العزلة والثقافة والحث الأديبوجيني للخلايا Preadipocytes المشتقة من جزء الأوعية الدموية اللحمية من الأنسجة الدهنية حول الأبهر للفأر
Summary
هنا ، نصف العزلة والثقافة والحث الشحمي للخلايا preadipocytes preadipocytes المشتقة من جزء الأوعية الدموية اللحمية من الأنسجة الدهنية حول الأبهر الفأر ، مما يسمح بدراسة وظيفة الأنسجة الدهنية المحيطة بالأوعية الدموية وعلاقتها بالخلايا الوعائية.
Abstract
الأنسجة الدهنية المحيطة بالأوعية الدموية (PVAT) هي مستودع للأنسجة الدهنية يحيط بالأوعية الدموية ويعرض الأنماط الظاهرية للخلايا الشحمية البيضاء والبيج والبني. ألقت الاكتشافات الحديثة الضوء على الدور المركزي ل PVAT في تنظيم التوازن الوعائي والمشاركة في التسبب في أمراض القلب والأوعية الدموية. إن الفهم الشامل لخصائص PVAT وتنظيمها له أهمية كبيرة لتطوير العلاجات المستقبلية. تعتبر الثقافات الأولية للخلايا الشحمية المحيطة بالأبهر ذات قيمة لدراسة وظيفة PVAT والحديث المتبادل بين الخلايا الشحمية المحيطة بالأبهر والخلايا الوعائية. تقدم هذه الورقة بروتوكولا اقتصاديا ومجديا للعزل والثقافة والحث الشحمي للخلايا preadipocytes المشتقة من جزء الأوعية الدموية اللحمية من الأنسجة الدهنية حول الأبهر للفأر ، والتي يمكن أن تكون مفيدة لنمذجة تكوين الدهون أو تكوين الدهون في المختبر. يحدد البروتوكول معالجة الأنسجة وتمايز الخلايا لزراعة الخلايا الشحمية حول الأبهر من الفئران الصغيرة. سيوفر هذا البروتوكول حجر الزاوية التكنولوجي في جانب مقاعد البدلاء للتحقيق في وظيفة PVAT.
Introduction
يعتقد أن الأنسجة الدهنية المحيطة بالأوعية الدموية (PVAT) ، وهي بنية حول الأوعية تتكون من خليط من الخلايا الشحمية الناضجة وجزء الأوعية الدموية اللحمية (SVF) ، تتفاعل مع جدار الوعاء المجاور عبر إفرازهابشكل شبه مكراني 1. كمنظم حاسم للتوازن الوعائي ، فإن خلل PVAT متورط في التسبب في أمراض القلب والأوعية الدموية2،3،4. يتكون SVF لأنسجة الخلايا الشحمية من العديد من مجموعات الخلايا المتوقعة ، بما في ذلك الخلايا البطانية والخلايا المناعية وخلايا الظهارة المتوسطة والخلايا العصبية والخلايا الجذعية الدهنية والخلايا السلفية (ASPCs)5,6. من المعروف أن ASPCs المقيمة في SVF للأنسجة الدهنية يمكن أن تؤدي إلى خلايا دهنية ناضجة5. يستدل على SVF ليكون مصدرا مهما للخلايا الشحمية الناضجة في PVAT. أظهرت العديد من الدراسات أن PVAT-SVF يمكن أن يتمايز إلى خلايا دهنية ناضجة في ظل ظروف تحريض محددة6،7،8.
يوجد حاليا نظامان للعزل لعزل SVF عن الأنسجة الدهنية ، أحدهما هو الهضم الأنزيمي والآخر غير الأنزيمي9. تؤدي الطرق الأنزيمية عادة إلى إنتاجية أعلى من الخلايا السلفية النواة10. حتى الآن ، تم إثبات فوائد SVF في تعزيز تجديد الأوعية الدموية والأوعية الدموية الجديدة في التئام الجروح وأمراض الجهاز البولي التناسلي والقلب والأوعية الدموية على نطاق واسع11 ، خاصة في الأمراض الجلدية والجراحة التجميلية12,13. ومع ذلك ، لم يتم استكشاف آفاق التطبيق السريري ل SVF المشتق من PVAT بشكل جيد ، والذي قد يعزى إلى عدم وجود طريقة موحدة لعزل SVF من PVAT. الهدف من هذا البروتوكول هو إنشاء نهج موحد للعزل والثقافة والحث الشحمي للخلايا preadipocytes المشتقة من SVF من PVAT الفأر المحيط بالشريان الأورطي الصدري ، مما يتيح مزيدا من التحقيق في وظيفة PVAT. يعمل هذا البروتوكول على تحسين معالجة الأنسجة وتقنيات تمايز الخلايا لزراعة الخلايا الشحمية حول الأبهر التي تم الحصول عليها من الفئران الصغيرة.
Protocol
Representative Results
Discussion
نقترح نهجا عمليا وممكنا للعزل والحث الشحمي للخلايا preadipocytes المشتقة من SVF من الأنسجة الدهنية حول الأبهر الفأر. مزايا هذا البروتوكول هي أنه بسيط واقتصادي. تعد الأعداد الكافية من الفئران ضرورية للعزل الناجح ، حيث يمكن أن تؤدي الأنسجة غير الكافية إلى انخفاض كثافة SVF وضعف حالة النمو ، مما يؤثر ف…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم هذا العمل من قبل المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (82130012 و 81830010) ومشاريع التنشئة للبحوث الأساسية لمستشفى شنغهاي للصدر (رقم المنحة: 2022YNJCQ03).
Materials
| 0.2 μm syringe filters | PALL | 4612 | |
| 12-well plate | Labselect | 11210 | |
| 15 mL centrifuge tube | Labserv | 310109003 | |
| 3,3',5-triiodo-L-thyronine (T3) | Sigma-Aldrich | T-2877 | 1 nM |
| 50 mL centrifuge tube | Labselect | CT-002-50A | |
| anti-adiponectin | Abcam | ab22554 | 1:1,000 working concentration |
| anti-COX IV | CST | 4850 | 1:1,000 working concentration |
| anti-FABP4 | CST | 2120 | 1:1,000 working concentration |
| anti-PGC1α | Abcam | ab191838 | 1:1,000 working concentration |
| anti-PPARγ | Invitrogen | MA5-14889 | 1:1,000 working concentration |
| anti-UCP1 | Abcam | ab10983 | 1:1,000 working concentration |
| anti-α-Actinin | CST | 6487 | 1:1,000 working concentration |
| BSA | Beyotime | ST023-200g | 1% |
| C57BL/6 mice aged 4-8 weeks of both sexes | Shanghai Model Organisms Center, Inc. | ||
| Cell Strainer 70 µm, nylon | Falcon | 352350 | |
| Collagen from calf skin | Sigma-Aldrich | C8919 | |
| Collagenase, Type 1 | Worthington | LS004196 | 1 mg/mL |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D1756 | 1 μM |
| Dispase II | Sigma-Aldrich | D4693-1G | 4 mg/mL |
| Fetal bovine serum | Gibco | 16000-044 | 10% |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034-25G | 20 mM |
| High glucose DMEM | Hyclone | SH30022.01 | |
| IBMX | Sigma-Aldrich | I7018 | 0.5 mM |
| Incubator with orbital shaker | Shanghai longyue Instrument Eruipment Co.,Ltd. | LYZ-103B | |
| Insulin (cattle) | Sigma-Aldrich | 11070-73-8 | 1 μM |
| Isoflurane | RWD | R510-22-10 | |
| Krebs-Ringer's Solution | Pricella | PB180347 | protect from light |
| Microsurgical forceps | Beyotime | FS233 | |
| Microsurgical scissor | Beyotime | FS217 | |
| Oil Red O | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd | A600395-0050 | |
| PBS (Phosphate-buffered saline) | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd | B548117-0500 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 115-035-146 | 1:5,000 working concentration |
| Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 111-035-144 | 1:5,000 working concentration |
| Rosiglitazone | Sigma-Aldrich | R2408 | 1 μM |
| Standard forceps | Beyotime | FS225 | |
| Surgical scissor | Beyotime | FS001 |
References
- Akoumianakis, I., Antoniades, C. The interplay between adipose tissue and the cardiovascular system: is fat always bad. Cardiovascular Research. 113 (9), 999-1008 (2017).
- Huang, C. L., et al. Thoracic perivascular adipose tissue inhibits VSMC apoptosis and aortic aneurysm formation in mice via the secretome of browning adipocytes. Acta Pharmacologica Sinica. 44 (2), 345-355 (2023).
- Xia, N., Li, H. The role of perivascular adipose tissue in obesity-induced vascular dysfunction. British Journal of Pharmacology. 174 (20), 3425-3442 (2017).
- Brown, N. K., et al. Perivascular adipose tissue in vascular function and disease: a review of current research and animal models. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 34 (8), 1621-1630 (2014).
- Ferrero, R., Rainer, P., Deplancke, B. Toward a consensus view of mammalian adipocyte stem and progenitor cell heterogeneity. Trends in Cell Biology. 30 (12), 937-950 (2020).
- Angueira, A. R., et al. Defining the lineage of thermogenic perivascular adipose tissue. Nature Metabolism. 3 (4), 469-484 (2021).
- Boucher, J. M., et al. Rab27a regulates human perivascular adipose progenitor cell differentiation. Cardiovascular Drugs and Therapy. 32 (5), 519-530 (2018).
- Saxton, S. N., Withers, S. B., Heagerty, A. M. Emerging roles of sympathetic nerves and inflammation in perivascular adipose tissue. Cardiovascular Drugs and Therapy. 33 (2), 245-259 (2019).
- Ferroni, L., De Francesco, F., Pinton, P., Gardin, C., Zavan, B. Methods to isolate adipose tissue-derived stem cells. Methods in Cell Biology. 171, 215-228 (2022).
- Senesi, L., et al. Mechanical and enzymatic procedures to isolate the stromal vascular fraction from adipose tissue: preliminary results. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 7, 88 (2019).
- Andia, I., Maffulli, N., Burgos-Alonso, N. Stromal vascular fraction technologies and clinical applications. Expert Opinion on Biological Therapy. 19 (12), 1289-1305 (2019).
- Suh, A., et al. Adipose-derived cellular and cell-derived regenerative therapies in dermatology and aesthetic rejuvenation. Ageing Research Reviews. 54, 100933 (2019).
- Bellei, B., Migliano, E., Picardo, M. Therapeutic potential of adipose tissue-derivatives in modern dermatology. Experimental Dermatology. 31 (12), 1837-1852 (2022).
- Kraus, N. A., et al. Quantitative assessment of adipocyte differentiation in cell culture. Adipocyte. 5 (4), 351-358 (2016).
- Figueroa, A. M., Stolzenbach, F., Tapia, P., Cortés, V. Differentiation and imaging of brown adipocytes from the stromal vascular fraction of interscapular adipose tissue from newborn mice. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (192), (2023).
- Ma, Y., et al. Methotrexate improves perivascular adipose tissue/endothelial dysfunction via activation of AMPK/eNOS pathway. Molecular Medicine Reports. 15 (4), 2353-2359 (2017).
- Li, X., Ballantyne, L. L., Yu, Y., Funk, C. D. Perivascular adipose tissue-derived extracellular vesicle miR-221-3p mediates vascular remodeling. FASEB Journal. 33 (11), 12704-12722 (2019).
- Ruan, C. C., et al. Perivascular adipose tissue-derived complement 3 is required for adventitial fibroblast functions and adventitial remodeling in deoxycorticosterone acetate-salt hypertensive rats. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 30 (12), 2568-2574 (2010).
- Adachi, Y., et al. Beiging of perivascular adipose tissue regulates its inflammation and vascular remodeling. Nature Communications. 13 (1), 5117 (2022).
- Ye, M., et al. Developmental and functional characteristics of the thoracic aorta perivascular adipocyte. Cellular and Molecular Life Sciences. 76 (4), 777-789 (2019).
- Stanek, A., Brożyna-Tkaczyk, K., Myśliński, W. The role of obesity-induced perivascular adipose tissue (PVAT) dysfunction in vascular homeostasis. Nutrients. 13 (11), 3843 (2021).
- Queiroz, M., Sena, C. M. Perivascular adipose tissue in age-related vascular disease. Ageing Research Reviews. 59, 101040 (2020).
- Fitzgibbons, T. P., et al. Similarity of mouse perivascular and brown adipose tissues and their resistance to diet-induced inflammation. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 301 (4), H1425-H1437 (2011).
- Chang, L., et al. Loss of perivascular adipose tissue on peroxisome proliferator-activated receptor-γ deletion in smooth muscle cells impairs intravascular thermoregulation and enhances atherosclerosis. Circulation. 126 (9), 1067-1078 (2012).
- Piacentini, L., et al. Genome-wide expression profiling unveils autoimmune response signatures in the perivascular adipose tissue of abdominal aortic aneurysm. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 39 (2), 237-249 (2019).
- Wang, Z., et al. RNA sequencing reveals perivascular adipose tissue plasticity in response to angiotensin II. Pharmacological Research. 178, 106183 (2022).
- Shi, K., et al. Ascending aortic perivascular adipose tissue inflammation associates with aortic valve disease. Journal of Cardiology. 80 (3), 240-248 (2022).
- Fu, M., et al. Neural crest cells differentiate into brown adipocytes and contribute to periaortic arch adipose tissue formation. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 39 (8), 1629-1644 (2019).
- Gil-Ortega, M., Somoza, B., Huang, Y., Gollasch, M., Fernández-Alfonso, M. S. Regional differences in perivascular adipose tissue impacting vascular homeostasis. Trends in Endocrinology & Metabolism. 26 (7), 367-375 (2015).
- Bar, A., et al. In vivo magnetic resonance imaging-based detection of heterogeneous endothelial response in thoracic and abdominal aorta to short-term high-fat diet ascribed to differences in perivascular adipose tissue in mice. Journal of the American Heart Association. 9 (21), e016929 (2020).
