve ekonomik olmasıdır. Başarılı izolasyon için yeterli sayıda fare kritik öneme sahiptir, çünkü yetersiz doku düşük SVF yoğunluğuna ve zayıf büyüme durumuna neden olabilir ve sonuçta lipojenik verimliliği etkileyebilir. Ek olarak, SVF'nin adipojenik potansiyeli yaşla birlikte azaldığı için fare yaşı dikkate alınması gereken önemli bir faktördür. Damar sisteminin kontaminasyonunu en aza indirirken PVAT'ın hızlı ve dikkatli bir şekilde ayrılması çok önemlidir. Tip 1 kollajenaza dispas II'nin eklenmesi hücrelerin sindirim hızını ve verimini artırabileceğinden, sindirim çözeltisi de önemli bir bileşendir. Hücre canlılığını potansiyel olarak etkileyebileceğinden, aşırı sindirimi önlemek için sindirim sürecine çok dikkat etmek önemlidir. Protokol boyunca steril tekniklerin izlenmesi ve uygun kültür koşullarının sürdürülmesi esastır.
Periaortik adipositlerin primer kültürleri, PVAT özelliklerini ve fonksiyonlarını incelemek için değerlidir. Genetiği değiştirilmiş farelerin periaortik yağ dokusundan SVF'den türetilen preadipositlerin izolasyonu ve adipojenik indüksiyonu, PVAT farklılaşmasının ve adipogenezin önemli düzenleyicisini in vitro olarak keşfetmek için bir platform sağlar. PVAT, hidrojen peroksit, adiponektin, anjiyotensin 1-7, metil palmitat, hidrojen sülfür, nitrik oksit ve leptin3 gibi vazoaktif moleküller üreterek dıştan içe doğru bir vazokonstriksiyon ve vasküler yeniden şekillenme modülatörüdür. Sunulan bu yöntem, periaortik adipositler ve endotel hücreleri16, vasküler düz kas hücreleri (VSMC'ler)17, adventisyel fibroblastlar 18 veya makrofajlar 19 arasındaki karışmanın daha fazla araştırılmasına olanak tanıyarak PVAT'ın hipertansiyon, ateroskleroz, stenoz ve anevrizmalar gibi kardiyovasküler hastalıkların patogenezindeki merkezi rolleri hakkında fikir verir20,21,22.
Ek olarak, preadipositlerin izolasyonu ve adipojenik indüksiyonu, PVAT soylarını ve PVAT heterojenliğini incelemek için temellerdir. PVAT'ler, farklı fizyolojik ve patolojik fonksiyonel özelliklere katkıda bulunabilen farklı transkripsiyonel profiller olarak kendini gösteren heterojen intervasküler ve intravasküler yataklardır20,23. Chang ve ark. VSMC'ye özgü PPARy delesyonu olan farelerin aort ve mezenterik bölgelerde PVAT'tan yoksun olduğunu bildirmiştir, bu da PVAT'ın lokal vasküler duvar24 ile aynı embriyonik kökenleri paylaşabileceğini göstermektedir. Farklı embriyonik kökenlerden PVAT'ın farklı fenotiplere sahip olabileceğine dair kanıtlar vardır25,26. Ektodermal kökenli nöral krest hücrelerinden türetilen çıkan aort ve aortik arkı çevreleyen PVAT (AA-PVAT), morfolojik ve transkriptomik olarak kahverengi yağ dokusuna (BAT) daha benzerdir27. Buna bağlı olarak, nöral krest hücrelerinden türetilen PVAT'ın SVF'si, in vitro28'de beyaz adipositlerden daha kolay kahverengi adipositlere farklılaşma eğilimindedir. Bununla birlikte, abdominal aort PVAT, öncelikle beyaz yağ dokusu benzeri bir fenotip29 sergiler. PVAT'ın BAT benzeri bir fenotipi veya PVAT'ın bejlenmesi, antiinflamatuar ve antipatolojik yeniden şekillenme etkileri ile ilişkilidir ve PVAT fenotip modülasyonu19,30 yoluyla kardiyovasküler hastalığın tedavisine ışık tutar. Bu protokol, tezgah tarafında teknolojik mihenk taşını sağlayacaktır.
Bununla birlikte, bu protokolün bazı sınırlamaları vardır. PVAT'ın sınırlı mevcudiyeti nedeniyle, PVAT-SVF'nin çıkarılması daha fazla sayıda fare gerektirir. SVF'ye talebin yüksek olduğu durumlarda, deneysel ilerlemeyi hızlandırmak için birden fazla kişinin katılımını sağlamak gerekebilir. Ölümsüzleştirilmiş preadipositlerle karşılaştırıldığında, SVF'den türetilen preadipositler ek insan ve malzeme kaynakları gerektirir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların beyan edecekleri finansal veya başka türlü herhangi bir çıkar çatışması yoktur.
Acknowledgments
Bu çalışma, Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (82130012 ve 81830010) ve Şanghay Göğüs Hastanesi'nin temel araştırmaları için Yetiştirme projeleri (Hibe Numarası: 2022YNJCQ03) tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2 μm syringe filters | PALL | 4612 | |
| 12-well plate | Labselect | 11210 | |
| 15 mL centrifuge tube | Labserv | 310109003 | |
| 3,3',5-triiodo-L-thyronine (T3) | Sigma-Aldrich | T-2877 | 1 nM |
| 50 mL centrifuge tube | Labselect | CT-002-50A | |
| anti-adiponectin | Abcam | ab22554 | 1:1,000 working concentration |
| anti-COX IV | CST | 4850 | 1:1,000 working concentration |
| anti-FABP4 | CST | 2120 | 1:1,000 working concentration |
| anti-PGC1α | Abcam | ab191838 | 1:1,000 working concentration |
| anti-PPARγ | Invitrogen | MA5-14889 | 1:1,000 working concentration |
| anti-UCP1 | Abcam | ab10983 | 1:1,000 working concentration |
| anti-α-Actinin | CST | 6487 | 1:1,000 working concentration |
| BSA | Beyotime | ST023-200g | 1% |
| C57BL/6 mice aged 4-8 weeks of both sexes | Shanghai Model Organisms Center, Inc. | ||
| Cell Strainer 70 µm, nylon | Falcon | 352350 | |
| Collagen from calf skin | Sigma-Aldrich | C8919 | |
| Collagenase, Type 1 | Worthington | LS004196 | 1 mg/mL |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D1756 | 1 μM |
| Dispase II | Sigma-Aldrich | D4693-1G | 4 mg/mL |
| Fetal bovine serum | Gibco | 16000-044 | 10% |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034-25G | 20 mM |
| High glucose DMEM | Hyclone | SH30022.01 | |
| IBMX | Sigma-Aldrich | I7018 | 0.5 mM |
| Incubator with orbital shaker | Shanghai longyue Instrument Eruipment Co.,Ltd. | LYZ-103B | |
| Insulin (cattle) | Sigma-Aldrich | 11070-73-8 | 1 μM |
| Isoflurane | RWD | R510-22-10 | |
| Krebs-Ringer's Solution | Pricella | PB180347 | protect from light |
| Microsurgical forceps | Beyotime | FS233 | |
| Microsurgical scissor | Beyotime | FS217 | |
| Oil Red O | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd | A600395-0050 | |
| PBS (Phosphate-buffered saline) | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd | B548117-0500 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 115-035-146 | 1:5,000 working concentration |
| Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 111-035-144 | 1:5,000 working concentration |
| Rosiglitazone | Sigma-Aldrich | R2408 | 1 μM |
| Standard forceps | Beyotime | FS225 | |
| Surgical scissor | Beyotime | FS001 |
References
- Akoumianakis, I., Antoniades, C. The interplay between adipose tissue and the cardiovascular system: is fat always bad. Cardiovascular Research. 113 (9), 999-1008 (2017).
- Huang, C. L., et al. Thoracic perivascular adipose tissue inhibits VSMC apoptosis and aortic aneurysm formation in mice via the secretome of browning adipocytes. Acta Pharmacologica Sinica. 44 (2), 345-355 (2023).
- Xia, N., Li, H. The role of perivascular adipose tissue in obesity-induced vascular dysfunction. British Journal of Pharmacology. 174 (20), 3425-3442 (2017).
- Brown, N. K., et al. Perivascular adipose tissue in vascular function and disease: a review of current research and animal models. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 34 (8), 1621-1630 (2014).
- Ferrero, R., Rainer, P., Deplancke, B. Toward a consensus view of mammalian adipocyte stem and progenitor cell heterogeneity. Trends in Cell Biology. 30 (12), 937-950 (2020).
- Angueira, A. R., et al. Defining the lineage of thermogenic perivascular adipose tissue. Nature Metabolism. 3 (4), 469-484 (2021).
- Boucher, J. M., et al. Rab27a regulates human perivascular adipose progenitor cell differentiation. Cardiovascular Drugs and Therapy. 32 (5), 519-530 (2018).
- Saxton, S. N., Withers, S. B., Heagerty, A. M. Emerging roles of sympathetic nerves and inflammation in perivascular adipose tissue. Cardiovascular Drugs and Therapy. 33 (2), 245-259 (2019).
- Ferroni, L., De Francesco, F., Pinton, P., Gardin, C., Zavan, B. Methods to isolate adipose tissue-derived stem cells. Methods in Cell Biology. 171, 215-228 (2022).
- Senesi, L., et al. Mechanical and enzymatic procedures to isolate the stromal vascular fraction from adipose tissue: preliminary results. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 7, 88 (2019).
- Andia, I., Maffulli, N., Burgos-Alonso, N. Stromal vascular fraction technologies and clinical applications. Expert Opinion on Biological Therapy. 19 (12), 1289-1305 (2019).
- Suh, A., et al. Adipose-derived cellular and cell-derived regenerative therapies in dermatology and aesthetic rejuvenation. Ageing Research Reviews. 54, 100933 (2019).
- Bellei, B., Migliano, E., Picardo, M. Therapeutic potential of adipose tissue-derivatives in modern dermatology. Experimental Dermatology. 31 (12), 1837-1852 (2022).
- Kraus, N. A., et al. Quantitative assessment of adipocyte differentiation in cell culture. Adipocyte. 5 (4), 351-358 (2016).
- Figueroa, A. M., Stolzenbach, F., Tapia, P., Cortés, V. Differentiation and imaging of brown adipocytes from the stromal vascular fraction of interscapular adipose tissue from newborn mice. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (192), (2023).
- Ma, Y., et al. Methotrexate improves perivascular adipose tissue/endothelial dysfunction via activation of AMPK/eNOS pathway. Molecular Medicine Reports. 15 (4), 2353-2359 (2017).
- Li, X., Ballantyne, L. L., Yu, Y., Funk, C. D. Perivascular adipose tissue-derived extracellular vesicle miR-221-3p mediates vascular remodeling. FASEB Journal. 33 (11), 12704-12722 (2019).
- Ruan, C. C., et al. Perivascular adipose tissue-derived complement 3 is required for adventitial fibroblast functions and adventitial remodeling in deoxycorticosterone acetate-salt hypertensive rats. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 30 (12), 2568-2574 (2010).
- Adachi, Y., et al. Beiging of perivascular adipose tissue regulates its inflammation and vascular remodeling. Nature Communications. 13 (1), 5117 (2022).
- Ye, M., et al. Developmental and functional characteristics of the thoracic aorta perivascular adipocyte. Cellular and Molecular Life Sciences. 76 (4), 777-789 (2019).
- Stanek, A., Brożyna-Tkaczyk, K., Myśliński, W. The role of obesity-induced perivascular adipose tissue (PVAT) dysfunction in vascular homeostasis. Nutrients. 13 (11), 3843 (2021).
- Queiroz, M., Sena, C. M. Perivascular adipose tissue in age-related vascular disease. Ageing Research Reviews. 59, 101040 (2020).
- Fitzgibbons, T. P., et al. Similarity of mouse perivascular and brown adipose tissues and their resistance to diet-induced inflammation. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 301 (4), H1425-H1437 (2011).
- Chang, L., et al. Loss of perivascular adipose tissue on peroxisome proliferator-activated receptor-γ deletion in smooth muscle cells impairs intravascular thermoregulation and enhances atherosclerosis. Circulation. 126 (9), 1067-1078 (2012).
- Piacentini, L., et al. Genome-wide expression profiling unveils autoimmune response signatures in the perivascular adipose tissue of abdominal aortic aneurysm. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 39 (2), 237-249 (2019).
- Wang, Z., et al. RNA sequencing reveals perivascular adipose tissue plasticity in response to angiotensin II. Pharmacological Research. 178, 106183 (2022).
- Shi, K., et al. Ascending aortic perivascular adipose tissue inflammation associates with aortic valve disease. Journal of Cardiology. 80 (3), 240-248 (2022).
- Fu, M., et al. Neural crest cells differentiate into brown adipocytes and contribute to periaortic arch adipose tissue formation. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 39 (8), 1629-1644 (2019).
- Gil-Ortega, M., Somoza, B., Huang, Y., Gollasch, M., Fernández-Alfonso, M. S. Regional differences in perivascular adipose tissue impacting vascular homeostasis. Trends in Endocrinology & Metabolism. 26 (7), 367-375 (2015).
- Bar, A., et al. In vivo magnetic resonance imaging-based detection of heterogeneous endothelial response in thoracic and abdominal aorta to short-term high-fat diet ascribed to differences in perivascular adipose tissue in mice. Journal of the American Heart Association. 9 (21), e016929 (2020).
