Summary
Ici, nous décrivons l’isolement, la culture et l’induction adipogénique de préadipocytes dérivés de la fraction vasculaire stromale à partir de tissu adipeux périaortique de souris, permettant l’étude de la fonction du tissu adipeux périvasculaire et de sa relation avec les cellules vasculaires.
Abstract
Le tissu adipeux périvasculaire (TVAP) est un dépôt de tissu adipeux qui entoure les vaisseaux sanguins et présente les phénotypes d’adipocytes blancs, beiges et bruns. Des découvertes récentes ont mis en lumière le rôle central de la PVAT dans la régulation de l’homéostasie vasculaire et la participation à la pathogenèse des maladies cardiovasculaires. Une compréhension globale des propriétés et de la réglementation de la PVAT est d’une grande importance pour le développement de thérapies futures. Les cultures primaires d’adipocytes périaortiques sont précieuses pour étudier la fonction PVAT et la diaphonie entre les adipocytes périaortiques et les cellules vasculaires. Cet article présente un protocole économique et réalisable pour l’isolement, la culture et l’induction adipogénique de préadipocytes dérivés de la fraction vasculaire stromale à partir de tissu adipeux périaortique de souris, qui peut être utile pour la modélisation de l’adipogenèse ou de la lipogenèse in vitro. Le protocole décrit le traitement tissulaire et la différenciation cellulaire pour la culture des adipocytes périaortiques à partir de jeunes souris. Ce protocole constituera la pierre angulaire technologique de la paillasse pour l’étude de la fonction PVAT.
Introduction
On pense que le tissu adipeux périvasculaire (TVAP), une structure périvasculaire composée d’un mélange d’adipocytes matures et d’une fraction vasculaire stromale (SVF), interagit avec la paroi vasculaire adjacente via son sécrétome paracriné. En tant que régulateur essentiel de l’homéostasie vasculaire, le dysfonctionnement de la PVAT est impliqué dans la pathogenèse des maladies cardiovasculaires 2,3,4. La SVF du tissu adipocytaire est constituée de plusieurs populations cellulaires attendues, notamment des cellules endothéliales, des cellules immunitaires, des cellules mésothéliennes, des cellules neuronales et des cellules souches et progénitrices adipeuses (ASPC)5,6. Il est bien connu que les ASPC résidant dans le SVF du tissu adipeux peuvent donner naissance à des adipocytes matures5. On en déduit que la SVF est une source critique d’adipocytes matures dans la PVAT. Plusieurs études ont montré que PVAT-SVF peut se différencier en adipocytes matures dans des conditions d’induction spécifiques 6,7,8.
Actuellement, il existe deux systèmes d’isolement pour isoler le SVF du tissu adipeux, l’un est la digestion enzymatique et l’autre est non enzymatique9. Les méthodes enzymatiques entraînent généralement un rendement plus élevé de cellules progénitrices nucléées10. À ce jour, les avantages de la SVF dans la promotion de la régénération vasculaire et de la néovascularisation dans la cicatrisation des plaies, les maladies urogénitales et cardiovasculaires ont été largement démontrés11, en particulier en dermatologie et en chirurgie plastique12,13. Cependant, les perspectives d’application clinique de la SVF dérivée de la PVAT n’ont pas été bien explorées, ce qui peut être attribué à l’absence d’une méthode standardisée pour isoler la SVF de la PVAT. L’objectif de ce protocole est d’établir une approche standardisée pour l’isolement, la culture et l’induction adipogénique de préadipocytes dérivés de la SVF à partir de PVAT murins entourant l’aorte thoracique, permettant une étude plus approfondie de la fonction PVAT. Ce protocole optimise les techniques de traitement tissulaire et de différenciation cellulaire pour la culture d’adipocytes périaortiques obtenus à partir de jeunes souris.
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Protocol
Les protocoles pour animaux ont été approuvés par le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux de l’hôpital thoracique de Shanghai, affilié à la faculté de médecine de l’Université Jiao Tong de Shanghai (numéro d’approbation : KS23010) et étaient conformes aux réglementations éthiques pertinentes. Les souris mâles et femelles C57BL/6 âgées de 4 à 8 semaines sont à privilégier pour cette expérience.
1. Préparation des outils chirurgicaux, des tampons et des milieux de culture
- Autoclaver les outils chirurgicaux (p. ex., ciseaux chirurgicaux et pinces standard) à 121 °C pendant 30 min. Désinfecter les instruments microchirurgicaux avec de l’alcool à 75 %.
- Préparer une solution saline stérile tamponnée au phosphate (PBS) additionnée de 1 % v/v de pénicilline-streptomycine et 10 mL de PBS additionnée de 10 % v/v de pénicilline-streptomycine.
REMARQUE : Dans les sections suivantes, si elle n’est pas spécifiquement mentionnée, PBS fait référence à PBS stérile ordinaire. - Préparer le tampon Krebs Ringer HEPES BSA : 1 % d’albumine sérique bovine (BSA), 20 mM d’HEPES dissous dans une solution Krebs Ringer.
- Préparer une solution de digestion fraîche : collagénase de type 1 (1 mg/mL) et dispase II (4 mg/mL) dissoutes dans le tampon Krebs Ringer HEPES BSA. Stériliser la solution à l’aide d’un filtre de 0,2 μm.
- Préparez une plaque à 12 puits enrobée de collagène.
- Diluer la solution de collagène (1 mg/mL) avec de l’eau stérile déminéralisée à la concentration de 40 μg/mL. Ajouter 1 mL de la solution de collagène diluée à la surface de chaque puits pour obtenir une concentration de 6 à 10 μg/cm2. Incuber l’enrobage pendant 1 h à température ambiante.
- Retirez le reste de la solution et rincez chaque puits 2 fois avec 1 mL de PBS. Utilisez la plaque immédiatement ou séchez-la à l’air libre dans une hotte à flux laminaire de classe II et stockez la plaque revêtue à une température comprise entre 2 et 8 °C. Lors du stockage, scellez les plaques revêtues avec du parafilm.
- Milieu de culture : milieu d’aigles modifié par Dulbecco (DMEM) à haute teneur en glucose, sérum de veau fœtal (FBS) à 10 %, pénicilline-streptomycine à 1 % v/v. Conserver à 4 °C jusqu’à 2 semaines.
- Préparer un milieu d’induction lipogénique : DMEM à haute teneur en glucose, FBS à 10 %, pénicilline-streptomycine à 1 v/v, triiodothyronine à 1 nM, rosiglitazone à 1 μM, insuline à 1 μM, 3-isobutyl-1-méthylxanthine (IBMX) à 0,5 mM et dexaméthasone à 1 μM. Conserver à 4 °C jusqu’à 2 semaines.
- Préparer le milieu d’entretien : DMEM à haute teneur en glucose, 10 % de FBS, 1 % v/v de pénicilline-streptomycine, 1 nM de triiodothyronine, 1 μM de rosiglitazone et 1 μM d’insuline. Conserver à 4 °C jusqu’à 2 semaines.
2. Dissection et isolement du tissu adipeux périvasculaire (TVAP)
- Euthanasier la souris par luxation cervicale sous anesthésie à 2 % d’isoflurane ou par surdosage en dioxyde de carbone. Vaporiser avec de l’alcool à 75% pour la désinfection de la peau.
- Placez la souris en décubitus dorsal (face vers le haut).
- Soulevez la peau, faites une petite incision et séparez carrément la peau et les muscles abdominaux avec des ciseaux chirurgicaux le long de la ligne médiane ventrale, du bassin au cou. Exposez le cœur et les poumons en coupant le diaphragme et les côtes des deux côtés de la ligne médiane.
- Retirez soigneusement le foie, la rate, les intestins et les reins. Évitez de couper la paroi intestinale.
- Retirez les poumons et l’œsophage.
- Soulevez doucement le cœur avec une pince dans une main et séparez l’aorte de la colonne vertébrale avec des ciseaux chirurgicaux dans l’autre main. Ensuite, placez le cœur et l’aorte dans une boîte de Pétri de 60 mm avec du PBS contenant 1 % v/v de pénicilline-streptomycine.
- Retirer les pinces microchirurgicales et les ciseaux microchirurgicaux de l’alcool et rincer dans 25 ml de PBS pour éliminer l’excès d’alcool. À l’aide d’un microscope stéréoscopique, retirez le thymus et d’autres tissus du cœur et de l’aorte, puis retirez le cœur, en laissant l’aorte avec les TVAP.
- Transférez l’aorte avec les PVAT dans une boîte de Pétri propre de 60 mm avec du PBS contenant 1 % v/v de pénicilline-streptomycine.
- Utilisez des pinces microchirurgicales pour enlever les PVAT, avec une paire de pinces fixant l’aorte et l’autre retirant le tissu adipeux. Retirez le tissu vasculaire autant que possible tout en minimisant les dommages au tissu adipeux périvasculaire.
- Recueillir la PVAT entourant l’aorte thoracique dans le tube de microcentrifugation de 2 mL contenant du DMEM à haute teneur en glucose complété par de la pénicilline-streptomycine à 1 % v/v placé sur de la glace.
3. Isolement de la fraction vasculaire stromale (FVS)
- Rincez séquentiellement les tissus prélevés avec du PBS contenant 10 % v/v de pénicilline-streptomycine et du PBS contenant 1 % v/v de pénicilline-streptomycine.
REMARQUE : À partir de cette étape, toutes les expériences doivent être effectuées dans des conditions stériles dans une hotte à flux laminaire de classe II. - Transférez les tissus dans une boîte de Pétri stérile de 60 mm, ajoutez 200 μL de solution de digestion et hachez-les en3 morceaux de 1 mm à l’aide de ciseaux stériles.
- Transférez le mélange dans un tube à centrifuger de 15 mL à l’aide d’un embout de pipette en plastique, l’extrémité élargie par une coupe en ciseaux stérile, et ajoutez 6 mL de solution de digestion pour démarrer la réaction de digestion.
REMARQUE : Une réaction de digestion (3 mL de solution de digestion) est suffisante pour les dépôts de PVAT de six souris. - Incuber les tissus à 37 °C dans un incubateur avec un agitateur orbital (fréquence de 150 tr/min pour un mélange efficace) pendant 30 à 45 min. Attachez les tubes à plat sur une grille pour les faire trembler horizontalement. Agiter vigoureusement de haut en bas à la main pendant 10 s toutes les 5 à 10 minutes.
REMARQUE : La digestion peut être interrompue lorsqu’un liquide digestif homogène et jaunâtre est observé sans fragments de tissu. - Filtrer les tissus digérés à travers une crépine cellulaire de 70 μm dans un tube à centrifuger de 50 ml. Rincez la crépine cellulaire avec un volume égal de milieu de culture pour maximiser le rendement cellulaire et arrêter la digestion.
- Transvaser le filtrat dans un nouveau tube à centrifuger de 15 mL et centrifuger à 1 800 × g pendant 10 min. Retournez le tube pour éliminer le surnageant et remettre les pastilles en suspension dans 5 mL de PBS. Centrifuger à 1 800 × g pendant 5 min.
- Éliminez le surnageant en retournant le tube et remettez les pastilles en suspension dans un volume approprié de milieu de culture.
REMARQUE : Les pastilles cellulaires prélevées sur six souris sont remises en suspension dans 1 mL de milieu de culture et ensemencées dans un puits d’une plaque de 12 puits. - Ensemencez les cellules dans une plaque à 12 puits recouverte de collagène et incubez-les à 37 °C dans une atmosphère humide avec 5 % de CO2 pendant la nuit.
- Le lendemain, aspirer le milieu de culture, laver les cellules avec du PBS préchauffé (37 °C) contenant 1 % v/v de pénicilline-streptomycine pour éliminer les débris cellulaires et les globules rouges, et ajouter 1 mL de milieu de culture frais à chaque puits.
4. Induction adipogénique de préadipocytes dérivés de SVF à partir du tissu adipeux périaortique
- Changez le milieu de culture tous les deux jours jusqu’à ce que les cellules atteignent ~60-70% de confluence.
REMARQUE : Il faut généralement 3 à 4 jours pour que les cellules atteignent 60 à 70% de confluence. - Lorsque les cellules atteignent 60 à 70 % de confluence, aspirez le milieu de culture et remplacez-le par un milieu d’induction adipogénique brun. Considérons le jour de l’induction de la différenciation adipogénique comme le jour 0 de la différenciation.
- Après 72 h (jour 3 de différenciation), rafraîchir le milieu avec du milieu d’entretien. Changez le milieu d’entretien tous les 2 jours jusqu’à ce que les cellules soient utilisées pour les expériences.
- Analysez les cellules adipogéniques de manière appropriée, comme la coloration Oil Red O14 et le western blot15.
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Representative Results
À l’aide de ce protocole décrit ci-dessus, nous avons soigneusement isolé les PVAT entourant les aortes thoraciques de souris (Figure 1A-D). Après avoir lavé et haché les PVAT en petits morceaux à l’aide de ciseaux stériles (Figure 1E,F), des fragments de tissu ont été digérés dans une solution de digestion contenant de la collagénase de type 1 (1 mg/mL) et de la dispase II (4 mg/mL) et incubés à 37 °C sur un agitateur pendant 30 à 45 min (Figure 1G). Les tissus digérés ont été filtrés à travers une crépine cellulaire de 70 μm dans un tube à centrifuger de 50 ml (figure 1H). Les pastilles cellulaires ont été recueillies après centrifugation (figure 1I).
Pour confirmer le potentiel adipogénique des préadipocytes dérivés de SVF, nous avons induit les cellules avec un milieu d’induction adipogénique brun contenant 1 nM de triiodothyronine, 1 μM de rosiglitazone, 1 μM d’insuline, 0,5 mM d’IBMX et 1 μM de dexaméthasone. Des adipocytes matures ont été observés après 7 à 10 jours d’induction adipogénique brune, caractérisée par la formation de vacuoles riches en lipides colorées en rouge O (Figure 2A). L’analyse par transfert Western a en outre montré l’augmentation des niveaux d’expression des protéines spécifiques des adipocytes, y compris l’adiponectine, Fabp4, Pgc1α, Pparγ, Ucp1 et la protéine mitochondriale Cox IV (Figure 2B, C). Ces données suggèrent que les préadipocytes dérivés de SVF du tissu adipeux périaortique de souris présentent un fort potentiel adipogénique.
Figure 1 : Isolement de la fraction vasculaire stromale du tissu adipeux périaortique de souris. (A) Le cœur et l’aorte sont soigneusement disséqués à l’aide de pinces chirurgicales et de ciseaux. Les pointes de flèche blanches et jaunes indiquent respectivement le cœur et l’aorte. (B) Les PVAT entourant l’aorte thoracique sont soigneusement enlevées à l’aide de forceps. (C) L’aorte est partie après l’ablation de la PVAT entourant l’aorte thoracique. (D) Les TVAP sont recueillies dans un tube de microcentrifugation de 2 mL contenant du DMEM à haute teneur en glucose avec 1 % v/v de pénicilline-streptomycine. (E) Les TVAP sont rincées séquentiellement avec du PBS contenant 10 % v/v de pénicilline-streptomycine et du PBS contenant 1 % v/v de pénicilline-streptomycine. (F) Hacher les PVAT en3 morceaux de 1 mm à l’aide de ciseaux stériles. (G) Transférer les PVAT hachés dans un tube à centrifuger de 15 mL contenant 6 mL de solution de digestion et incuber les tissus à 37 °C pendant 30 à 45 min en agitant à 150 tr/min. (H) Arrêter la digestion et filtrer la suspension à travers une crépine de 70 μm jusqu’à un tube à centrifuger de 50 mL. (I) Centrifuger le filtrat à 1 800 × g pendant 10 min ; la SVF a été isolée. Abréviations : PVAT = tissu adipeux périvasculaire ; SVF = fraction vasculaire stromale. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Différenciation adipogénique de la fraction vasculaire stromale du tissu adipeux périaortique de souris. (A) Images représentatives du microscope optique et de la coloration au rouge d’huile des adipocytes primaires différenciés des préadipocytes périaortiques au jour 8. Barres d’échelle = 200 μm. (B,C) Analyse par Western blot des taux de protéines d’adiponectine, Fabp4, Pgc1α, Pparγ, Cox IV et Ucp1 pour les adipocytes primaires différenciés des préadipocytes périaortiques au jour 8. Des tests t bilatéraux de Student non appariés ont été utilisés pour calculer les différences significatives entre les deux groupes. Les valeurs sont moyennes ± SEM. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
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Discussion
Nous proposons une approche pratique et réalisable pour l’isolement et l’induction adipogénique de préadipocytes dérivés de SVF à partir de tissu adipeux périaortique de souris. Les avantages de ce protocole sont qu’il est simple et économique. Un nombre adéquat de souris est essentiel pour un isolement réussi, car un tissu insuffisant peut entraîner une faible densité de SVF et un mauvais état de croissance, affectant finalement l’efficacité lipogénique. De plus, l’âge de la souris est un facteur important à prendre en compte, car le potentiel adipogénique de la SVF diminue avec l’âge. Il est essentiel de séparer rapidement et soigneusement les PVAT tout en minimisant la contamination du système vasculaire. La solution de digestion est également un élément clé car l’ajout de dispase II à la collagénase de type 1 peut améliorer le taux de digestion et le rendement des cellules. Il est important de porter une attention particulière au processus de digestion pour éviter la surdigestion car elle peut potentiellement affecter la viabilité cellulaire. Il est essentiel de suivre des techniques stériles et de maintenir des conditions de culture appropriées tout au long du protocole.
Les cultures primaires d’adipocytes périaortiques sont précieuses pour l’étude des propriétés et des fonctions de la PVAT. L’isolement et l’induction adipogénique de préadipocytes dérivés de SVF à partir de tissu adipeux périaortique de souris génétiquement modifiées fournissent une plate-forme pour explorer l’important régulateur de la différenciation PVAT et de l’adipogenèse in vitro. Le PVAT est un modulateur de la vasoconstriction et du remodelage vasculaire de manière externe vers l’intérieur, en générant des molécules vasoactives telles que le peroxyde d’hydrogène, l’adiponectine, l’angiotensine 1-7, le palmitate de méthyle, le sulfure d’hydrogène, l’oxyde nitrique et la leptine3. Cette méthode présentée permet d’étudier plus en détail la diaphonie entre les adipocytes périaortiques et les cellules endothéliales 16, les cellules musculaires lisses vasculaires (VSMCs)17, les fibroblastes adventiaux 18 ou les macrophages 19, ce qui permet de mieux comprendre les rôles centraux de la PVAT dans la pathogenèse des maladies cardiovasculaires telles que l’hypertension, l’athérosclérose, la sténose et les anévrismes20,21,22.
De plus, l’isolement et l’induction adipogénique des préadipocytes sont les bases de l’étude des lignées PVAT et de l’hétérogénéité PVAT. Les PVAT sont des lits intervasculaires et intravasculaires hétérogènes, se manifestant par des profils transcriptionnels distincts, qui peuvent contribuer à des caractéristiques fonctionnelles physiologiques et pathologiques distinctes20,23. Chang et al. ont rapporté que les souris présentant une délétion de PPARγ spécifique à VSMC manquaient de PVAT dans les régions aortique et mésentérique, ce qui indique que le PVAT pourrait partager les mêmes origines embryonnaires avec la paroi vasculaire locale24. Il existe des preuves que les PVAT d’origines embryonnaires différentes peuvent avoir des phénotypes différents25,26. La PVAT entourant l’aorte ascendante et l’arc aortique (AA-PVAT), dérivée des cellules de la crête neurale d’origine ectodermique, est morphologiquement et transcriptomiquement plus similaire au tissu adipeux brun (BAT)27. En conséquence, le SVF de PVAT dérivé des cellules de la crête neurale a tendance à se différencier en adipocytes bruns plus facilement que les adipocytes blancs in vitro28. L’aorte abdominale PVAT, cependant, présente principalement un phénotype29 semblable à celui du tissu adipeux blanc. Un phénotype de type MTD de la PVAT ou le beiging de la PVAT est associé à des effets anti-inflammatoires et antipathologiques, ce qui permet de mettre en lumière le traitement des maladies cardiovasculaires par le biais de la modulation du phénotype de la PVAT19,30. Ce protocole constituera la pierre angulaire technologique du côté du banc.
Néanmoins, il existe certaines limites à ce protocole. En raison de la disponibilité limitée de la PVAT, l’extraction de la PVAT-SVF nécessite un plus grand nombre de souris. Dans les situations où il y a une forte demande de SVF, il peut être nécessaire d’engager plus d’une personne pour accélérer le progrès expérimental. Par rapport aux préadipocytes immortalisés, les préadipocytes dérivés de SVF nécessitent des ressources humaines et matérielles supplémentaires.
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Disclosures
Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts, financier ou autre, à déclarer.
Acknowledgments
Ces travaux ont été soutenus par la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (82130012 et 81830010) et les projets Nurture pour la recherche fondamentale de l’hôpital thoracique de Shanghai (numéro de subvention : 2022YNJCQ03).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2 μm syringe filters | PALL | 4612 | |
| 12-well plate | Labselect | 11210 | |
| 15 mL centrifuge tube | Labserv | 310109003 | |
| 3,3',5-triiodo-L-thyronine (T3) | Sigma-Aldrich | T-2877 | 1 nM |
| 50 mL centrifuge tube | Labselect | CT-002-50A | |
| anti-adiponectin | Abcam | ab22554 | 1:1,000 working concentration |
| anti-COX IV | CST | 4850 | 1:1,000 working concentration |
| anti-FABP4 | CST | 2120 | 1:1,000 working concentration |
| anti-PGC1α | Abcam | ab191838 | 1:1,000 working concentration |
| anti-PPARγ | Invitrogen | MA5-14889 | 1:1,000 working concentration |
| anti-UCP1 | Abcam | ab10983 | 1:1,000 working concentration |
| anti-α-Actinin | CST | 6487 | 1:1,000 working concentration |
| BSA | Beyotime | ST023-200g | 1% |
| C57BL/6 mice aged 4-8 weeks of both sexes | Shanghai Model Organisms Center, Inc. | ||
| Cell Strainer 70 µm, nylon | Falcon | 352350 | |
| Collagen from calf skin | Sigma-Aldrich | C8919 | |
| Collagenase, Type 1 | Worthington | LS004196 | 1 mg/mL |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D1756 | 1 μM |
| Dispase II | Sigma-Aldrich | D4693-1G | 4 mg/mL |
| Fetal bovine serum | Gibco | 16000-044 | 10% |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034-25G | 20 mM |
| High glucose DMEM | Hyclone | SH30022.01 | |
| IBMX | Sigma-Aldrich | I7018 | 0.5 mM |
| Incubator with orbital shaker | Shanghai longyue Instrument Eruipment Co.,Ltd. | LYZ-103B | |
| Insulin (cattle) | Sigma-Aldrich | 11070-73-8 | 1 μM |
| Isoflurane | RWD | R510-22-10 | |
| Krebs-Ringer's Solution | Pricella | PB180347 | protect from light |
| Microsurgical forceps | Beyotime | FS233 | |
| Microsurgical scissor | Beyotime | FS217 | |
| Oil Red O | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd | A600395-0050 | |
| PBS (Phosphate-buffered saline) | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd | B548117-0500 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 115-035-146 | 1:5,000 working concentration |
| Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 111-035-144 | 1:5,000 working concentration |
| Rosiglitazone | Sigma-Aldrich | R2408 | 1 μM |
| Standard forceps | Beyotime | FS225 | |
| Surgical scissor | Beyotime | FS001 |
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