Summary
Descrevemos o isolamento, a cultura e a indução adipogênica de pré-adipócitos derivados da fração vascular estromal do tecido adiposo periaórtico de camundongos, permitindo o estudo da função do tecido adiposo perivascular e sua relação com as células vasculares.
Abstract
O tecido adiposo perivascular (PVAT) é um depósito de tecido adiposo que envolve os vasos sanguíneos e exibe os fenótipos de adipócitos brancos, beges e marrons. Descobertas recentes têm lançado luz sobre o papel central do PVAT na regulação da homeostase vascular e participação na patogênese das doenças cardiovasculares. Uma compreensão abrangente das propriedades e regulação do PVAT é de grande importância para o desenvolvimento de terapias futuras. Culturas primárias de adipócitos periaórticos são valiosas para estudar a função do PVAT e o crosstalk entre adipócitos periaórticos e células vasculares. Este trabalho apresenta um protocolo econômico e viável para o isolamento, cultura e indução adipogênica de pré-adipócitos derivados da fração vascular estromal do tecido adiposo periaórtico de camundongos, que pode ser útil para modelar adipogênese ou lipogênese in vitro. O protocolo descreve o processamento tecidual e a diferenciação celular para a cultura de adipócitos periaórticos de camundongos jovens. Este protocolo fornecerá a pedra angular tecnológica no lado da bancada para a investigação da função PVAT.
Introduction
Acredita-se que o tecido adiposo perivascular (PVAT), uma estrutura perivascular composta por uma mistura de adipócitos maduros e uma fração vascular estromal (FVS), interaja com a parede do vaso adjacente através de seu secretoma paracrineamente1. Como regulador crítico da homeostase vascular, a disfunção do PVAT está implicada na patogênese das doençascardiovasculares2,3,4. A FNS do tecido adipocitário consiste de várias populações celulares esperadas, incluindo células endoteliais, células imunes, células mesoteliais, células neuronais e células-tronco adiposas e progenitoras (ASPCs)5,6. Sabe-se que as ASPCs residentes na FVS do tecido adiposo podem dar origem a adipócitos maduros5. Infere-se que a FVS seja uma fonte crítica de adipócitos maduros em PVAT. Vários estudos têm demonstrado que o PVAT-SVF pode se diferenciar em adipócitos maduros sob condições específicas de indução 6,7,8.
Atualmente, existem dois sistemas de isolamento para isolar a FSV do tecido adiposo, um é a digestão enzimática e o outro é o nãoenzimático9. Métodos enzimáticos tipicamente resultam em maior rendimento de células progenitoras nucleadas10. Até o momento, os benefícios da FVS em promover regeneração vascular e neovascularização na cicatrização de feridas, doenças urogenitais e cardiovasculares têm sido amplamente demonstrados11, especialmente na dermatologia e na cirurgiaplástica12,13. No entanto, as perspectivas de aplicação clínica da FV derivada do PVAT ainda não foram bem exploradas, o que pode ser atribuído à falta de um método padronizado para o isolamento da FVS do PVAT. O objetivo deste protocolo é estabelecer uma abordagem padronizada para o isolamento, cultura e indução adipogênica de pré-adipócitos derivados da FVA a partir de PVAT de camundongos ao redor da aorta torácica, permitindo uma investigação mais aprofundada da função da PVAT. Este protocolo otimiza técnicas de processamento tecidual e diferenciação celular para cultura de adipócitos periaórticos obtidos de camundongos jovens.
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Protocol
Os protocolos em animais foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais do Shanghai Chest Hospital, afiliado à Escola de Medicina da Universidade Jiao Tong de Xangai (número de aprovação: KS23010) e estavam em conformidade com os regulamentos éticos relevantes. Camundongos C57BL/6 machos e fêmeas com idade entre 4-8 semanas devem ser preferidos para este experimento.
1. Preparo de instrumentais cirúrgicos, tampões e meios de cultura
- Ferramentas cirúrgicas em autoclave (por exemplo, tesoura cirúrgica e pinça padrão) a 121 °C por 30 min. Desinfetar os instrumentos microcirúrgicos com álcool a 75%.
- Preparar solução salina estéril tamponada com fosfato (PBS) suplementada com penicilina-estreptomicina a 1% v/v e mais 10 mL de PBS suplementado com penicilina-estreptomicina a 10% v/v.
NOTA: Nas seções a seguir, se não for especificamente mencionado, PBS refere-se a PBS estéril regular. - Preparar tampão Krebs Ringer HEPES BSA: albumina de soro bovino (BSA) a 1%, HEPES 20 mM dissolvido em solução de Krebs Ringer.
- Preparar solução de digestão fresca: colagenase tipo 1 (1 mg/mL) e dispase II (4 mg/mL) dissolvida em tampão Krebs Ringer HEPES BSA. Esterilizar a solução com um filtro de 0,2 μm.
- Prepare uma placa de 12 poços revestida de colágeno.
- Diluir a solução de colágeno (1 mg/mL) com água deionizada estéril até a concentração de 40 μg/mL. Adicionar 1 ml da solução de colagénio diluída na superfície de cada poço para atingir uma concentração de 6-10 μg/cm2. Incubar o revestimento durante 1 h à temperatura ambiente.
- Retire a solução restante e lave cada poço 2x com 1 mL de PBS. Use a placa imediatamente ou seque a placa ao ar em uma capela de fluxo laminar classe II e armazene a placa revestida a 2-8 °C. Ao armazenar, sele as placas revestidas com parafilme.
- Preparar meio de cultura: meio Dulbecco's Modified Eagles (DMEM) com alto teor de glicose, 10% de soro fetal bovino (FBS), 1% v/v penicilina-estreptomicina. Manter a 4 °C até 2 semanas.
- Preparar meio de indução lipogênico: DMEM de alta glicose, FBS a 10%, penicilina-estreptomicina 1% v/v, triiodotironina 1 nM, rosiglitazona 1 μM, insulina 1 μM, 3-isobutil-1-metilxantina 0,5 mM (IBMX) e dexametasona 1 μM. Manter a 4 °C até 2 semanas.
- Preparar meio de manutenção: DMEM de alta glicose, FBS a 10%, penicilina-estreptomicina a 1% v/v, triiodotironina 1 nM, rosiglitazona 1 μM e insulina a 1 μM. Manter a 4 °C até 2 semanas.
2. Dissecção e isolamento do tecido adiposo perivascular (PVAT)
- Eutanásia do camundongo por luxação cervical sob anestesia com isoflurano a 2% ou com overdose de dióxido de carbono. Borrifar com álcool 75% para desinfecção da pele.
- Coloque o rato em decúbito dorsal horizontal (virado para cima).
- Levante a pele, faça uma pequena incisão e separe sem rodeios a pele e os músculos abdominais com uma tesoura cirúrgica ao longo da linha média ventral da pelve até o pescoço. Exponha o coração e os pulmões cortando o diafragma e as costelas ao longo de ambos os lados da linha média.
- Remova cuidadosamente o fígado, baço, intestinos e rins. Evite cortar a parede intestinal.
- Remova os pulmões e o esôfago.
- Levante suavemente o coração com pinça em uma mão e separe a aorta da coluna vertebral com tesoura cirúrgica na outra mão. Em seguida, colocar o coração e a aorta em uma placa de Petri de 60 mm com PBS contendo penicilina-estreptomicina a 1% v/v.
- Retire a pinça microcirúrgica e a tesoura microcirúrgica do álcool e enxágue em 25 mL de PBS para remover o excesso de álcool. Sob um microscópio estéreo, remova o timo e outros tecidos do coração e da aorta, em seguida, remova o coração, deixando a aorta com os PVATs.
- Transferir a aorta com os PVATs para uma placa de Petri limpa de 60 mm com PBS contendo 1% v/v de penicilina-estreptomicina.
- Utilizar pinças microcirúrgicas para retirar os PVATs, com um par de pinças fixando a aorta e a outra arrancando o tecido adiposo. Remova o tecido da vasculatura tanto quanto possível, minimizando os danos ao tecido adiposo perivascular.
- Coletar o PVAT ao redor da aorta torácica no tubo de microcentrífuga de 2 mL contendo DMEM com alto teor de glicose suplementado com penicilina-estreptomicina a 1% v/v colocado sobre gelo.
3. Isolamento da fração vascular estromal (FVS)
- Enxaguar sequencialmente os tecidos coletados com PBS contendo penicilina-estreptomicina a 10% v/v e PBS contendo penicilina-estreptomicina a 1% v/v.
NOTA: A partir desta etapa, todos os experimentos devem ser realizados em condições estéreis em uma capela de fluxo laminar classe II. - Transfira os tecidos para uma placa de Petri estéril de 60 mm, adicione 200 μL de solução de digestão e pique-os em pedaços de 1 mm3 usando tesoura estéril.
- Transfira a mistura para um tubo de centrífuga de 15 mL usando uma ponta de pipeta de plástico, a extremidade alargada por um corte de tesoura estéril, e adicione 6 mL de solução de digestão para iniciar a reação de digestão.
NOTA: Uma reação de digestão (3 mL de solução de digestão) é suficiente para depósitos de PVAT de seis camundongos. - Incubar os tecidos a 37 °C numa estufa com um agitador orbital (frequência de 150 rpm para uma mistura eficaz) durante 30-45 minutos. Amarre os tubos em um rack para fazer os tubos tremerem horizontalmente. Agite para cima e para baixo vigorosamente com a mão por 10 s a cada 5-10 min.
NOTA: A digestão pode ser interrompida quando um fluido digestivo homogêneo e amarelado é visto sem fragmentos de tecido restantes. - Coar os tecidos digeridos através de um filtro celular de 70 μm em um tubo de centrífuga de 50 mL. Enxaguar o filtro celular com um volume igual de meio de cultura para maximizar o rendimento celular e interromper a digestão.
- Transfira o filtrado para um novo tubo de centrífuga de 15 mL e centrífuga a 1.800 × g por 10 min. Inverter o tubo para descartar o sobrenadante e ressuspender os pellets em 5 mL de PBS. Centrifugar a 1.800 × g por 5 min.
- Descarte o sobrenadante invertendo o tubo e ressuspenda os pellets em volume apropriado de meio de cultura.
NOTA: Os pellets celulares coletados de cada seis camundongos são ressuspensos em 1 mL de meio de cultura e semeados em um poço de uma placa de 12 poços. - Semeando as células em uma placa de 12 poços revestida de colágeno e incubar a 37 °C em uma atmosfera úmida com 5% de CO2 durante a noite.
- No dia seguinte, aspirar o meio de cultura, lavar as células com PBS pré-aquecido (37 °C) contendo penicilina-estreptomicina a 1% v/v para remover restos celulares e hemácias e adicionar de volta 1 mL de meio de cultura fresco em cada poço.
4. Indução adipogênica de pré-adipócitos derivados da FVA do tecido adiposo periaórtico
- Troque o meio de cultura a cada dois dias até que as células atinjam ~60-70% de confluência.
NOTA: Geralmente leva 3-4 dias para que as células atinjam 60-70% de confluência. - Quando as células atingirem 60-70% de confluência, aspirar o meio de cultura e substituí-lo por meio de indução adipogênico marrom. Considerar o dia de indução da diferenciação adipogênica como o dia 0 da diferenciação.
- Após 72 h (dia 3 de diferenciação), refrescar o meio com o meio de manutenção. Troque o meio de manutenção a cada 2 dias até que as células sejam usadas para experimentos.
- Analisar as células adipogênicas de forma adequada, como coloração Oil Red O14 e western blotting15.
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Representative Results
Usando este protocolo descrito acima, isolamos cuidadosamente os PVATs ao redor de aortas torácicas de camundongos (Figura 1A-D). Após lavagem e picagem dos PVATs em pequenos pedaços com tesoura estéril (Figura 1E,F), os fragmentos de tecido foram digeridos em solução de digestão contendo colagenase tipo 1 (1 mg/mL) e dispase II (4 mg/mL) e incubados a 37 °C em agitador por 30-45 min (Figura 1G). Os tecidos digeridos foram coados através de um filtro celular de 70 μm em um tubo centrífugo de 50 mL (Figura 1H). Os pellets celulares foram coletados após centrifugação (Figura 1I).
Para confirmar o potencial adipogênico dos pré-adipócitos derivados da SVF, induzimos as células com meio de indução adipogênico marrom contendo 1 nM de triiodotironina, 1 μM de rosiglitazona, 1 μM de insulina, 0,5 mM de IBMX e 1 μM de dexametasona. Adpócitos maduros foram observados após 7-10 dias de indução adipogênica marrom, caracterizados pela formação de vacúolos ricos em lipídios corados com Oil Red O (Figura 2A). A análise de Western blotting mostrou ainda o aumento dos níveis de expressão de proteínas específicas de adipócitos, incluindo adiponectina, Fabp4, Pgc1α, Pparγ, Ucp1 e proteína mitocondrial Cox IV (Figura 2B,C). Esses dados sugerem que os pré-adipócitos derivados da FVA do tecido adiposo periaórtico de camundongos exibem forte potencial adipogênico.
Figura 1: Isolamento da fração vascular estromal do tecido adiposo periaórtico de camundongos . (A) O coração e a aorta são cuidadosamente dissecados com pinça cirúrgica e tesoura. As pontas de setas brancas e amarelas indicam o coração e a aorta, respectivamente. (B) Os PVATs ao redor da aorta torácica são cuidadosamente retirados com pinças. (C) A aorta saiu após a remoção do PVAT ao redor da aorta torácica. (D) Os PVATs são coletados em um tubo de microcentrífuga de 2 mL contendo DMEM com glicose a 1% v/v de penicilina-estreptomicina. (E) Os PVATs são lavados sequencialmente com PBS contendo penicilina-estreptomicina a 10% v/v e PBS contendo penicilina-estreptomicina a 1% v/v. (F) Picada dos PVATs em pedaços de 1 mm3 usando tesoura estéril. (G) Transferir os PVATs picados para um tubo de centrífuga de 15 mL contendo 6 mL de solução de digestão e incubar os tecidos a 37 °C por 30-45 min com agitação a 150 rpm. (H) Interromper a digestão e filtrar a suspensão através de um filtro de células de 70 μm para um tubo centrífugo de 50 mL. (I) Centrifugar o filtrado a 1.800 × g por 10 min; a FVS foi isolada. Abreviações: PVAT = tecido adiposo perivascular; FVS = fração vascular estromal. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Diferenciação adipogênica da fração vascular estromal do tecido adiposo periaórtico de camundongos . (A) Imagens representativas do microscópio de luz e coloração Oil Red O dos adipócitos primários diferenciaram-se dos pré-adipócitos periaórticos no 8º dia. Barras de escala = 200 μm. (B,C) Análise por Western blotting dos níveis proteicos de adiponectina, Fabp4, Pgc1α, Pparγ, Cox IV e Ucp1 para adipócitos primários diferenciados de pré-adipócitos periaórticos no 8º dia. O teste t de Student bicaudal não pareado foi usado para calcular diferenças significativas entre os dois grupos. Os valores são médios ± SEM. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Propomos uma abordagem prática e viável para o isolamento e indução adipogênica de pré-adipócitos derivados da FSV do tecido adiposo periaórtico de camundongos. As vantagens deste protocolo são que ele é simples e econômico. Um número adequado de camundongos é crítico para o sucesso do isolamento, pois tecido insuficiente pode resultar em baixa densidade de FSV e baixo estado de crescimento, afetando a eficiência lipogênica. Além disso, a idade dos camundongos é um fator importante a ser considerado, pois o potencial adipogênico da FVS diminui com a idade. A separação rápida e cuidadosa do PVAT minimizando a contaminação da vasculatura é crucial. A solução de digestão também é um componente chave, pois a adição de dispase II à colagenase tipo 1 pode melhorar a taxa de digestão e o rendimento das células. É importante prestar muita atenção ao processo de digestão para evitar a superdigestão, pois pode afetar potencialmente a viabilidade celular. Seguir técnicas estéreis e manter condições adequadas de cultura durante todo o protocolo é essencial.
Culturas primárias de adipócitos periaórticos são valiosas para o estudo das propriedades e funções do PVAT. O isolamento e a indução adipogênica de pré-adipócitos derivados da FVA do tecido adiposo periaórtico de camundongos geneticamente modificados fornecem uma plataforma para explorar o importante regulador da diferenciação do PVAT e da adipogênese in vitro. O PVAT é um modulador da vasoconstrição e do remodelamento vascular de forma externa para interna, gerando moléculas vasoativas como peróxido de hidrogênio, adiponectina, angiotensina 1-7, palmitato de metila, sulfeto de hidrogênio, óxido nítrico e leptina3. Este método apresentado permite aprofundar o estudo do crosstalk entre adipócitos periaórticos e células endoteliais16, células musculares lisas vasculares (CMLVs)17, fibroblastos adventiciais18 ou macrófagos19, fornecendo informações sobre os papéis centrais do PVAT na patogênese de doenças cardiovasculares como hipertensão, aterosclerose, estenose e aneurismas20,21,22.
Além disso, o isolamento adipogênico e a indução de pré-adipócitos são as bases para estudar linhagens de PVAT e heterogeneidade de PBAT. Os PVATs são leitos inter e intravasculares heterogêneos, manifestando-se como perfis transcricionais distintos, que podem contribuir para características funcionais fisiológicas e patológicas distintas20,23. Chang e col. relataram que camundongos com deleção PPARγ específica para CMLV não apresentavam PVAT nas regiões aórtica e mesentérica, indicando que o PVAT pode compartilhar as mesmas origens embrionárias com a parede vascular local24. Há evidências de que o PVAT de diferentes origens embrionárias pode ter fenótipos diferentes25,26. O PVAT ao redor da aorta ascendente e arco aórtico (AA-PVAT), derivado das células da crista neural de origem ectodérmica, é morfológica e transcriptomicamente mais semelhante ao tecido adiposo marrom (BAT)27. Correspondentemente, a FVS do PVAT derivado das células da crista neural tende a diferenciar-se em adipócitos marrons mais prontamente do que adipócitos brancos in vitro28. O PVAT da aorta abdominal, entretanto, exibe primariamente um fenótipo de tecido adiposo branco29. Um fenótipo de PVAT semelhante a um BAT ou o bege de PVAT está associado a efeitos anti-inflamatórios e antipatológicos de remodelamento, esclarecendo o tratamento da doença cardiovascular por meio da modulação do fenótipo do PVAT19,30. Este protocolo fornecerá a pedra angular tecnológica no lado da bancada.
No entanto, existem algumas limitações para esse protocolo. Devido à disponibilidade restrita de PVAT, a extração de PVAT-SVF requer um número maior de camundongos. Em situações em que há uma alta demanda por SVF, pode ser necessário envolver mais de uma pessoa para acelerar o progresso experimental. Comparados aos pré-adipócitos imortalizados, os pré-adipócitos derivados da SVF requerem recursos humanos e materiais adicionais.
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Disclosures
Os autores declaram não haver conflitos de interesse, financeiros ou não.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado pela Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (82130012 e 81830010) e pelos projetos Nurture para pesquisa básica do Shanghai Chest Hospital (Número de Bolsa: 2022YNJCQ03).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2 μm syringe filters | PALL | 4612 | |
| 12-well plate | Labselect | 11210 | |
| 15 mL centrifuge tube | Labserv | 310109003 | |
| 3,3',5-triiodo-L-thyronine (T3) | Sigma-Aldrich | T-2877 | 1 nM |
| 50 mL centrifuge tube | Labselect | CT-002-50A | |
| anti-adiponectin | Abcam | ab22554 | 1:1,000 working concentration |
| anti-COX IV | CST | 4850 | 1:1,000 working concentration |
| anti-FABP4 | CST | 2120 | 1:1,000 working concentration |
| anti-PGC1α | Abcam | ab191838 | 1:1,000 working concentration |
| anti-PPARγ | Invitrogen | MA5-14889 | 1:1,000 working concentration |
| anti-UCP1 | Abcam | ab10983 | 1:1,000 working concentration |
| anti-α-Actinin | CST | 6487 | 1:1,000 working concentration |
| BSA | Beyotime | ST023-200g | 1% |
| C57BL/6 mice aged 4-8 weeks of both sexes | Shanghai Model Organisms Center, Inc. | ||
| Cell Strainer 70 µm, nylon | Falcon | 352350 | |
| Collagen from calf skin | Sigma-Aldrich | C8919 | |
| Collagenase, Type 1 | Worthington | LS004196 | 1 mg/mL |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D1756 | 1 μM |
| Dispase II | Sigma-Aldrich | D4693-1G | 4 mg/mL |
| Fetal bovine serum | Gibco | 16000-044 | 10% |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034-25G | 20 mM |
| High glucose DMEM | Hyclone | SH30022.01 | |
| IBMX | Sigma-Aldrich | I7018 | 0.5 mM |
| Incubator with orbital shaker | Shanghai longyue Instrument Eruipment Co.,Ltd. | LYZ-103B | |
| Insulin (cattle) | Sigma-Aldrich | 11070-73-8 | 1 μM |
| Isoflurane | RWD | R510-22-10 | |
| Krebs-Ringer's Solution | Pricella | PB180347 | protect from light |
| Microsurgical forceps | Beyotime | FS233 | |
| Microsurgical scissor | Beyotime | FS217 | |
| Oil Red O | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd | A600395-0050 | |
| PBS (Phosphate-buffered saline) | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd | B548117-0500 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 115-035-146 | 1:5,000 working concentration |
| Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 111-035-144 | 1:5,000 working concentration |
| Rosiglitazone | Sigma-Aldrich | R2408 | 1 μM |
| Standard forceps | Beyotime | FS225 | |
| Surgical scissor | Beyotime | FS001 |
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