Summary
Qui, descriviamo l'isolamento, la coltura e l'induzione adipogenica di preadipociti derivati dalla frazione vascolare stromale dal tessuto adiposo periaortico di topo, consentendo lo studio della funzione del tessuto adiposo perivascolare e della sua relazione con le cellule vascolari.
Abstract
Il tessuto adiposo perivascolare (PVAT) è un deposito di tessuto adiposo che circonda i vasi sanguigni e presenta i fenotipi di adipociti bianchi, beige e marroni. Recenti scoperte hanno messo in luce il ruolo centrale del PVAT nella regolazione dell'omeostasi vascolare e nella partecipazione alla patogenesi delle malattie cardiovascolari. Una comprensione completa delle proprietà e della regolazione del PVAT è di grande importanza per lo sviluppo di future terapie. Le colture primarie di adipociti periaortici sono preziose per studiare la funzione PVAT e il crosstalk tra adipociti periaortici e cellule vascolari. Questo articolo presenta un protocollo economico e fattibile per l'isolamento, la coltura e l'induzione adipogenica di preadipociti derivati dalla frazione vascolare stromale dal tessuto adiposo periaortico di topo, che può essere utile per modellare l'adipogenesi o la lipogenesi in vitro. Il protocollo delinea l'elaborazione dei tessuti e la differenziazione cellulare per la coltura di adipociti periaortici da topi giovani. Questo protocollo fornirà la pietra angolare tecnologica a bordo banco per lo studio della funzione PVAT.
Introduction
Si ritiene che il tessuto adiposo perivascolare (PVAT), una struttura perivascolare composta da una miscela di adipociti maturi e una frazione vascolare stromale (SVF), interagisca con la parete del vaso adiacente tramite il suo secretomaparacrino 1. Come regolatore critico dell'omeostasi vascolare, la disfunzione PVAT è implicata nella patogenesi delle malattie cardiovascolari 2,3,4. La SVF del tessuto adipocitario è costituita da diverse popolazioni cellulari previste, tra cui cellule endoteliali, cellule immunitarie, cellule del mesotelio, cellule neuronali e cellule staminali e progenitrici adipose (ASPC)5,6. E' noto che le ASPC che risiedono nella SVF del tessuto adiposo possono dare origine ad adipociti maturi5. Si ritiene che la SVF sia una fonte critica di adipociti maturi nel PVAT. Diversi studi hanno dimostrato che PVAT-SVF può differenziarsi in adipociti maturi in specifiche condizionidi induzione 6,7,8.
Attualmente, esistono due sistemi di isolamento per isolare SVF dal tessuto adiposo, uno è la digestione enzimatica e l'altro è non enzimatico9. I metodi enzimatici in genere determinano una maggiore resa di cellule progenitrici nucleate10. Ad oggi, i benefici della SVF nel promuovere la rigenerazione vascolare e la neovascolarizzazione nelle malattie della guarigione delle ferite, urogenitali e cardiovascolari sono stati ampiamente dimostrati11, in particolare in dermatologia e chirurgia plastica12,13. Tuttavia, le prospettive di applicazione clinica delle SVF derivate da PVAT non sono state ben esplorate, il che può essere attribuito alla mancanza di un metodo standardizzato per l'isolamento delle SVF da PVAT. L'obiettivo di questo protocollo è quello di stabilire un approccio standardizzato per l'isolamento, la coltura e l'induzione adipogenica di preadipociti derivati da SVF da PVAT di topo che circondano l'aorta toracica, consentendo ulteriori indagini sulla funzione di PVAT. Questo protocollo ottimizza le tecniche di processamento tissutale e di differenziamento cellulare per la coltura di adipociti periaortici ottenuti da topi giovani.
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Protocol
I protocolli sugli animali sono stati approvati dal Comitato Istituzionale per la Cura e l'Uso degli Animali presso l'Ospedale Toracico di Shanghai affiliato alla Scuola di Medicina dell'Università Jiao Tong di Shanghai (numero di approvazione: KS23010) ed erano conformi alle normative etiche pertinenti. I topi C57BL/6 maschi e femmine di età compresa tra 4 e 8 settimane sono da preferire per questo esperimento.
1. Preparazione di strumenti chirurgici, tamponi e terreni di coltura
- Sterilizzare in autoclave gli strumenti chirurgici (ad es. forbici chirurgiche e pinze standard) a 121 °C per 30 min. Disinfettare gli strumenti microchirurgici con alcol al 75%.
- Preparare soluzione salina sterile tamponata con fosfato (PBS) integrata con penicillina-streptomicina all'1% v/v e altri 10 ml di PBS integrata con penicillina-streptomicina al 10% v/v.
NOTA: Nelle sezioni seguenti, se non espressamente menzionato, il PBS si riferisce al PBS sterile regolare. - Preparare il tampone Krebs Ringer HEPES BSA: 1% albumina sierica bovina (BSA), 20 mM di HEPES disciolti nella soluzione Krebs Ringer.
- Preparare una soluzione fresca per la digestione: collagenasi di tipo 1 (1 mg/ml) e dispasi II (4 mg/ml) disciolte nel tampone Krebs Ringer HEPES BSA. Sterilizzare la soluzione utilizzando un filtro da 0,2 μm.
- Preparare una piastra a 12 pozzetti rivestita di collagene.
- Diluire la soluzione di collagene (1 mg/mL) con acqua deionizzata sterile alla concentrazione di 40 μg/mL. Aggiungere 1 mL della soluzione di collagene diluita sulla superficie di ciascun pozzetto per ottenere una concentrazione di 6-10 μg/cm2. Incubare il rivestimento per 1 ora a temperatura ambiente.
- Rimuovere la soluzione rimanente e sciacquare ogni pozzetto 2 volte con 1 mL di PBS. Utilizzare immediatamente la piastra o asciugarla all'aria in una cappa a flusso laminare di classe II e conservare la piastra rivestita a 2-8 °C. Durante la conservazione, sigillare le piastre rivestite con parafilm.
- Preparare il terreno di coltura: Dulbecco's-Modified Eagles Medium (DMEM) ad alto contenuto di glucosio, 10% di siero fetale bovino (FBS), 1% v/v di penicillina-streptomicina. Conservare a 4 °C per un massimo di 2 settimane.
- Preparare il terreno di induzione lipogenico: DMEM ad alto contenuto di glucosio, 10% FBS, 1% v/v penicillina-streptomicina, 1 nM triiodotironina, 1 μM rosiglitazone, 1 μM di insulina, 0,5 mM di 3-isobutil-1-metilxantina (IBMX) e 1 μM di desametasone. Conservare a 4 °C per un massimo di 2 settimane.
- Preparare il terreno di mantenimento: DMEM ad alto contenuto di glucosio, 10% FBS, 1% v/v penicillina-streptomicina, 1 nM triiodotironina, 1 μM di rosiglitazone e 1 μM di insulina. Conservare a 4 °C per un massimo di 2 settimane.
2. Dissezione e isolamento del tessuto adiposo perivascolare (PVAT)
- Sopprimere il topo mediante lussazione cervicale in anestesia isoflurana al 2% o con sovradosaggio di anidride carbonica. Spruzzare con alcool al 75% per la disinfezione della pelle.
- Posizionare il mouse in posizione supina (rivolto verso l'alto).
- Sollevare la pelle, praticare una piccola incisione e separare bruscamente la pelle e i muscoli addominali con forbici chirurgiche lungo la linea mediana ventrale dal bacino al collo. Esporre il cuore e i polmoni tagliando il diaframma e le costole lungo entrambi i lati della linea mediana.
- Rimuovere con cautela il fegato, la milza, l'intestino e i reni. Evitare di tagliare la parete intestinale.
- Rimuovere i polmoni e l'esofago.
- Sollevare delicatamente il cuore con una pinza in una mano e separare l'aorta dalla colonna vertebrale con le forbici chirurgiche nell'altra mano. Quindi, posizionare il cuore e l'aorta in una capsula di Petri da 60 mm con PBS contenente l'1% v/v di penicillina-streptomicina.
- Rimuovere le pinze microchirurgiche e le forbici microchirurgiche dall'alcol e risciacquare con 25 ml di PBS per rimuovere l'alcol in eccesso. Sotto uno stereomicroscopio, rimuovere il timo e altri tessuti dal cuore e dall'aorta, quindi rimuovere il cuore, lasciando l'aorta con i PVAT.
- Trasferire l'aorta con i PVAT in una capsula di Petri pulita da 60 mm con PBS contenente l'1% v/v di penicillina-streptomicina.
- Utilizzare pinze microchirurgiche per rimuovere i PVAT, con un paio di pinze che fissano l'aorta e l'altra che stacca il tessuto adiposo. Rimuovere il più possibile il tessuto vascolare, riducendo al minimo i danni al tessuto adiposo perivascolare.
- Raccogliere il PVAT che circonda l'aorta toracica nella provetta da microcentrifuga da 2 mL contenente DMEM ad alto contenuto di glucosio integrato con penicillina-streptomicina all'1% v/v posta su ghiaccio.
3. Isolamento della frazione vascolare stromale (SVF)
- Sciacquare i tessuti raccolti in sequenza con PBS contenente il 10% v/v di penicillina-streptomicina e PBS contenente l'1% v/v di penicillina-streptomicina.
NOTA: Da questa fase in poi, tutti gli esperimenti devono essere eseguiti in condizioni sterili in una cappa a flusso laminare di classe II. - Trasferire i tessuti in una capsula di Petri sterile da 60 mm, aggiungere 200 μL di soluzione digestiva e tritarli inpezzi da 1 mm 3 utilizzando forbici sterili.
- Trasferire la miscela in una provetta da centrifuga da 15 mL utilizzando un puntale di pipetta di plastica, l'estremità allargata da un taglio sterile a forbice, e aggiungere 6 mL di soluzione di digestione per avviare la reazione di digestione.
NOTA: Una reazione di digestione (3 mL di soluzione di digestione) è sufficiente per i depositi PVAT di sei topi. - Incubare i tessuti a 37 °C in un incubatore con agitatore orbitale (frequenza 150 giri/min per una miscelazione efficace) per 30-45 minuti. Legare le provette su una griglia per farle scuotere orizzontalmente. Agitare energicamente su e giù a mano per 10 secondi ogni 5-10 minuti.
NOTA: La digestione può essere interrotta quando si osserva un fluido digestivo omogeneo e giallastro senza frammenti di tessuto rimasti. - Filtrare i tessuti digeriti attraverso un colino cellulare da 70 μm in una provetta da centrifuga da 50 mL. Sciacquare il colino cellulare con un volume uguale di terreno di coltura per massimizzare la resa cellulare e fermare la digestione.
- Trasferire il filtrato in una nuova provetta da centrifuga da 15 mL e centrifugare a 1.800 × g per 10 min. Capovolgere la provetta per scartare il surnatante e risospendere i pellet in 5 mL di PBS. Centrifugare a 1.800 × g per 5 min.
- Scartare il surnatante capovolgendo la provetta e risospendere i pellet in un volume appropriato di terreno di coltura.
NOTA: I pellet cellulari raccolti da ogni sei topi vengono risospesi in 1 mL di terreno di coltura e seminati in un pozzetto di una piastra da 12 pozzetti. - Seminare le cellule in una piastra a 12 pozzetti rivestita di collagene e incubare a 37 °C in un'atmosfera umida con il 5% di CO2 per una notte.
- Il giorno successivo, aspirare il terreno di coltura, lavare le cellule con PBS preriscaldato (37 °C) contenente l'1% v/v di penicillina-streptomicina per rimuovere i detriti cellulari e i globuli rossi e aggiungere nuovamente 1 mL di terreno di coltura fresco per ogni pozzetto.
4. Induzione adipogenica di preadipociti derivati da SVF dal tessuto adiposo periaortico
- Cambiare il terreno di coltura a giorni alterni fino a quando le cellule raggiungono ~60-70% di confluenza.
NOTA: Di solito ci vogliono 3-4 giorni prima che le cellule raggiungano il 60-70% di confluenza. - Quando le cellule raggiungono il 60-70% di confluenza, aspirare il terreno di coltura e sostituirlo con terreno di induzione adipogenico bruno. Considerare il giorno di induzione della differenziazione adipogenica come giorno 0 di differenziazione.
- Dopo 72 ore (giorno 3 di differenziazione), rinfrescare il mezzo con il mezzo di mantenimento. Cambiare il mezzo di mantenimento ogni 2 giorni fino a quando le cellule non vengono utilizzate per gli esperimenti.
- Analizzare le cellule adipogeniche in modo appropriato, come la colorazione Oil Red O14 e il western blotting15.
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Representative Results
Utilizzando questo protocollo sopra descritto, abbiamo isolato accuratamente i PVAT che circondano l'aorta toracica del topo (Figura 1A-D). Dopo aver lavato e tritato i PVAT in piccoli pezzi utilizzando forbici sterili (Figura 1E,F), i frammenti di tessuto sono stati digeriti in una soluzione digestiva contenente collagenasi di tipo 1 (1 mg/mL) e dispasi II (4 mg/mL) e incubati a 37 °C su uno shaker per 30-45 minuti (Figura 1G). I tessuti digeriti sono stati filtrati attraverso un colino cellulare da 70 μm in una provetta da centrifuga da 50 mL (Figura 1H). I pellet cellulari sono stati raccolti dopo la centrifugazione (Figura 1I).
Per confermare il potenziale adipogenico dei preadipociti derivati da SVF, abbiamo indotto le cellule con terreno di induzione adipogenico marrone contenente 1 nM triiodotironina, 1 μM rosiglitazone, 1 μM di insulina, 0,5 mM di IBMX e 1 μM di desametasone. Gli adipociti maturi sono stati osservati dopo 7-10 giorni di induzione adipogenica bruna, caratterizzata dalla formazione di vacuoli ricchi di lipidi colorati con O rosso olio (Figura 2A). L'analisi del Western blotting ha inoltre mostrato l'aumento dei livelli di espressione di proteine specifiche degli adipociti, tra cui adiponectina, Fabp4, Pgc1α, Pparγ, Ucp1 e la proteina mitocondriale Cox IV (Figura 2B,C). Questi dati suggeriscono che i preadipociti derivati da SVF dal tessuto adiposo periaortico di topo mostrano un forte potenziale adipogenico.
Figura 1: Isolamento della frazione vascolare stromale dal tessuto adiposo periaortico di topo . (A) Il cuore e l'aorta vengono accuratamente sezionati utilizzando pinze chirurgiche e forbici. Le punte di freccia bianche e gialle indicano rispettivamente il cuore e l'aorta. (B) I PVAT che circondano l'aorta toracica vengono accuratamente rimossi con una pinza. (C) L'aorta lasciata dopo la rimozione del PVAT che circonda l'aorta toracica. (D) I PVAT sono raccolti in una provetta per microcentrifuga da 2 mL contenente DMEM ad alto contenuto di glucosio con penicillina-streptomicina all'1% v/v. (E) I PVAT vengono risciacquati in sequenza con PBS contenente il 10% v/v di penicillina-streptomicina e PBS contenente l'1% v/v di penicillina-streptomicina. (F) Tritare i PVAT in1 mm 3 pezzi utilizzando forbici sterili. (G) Trasferimento di PVAT tritati in una provetta da centrifuga da 15 mL contenente 6 mL di soluzione di digestione e incubazione dei tessuti a 37 °C per 30-45 minuti con agitazione a 150 giri/min. (H) Arrestare la digestione e filtrare la sospensione attraverso un colino cellulare da 70 μm fino a una provetta da centrifuga da 50 mL. (I) Centrifugare il filtrato a 1.800 × g per 10 min; la SVF è stata isolata. Abbreviazioni: PVAT = tessuto adiposo perivascolare; SVF = frazione vascolare stromale. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Differenziazione adipogenica della frazione vascolare stromale dal tessuto adiposo periaortico di topo . (A) Immagini rappresentative della colorazione al microscopio ottico e dell'olio rosso O degli adipociti primari differenziati dai preadipociti periaortici al giorno 8. Barre della scala = 200 μm. (B,C) Analisi di Western blotting dei livelli proteici di adiponectina, Fabp4, Pgc1α, Pparγ, Cox IV e Ucp1 per adipociti primari differenziati dai preadipociti periaortici al giorno 8. I t-test di Student a due code non accoppiati sono stati utilizzati per calcolare le differenze significative tra i due gruppi. I valori sono medi ± SEM. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Proponiamo un approccio pratico e fattibile per l'isolamento e l'induzione adipogenica di preadipociti derivati da SVF dal tessuto adiposo periaortico di topo. I vantaggi di questo protocollo sono che è semplice ed economico. Un numero adeguato di topi è fondamentale per il successo dell'isolamento, poiché un tessuto insufficiente può causare una bassa densità di SVF e uno scarso stato di crescita, influenzando in ultima analisi l'efficienza lipogenica. Inoltre, l'età del topo è un fattore importante da considerare poiché il potenziale adipogenico della SVF diminuisce con l'età. È fondamentale separare rapidamente e con attenzione il PVAT, riducendo al minimo la contaminazione del sistema vascolare. Anche la soluzione di digestione è un componente chiave in quanto l'aggiunta di dispasi II alla collagenasi di tipo 1 può migliorare la velocità di digestione e la resa delle cellule. È importante prestare molta attenzione al processo di digestione per evitare un'eccessiva digestione in quanto potrebbe potenzialmente influire sulla vitalità cellulare. Seguire le tecniche sterili e mantenere condizioni di coltura appropriate per tutta la durata del protocollo è essenziale.
Le colture primarie di adipociti periaortici sono preziose per studiare le proprietà e le funzioni del PVAT. L'isolamento e l'induzione adipogenica di preadipociti derivati da SVF dal tessuto adiposo periaortico di topi geneticamente modificati forniscono una piattaforma per esplorare l'importante regolatore della differenziazione PVAT e dell'adipogenesi in vitro. PVAT è un modulatore della vasocostrizione e del rimodellamento vascolare in modo dall'esterno verso l'interno, attraverso la generazione di molecole vasoattive come il perossido di idrogeno, l'adiponectina, l'angiotensina 1-7, il palmitato di metile, l'idrogeno solforato, l'ossido nitrico e la leptina3. Questo metodo presentato consente di studiare ulteriormente il crosstalk tra adipociti periaortici e cellule endoteliali 16, cellule muscolari lisce vascolari (VSMC)17, fibroblasti avventiziali 18 o macrofagi 19, fornendo approfondimenti sul ruolo centrale di PVAT nella patogenesi di malattie cardiovascolari come ipertensione, aterosclerosi, stenosi e aneurismi20,21,22.
Inoltre, l'isolamento e l'induzione adipogenica dei preadipociti sono le basi per studiare i lignaggi e l'eterogeneità dei PVAT. I PVAT sono letti eterogenei inter- e intravascolari, che si manifestano come profili trascrizionali distinti, che possono contribuire a caratteristiche funzionali fisiologiche e patologiche distinte20,23. Chang et al. hanno riportato che i topi con delezione PPARγ specifica per VSMC mancavano di PVAT nelle regioni aortica e mesenterica, indicando che PVAT potrebbe condividere le stesse origini embrionali con la parete vascolare locale24. Ci sono prove che PVAT di diverse origini embrionali possono avere fenotipi diversi25,26. Il PVAT che circonda l'aorta ascendente e l'arco aortico (AA-PVAT), derivato da cellule della cresta neurale di origine ectodermica, è morfologicamente e trascrittomicamente più simile al tessuto adiposo bruno (BAT)27. Di conseguenza, la SVF di PVAT derivata dalle cellule della cresta neurale tende a differenziarsi in adipociti bruni più facilmente rispetto agli adipociti bianchi in vitro28. Il PVAT dell'aorta addominale, tuttavia, presenta principalmente un fenotipo29 simile al tessuto adiposo bianco. Un fenotipo di PVAT simile a BAT o l'insorgenza di PVAT è associato a effetti di rimodellamento antinfiammatorio e antipatologico, facendo luce sul trattamento delle malattie cardiovascolari attraverso la modulazione del fenotipoPVAT 19,30. Questo protocollo fornirà la pietra angolare tecnologica a bordo campo.
Tuttavia, ci sono alcune limitazioni a questo protocollo. A causa della limitata disponibilità di PVAT, l'estrazione di PVAT-SVF richiede un numero maggiore di topi. In situazioni in cui c'è un'elevata domanda di SVF, potrebbe essere necessario coinvolgere più di una persona per accelerare il progresso sperimentale. Rispetto ai preadipociti immortalizzati, i preadipociti derivati da SVF richiedono risorse umane e materiali aggiuntive.
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Disclosures
Gli autori non hanno conflitti di interesse, finanziari o di altro tipo, da dichiarare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto dalla National Natural Science Foundation of China (82130012 e 81830010) e dai progetti Nurture per la ricerca di base dello Shanghai Chest Hospital (Grant Number: 2022YNJCQ03).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2 μm syringe filters | PALL | 4612 | |
| 12-well plate | Labselect | 11210 | |
| 15 mL centrifuge tube | Labserv | 310109003 | |
| 3,3',5-triiodo-L-thyronine (T3) | Sigma-Aldrich | T-2877 | 1 nM |
| 50 mL centrifuge tube | Labselect | CT-002-50A | |
| anti-adiponectin | Abcam | ab22554 | 1:1,000 working concentration |
| anti-COX IV | CST | 4850 | 1:1,000 working concentration |
| anti-FABP4 | CST | 2120 | 1:1,000 working concentration |
| anti-PGC1α | Abcam | ab191838 | 1:1,000 working concentration |
| anti-PPARγ | Invitrogen | MA5-14889 | 1:1,000 working concentration |
| anti-UCP1 | Abcam | ab10983 | 1:1,000 working concentration |
| anti-α-Actinin | CST | 6487 | 1:1,000 working concentration |
| BSA | Beyotime | ST023-200g | 1% |
| C57BL/6 mice aged 4-8 weeks of both sexes | Shanghai Model Organisms Center, Inc. | ||
| Cell Strainer 70 µm, nylon | Falcon | 352350 | |
| Collagen from calf skin | Sigma-Aldrich | C8919 | |
| Collagenase, Type 1 | Worthington | LS004196 | 1 mg/mL |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D1756 | 1 μM |
| Dispase II | Sigma-Aldrich | D4693-1G | 4 mg/mL |
| Fetal bovine serum | Gibco | 16000-044 | 10% |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034-25G | 20 mM |
| High glucose DMEM | Hyclone | SH30022.01 | |
| IBMX | Sigma-Aldrich | I7018 | 0.5 mM |
| Incubator with orbital shaker | Shanghai longyue Instrument Eruipment Co.,Ltd. | LYZ-103B | |
| Insulin (cattle) | Sigma-Aldrich | 11070-73-8 | 1 μM |
| Isoflurane | RWD | R510-22-10 | |
| Krebs-Ringer's Solution | Pricella | PB180347 | protect from light |
| Microsurgical forceps | Beyotime | FS233 | |
| Microsurgical scissor | Beyotime | FS217 | |
| Oil Red O | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd | A600395-0050 | |
| PBS (Phosphate-buffered saline) | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd | B548117-0500 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 115-035-146 | 1:5,000 working concentration |
| Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 111-035-144 | 1:5,000 working concentration |
| Rosiglitazone | Sigma-Aldrich | R2408 | 1 μM |
| Standard forceps | Beyotime | FS225 | |
| Surgical scissor | Beyotime | FS001 |
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