Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

العزلة والثقافة والحث الأديبوجيني للخلايا Preadipocytes المشتقة من جزء الأوعية الدموية اللحمية من الأنسجة الدهنية حول الأبهر للفأر

Published: July 21, 2023 doi: 10.3791/65703
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 1, 1
1Department of Cardiology, Shanghai Chest Hospital, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine
* These authors contributed equally

Summary

هنا ، نصف العزلة والثقافة والحث الشحمي للخلايا preadipocytes preadipocytes المشتقة من جزء الأوعية الدموية اللحمية من الأنسجة الدهنية حول الأبهر الفأر ، مما يسمح بدراسة وظيفة الأنسجة الدهنية المحيطة بالأوعية الدموية وعلاقتها بالخلايا الوعائية.

Abstract

الأنسجة الدهنية المحيطة بالأوعية الدموية (PVAT) هي مستودع للأنسجة الدهنية يحيط بالأوعية الدموية ويعرض الأنماط الظاهرية للخلايا الشحمية البيضاء والبيج والبني. ألقت الاكتشافات الحديثة الضوء على الدور المركزي ل PVAT في تنظيم التوازن الوعائي والمشاركة في التسبب في أمراض القلب والأوعية الدموية. إن الفهم الشامل لخصائص PVAT وتنظيمها له أهمية كبيرة لتطوير العلاجات المستقبلية. تعتبر الثقافات الأولية للخلايا الشحمية المحيطة بالأبهر ذات قيمة لدراسة وظيفة PVAT والحديث المتبادل بين الخلايا الشحمية المحيطة بالأبهر والخلايا الوعائية. تقدم هذه الورقة بروتوكولا اقتصاديا ومجديا للعزل والثقافة والحث الشحمي للخلايا preadipocytes المشتقة من جزء الأوعية الدموية اللحمية من الأنسجة الدهنية حول الأبهر للفأر ، والتي يمكن أن تكون مفيدة لنمذجة تكوين الدهون أو تكوين الدهون في المختبر. يحدد البروتوكول معالجة الأنسجة وتمايز الخلايا لزراعة الخلايا الشحمية حول الأبهر من الفئران الصغيرة. سيوفر هذا البروتوكول حجر الزاوية التكنولوجي في جانب مقاعد البدلاء للتحقيق في وظيفة PVAT.

Introduction

يعتقد أن الأنسجة الدهنية المحيطة بالأوعية الدموية (PVAT) ، وهي بنية حول الأوعية تتكون من خليط من الخلايا الشحمية الناضجة وجزء الأوعية الدموية اللحمية (SVF) ، تتفاعل مع جدار الوعاء المجاور عبر إفرازهابشكل شبه مكراني 1. كمنظم حاسم للتوازن الوعائي ، فإن خلل PVAT متورط في التسبب في أمراض القلب والأوعية الدموية2،3،4. يتكون SVF لأنسجة الخلايا الشحمية من العديد من مجموعات الخلايا المتوقعة ، بما في ذلك الخلايا البطانية والخلايا المناعية وخلايا الظهارة المتوسطة والخلايا العصبية والخلايا الجذعية الدهنية والخلايا السلفية (ASPCs)5,6. من المعروف أن ASPCs المقيمة في SVF للأنسجة الدهنية يمكن أن تؤدي إلى خلايا دهنية ناضجة5. يستدل على SVF ليكون مصدرا مهما للخلايا الشحمية الناضجة في PVAT. أظهرت العديد من الدراسات أن PVAT-SVF يمكن أن يتمايز إلى خلايا دهنية ناضجة في ظل ظروف تحريض محددة6،7،8.

يوجد حاليا نظامان للعزل لعزل SVF عن الأنسجة الدهنية ، أحدهما هو الهضم الأنزيمي والآخر غير الأنزيمي9. تؤدي الطرق الأنزيمية عادة إلى إنتاجية أعلى من الخلايا السلفية النواة10. حتى الآن ، تم إثبات فوائد SVF في تعزيز تجديد الأوعية الدموية والأوعية الدموية الجديدة في التئام الجروح وأمراض الجهاز البولي التناسلي والقلب والأوعية الدموية على نطاق واسع11 ، خاصة في الأمراض الجلدية والجراحة التجميلية12,13. ومع ذلك ، لم يتم استكشاف آفاق التطبيق السريري ل SVF المشتق من PVAT بشكل جيد ، والذي قد يعزى إلى عدم وجود طريقة موحدة لعزل SVF من PVAT. الهدف من هذا البروتوكول هو إنشاء نهج موحد للعزل والثقافة والحث الشحمي للخلايا preadipocytes المشتقة من SVF من PVAT الفأر المحيط بالشريان الأورطي الصدري ، مما يتيح مزيدا من التحقيق في وظيفة PVAT. يعمل هذا البروتوكول على تحسين معالجة الأنسجة وتقنيات تمايز الخلايا لزراعة الخلايا الشحمية حول الأبهر التي تم الحصول عليها من الفئران الصغيرة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

تمت الموافقة على بروتوكولات الحيوانات من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدام الحيوان في مستشفى شنغهاي للصدر التابع لكلية الطب بجامعة شنغهاي جياو تونغ (رقم الموافقة: KS23010) وكانت متوافقة مع اللوائح الأخلاقية ذات الصلة. يفضل ذكور وإناث الفئران C57BL / 6 الذين تتراوح أعمارهم بين 4-8 أسابيع لهذه التجربة.

1. إعداد الأدوات الجراحية ، والمخازن المؤقتة ، ووسائط الثقافة

  1. أدوات الأوتوكلاف الجراحية (مثل المقص الجراحي والملقط القياسي) عند 121 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. تطهير الأدوات المجهرية مع الكحول 75 ٪.
  2. تحضير محلول ملحي معقم مخزن بالفوسفات (PBS) مكمل ب 1٪ v / v بنسلين-ستربتومايسين و 10 مل أخرى من PBS مكملة ب 10٪ v / v بنسلين-ستربتومايسين.
    ملاحظة: في الأقسام التالية ، إذا لم يتم ذكرها على وجه التحديد ، يشير برنامج تلفزيوني إلى برنامج تلفزيوني معقم منتظم.
  3. تحضير كريبس رينجر HEPES BSA العازلة: 1٪ ألبومين مصل بقري (BSA) ، 20 مللي متر HEPES مذاب في محلول كريبس رينجر.
  4. تحضير محلول هضم طازج: كولاجيناز من النوع 1 (1 مجم / مل) وديباز II (4 مجم / مل) مذاب في محلول كريبس رينجر HEPES BSA. تعقيم الحل باستخدام مرشح 0.2 ميكرومتر.
  5. قم بإعداد صفيحة 12 بئر مغلفة بالكولاجين.
    1. خفف محلول الكولاجين (1 مجم / مل) بالماء منزوع الأيونات المعقم إلى تركيز 40 ميكروغرام / مل. أضف 1 مل من محلول الكولاجين المخفف على سطح كل بئر لتحقيق تركيز 6-10 ميكروغرام / سم2. احتضان الطلاء لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
    2. قم بإزالة المحلول المتبقي وشطف كل بئر 2x مع 1 مل من PBS. استخدم اللوحة على الفور ، أو جفف اللوحة بالهواء في غطاء التدفق الصفحي من الفئة الثانية وقم بتخزين اللوحة المطلية عند 2-8 درجة مئوية. عند التخزين ، أغلق الألواح المطلية بالأغشية.
  6. تحضير وسط الثقافة: متوسط النسور المعدلة من Dulbecco عالي الجلوكوز (DMEM) ، مصل بقري جنيني 10٪ (FBS) ، 1٪ v / v البنسلين - الستربتومايسين. يحفظ عند 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى 2 أسابيع.
  7. تحضير وسط الحث الشحمي: DMEM عالي الجلوكوز ، 10٪ FBS ، 1٪ v / v البنسلين - الستربتومايسين ، 1 نانومتر ثلاثي يودوثيرونين ، 1 ميكرومتر روزيجليتازون ، 1 ميكرومتر أنسولين ، 0.5 مللي مول 3-إيزوبوتيل -1-ميثيل زانثين (IBMX) ، و 1 ميكرومتر ديكساميثازون. يحفظ عند 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى 2 أسابيع.
  8. تحضير وسط الصيانة: DMEM عالي الجلوكوز ، 10٪ FBS ، 1٪ v / v البنسلين - الستربتومايسين ، 1 نانومتر ثلاثي يودوثيرونين ، 1 ميكرومتر روزيجليتازون ، و 1 ميكرومتر أنسولين. يحفظ عند 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى 2 أسابيع.

2. تشريح وعزل الأنسجة الدهنية المحيطة بالأوعية الدموية (PVAT)

  1. القتل الرحيم للفأر عن طريق خلع عنق الرحم تحت 2 ٪ من التخدير isoflurane أو مع جرعة زائدة من ثاني أكسيد الكربون. رش مع الكحول 75 ٪ لتطهير الجلد.
  2. ضع الماوس في وضع ضعيف (متجها لأعلى).
  3. ارفع الجلد ، وقم بعمل شق صغير ، وافصل بصراحة بين الجلد وعضلات البطن باستخدام مقص جراحي على طول خط الوسط البطني من الحوض إلى الرقبة. كشف القلب والرئتين عن طريق قطع الحجاب الحاجز والأضلاع على طول جانبي خط الوسط.
  4. قم بإزالة الكبد والطحال والأمعاء والكلى بعناية. تجنب قطع جدار الأمعاء.
  5. إزالة الرئتين والمريء.
  6. ارفع القلب برفق بالملقط في يد وافصل الشريان الأورطي عن العمود الفقري بمقص جراحي في اليد الأخرى. ثم ضع القلب والشريان الأورطي في طبق بتري 60 مم مع برنامج تلفزيوني يحتوي على 1٪ v / v البنسلين والستربتومايسين.
  7. قم بإزالة ملقط الجراحة المجهرية والمقص المجهري من الكحول واشطفه في 25 مل من برنامج تلفزيوني لإزالة الكحول الزائد. تحت المجهر المجسم ، قم بإزالة الغدة الصعترية والأنسجة الأخرى من القلب والشريان الأورطي ، ثم قم بإزالة القلب ، وترك الشريان الأورطي مع PVATs.
  8. نقل الشريان الأورطي مع PVATs إلى طبق بتري 60 مم نظيفة مع PBS تحتوي على 1٪ v / v البنسلين الستربتومايسين.
  9. استخدم ملقط الجراحة المجهرية لتجريد PVATs ، مع زوج واحد من الملقط يثبت الشريان الأورطي والآخر يسحب الأنسجة الدهنية. قم بإزالة الأنسجة الوعائية قدر الإمكان مع تقليل الضرر الذي يلحق بالأنسجة الدهنية المحيطة بالأوعية.
  10. اجمع PVAT المحيط بالشريان الأورطي الصدري في أنبوب طرد مركزي صغير سعة 2 مل يحتوي على DMEM عالي الجلوكوز مكمل ب 1٪ v / v البنسلين والستربتومايسين الموضوعة على الجليد.

3. عزل الكسر الوعائي اللحمي (SVF)

  1. شطف الأنسجة التي تم جمعها بالتتابع مع برنامج تلفزيوني يحتوي على 10٪ v / v البنسلين الستربتومايسين و PBS التي تحتوي على 1٪ v / v البنسلين الستربتومايسين.
    ملاحظة: من هذه الخطوة فصاعدا ، يجب إجراء جميع التجارب في ظل ظروف معقمة في غطاء التدفق الصفحي من الفئة الثانية.
  2. نقل الأنسجة إلى طبق بتري معقم 60 مم ، إضافة 200 ميكرولتر من محلول الهضم ، وفرمها إلى 1 مم3 قطع باستخدام مقص معقم.
  3. انقل المزيج إلى أنبوب طرد مركزي سعة 15 مل باستخدام طرف ماصة بلاستيكي ، وتم توسيع النهاية بقطع مقص معقم ، وأضف 6 مل من محلول الهضم لبدء تفاعل الهضم.
    ملاحظة: تفاعل هضم واحد (3 مل من محلول الهضم) يكفي لمستودعات PVAT من ستة فئران.
  4. احتضان الأنسجة عند 37 درجة مئوية في حاضنة مع شاكر مداري (تردد 150 دورة في الدقيقة للخلط الفعال) لمدة 30-45 دقيقة. اربط الأنابيب بشكل مسطح على رف لجعل الأنابيب تهتز أفقيا. رج اللوح لأعلى ولأسفل بقوة باليد لمدة 10 ثوان كل 5-10 دقائق.
    ملاحظة: يمكن إيقاف الهضم عند رؤية سائل هضمي متجانس مصفر مع عدم ترك شظايا الأنسجة.
  5. قم بتصفية الأنسجة المهضومة من خلال مصفاة خلية 70 ميكرومتر في أنبوب طرد مركزي سعة 50 مل. شطف مصفاة الخلية مع حجم متساو من وسط الثقافة لزيادة إنتاج الخلايا ووقف عملية الهضم.
  6. انقل المرشح إلى أنبوب طرد مركزي جديد سعة 15 مل وجهاز طرد مركزي عند 1800 × جم لمدة 10 دقائق. اقلب الأنبوب للتخلص من المادة الطافية وأعد تعليق الكريات في 5 مل من برنامج تلفزيوني. جهاز طرد مركزي عند 1800 × جم لمدة 5 دقائق.
  7. تخلص من المادة الطافية عن طريق قلب الأنبوب وإعادة تعليق الكريات في حجم مناسب من وسط الاستزراع.
    ملاحظة: يتم إعادة تعليق كريات الخلايا التي تم جمعها من كل ستة فئران في 1 مل من وسط الاستزراع وزرعها في بئر واحدة من صفيحة 12 بئرا.
  8. بذر الخلايا في صفيحة 12 بئرا مغلفة بالكولاجين واحتضانها عند 37 درجة مئوية في جو رطب مع 5٪ CO2 طوال الليل.
  9. في اليوم التالي ، قم بشفط وسط الاستزراع ، واغسل الخلايا باستخدام برنامج تلفزيوني مسخن مسبقا (37 درجة مئوية) يحتوي على 1٪ v / v البنسلين - الستربتومايسين لإزالة بقايا الخلايا وخلايا الدم الحمراء ، وأضف مرة أخرى 1 مل من وسط الاستزراع الطازج لكل بئر.

4. الحث الأديبوجيني للخلايا preadipocytes المشتقة من SVF من الأنسجة الدهنية حول الأبهر

  1. قم بتغيير وسط الثقافة كل يوم حتى تصل الخلايا إلى التقاء ~ 60-70٪.
    ملاحظة: عادة ما يستغرق 3-4 أيام حتى تصل الخلايا إلى التقاء 60-70٪.
  2. عندما تصل الخلايا إلى التقاء 60-70٪ ، قم باستنشاق وسط الثقافة واستبدله بوسط تحريض دهني بني. النظر في يوم تحريض التمايز adipogenic كما اليوم 0 من التمايز.
  3. بعد 72 ساعة (اليوم 3 من التمايز) ، قم بتحديث الوسيط بوسيط صيانة. تغيير وسيط الصيانة كل 2 أيام حتى يتم استخدام الخلايا للتجارب.
  4. تحليل الخلايا الدهنية بطريقة مناسبة ، مثل تلطيخ الزيت الأحمرO 14 والنشاف الغربي15.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

باستخدام هذا البروتوكول الموصوف أعلاه ، قمنا بعزل PVATs بعناية حول الأبهر الصدري للفأر (الشكل 1A-D). بعد غسل وفرم PVATs إلى قطع صغيرة باستخدام مقص معقم (الشكل 1E ، F) ، تم هضم شظايا الأنسجة في محلول هضم يحتوي على كولاجيناز من النوع الأول (1 مجم / مل) و dispase II (4 مجم / مل) وتم تحضينها عند 37 درجة مئوية على شاكر لمدة 30-45 دقيقة (الشكل 1G). تم تصفية الأنسجة المهضومة من خلال مصفاة خلية 70 ميكرومتر في أنبوب طرد مركزي سعة 50 مل (الشكل 1H). تم جمع كريات الخلايا بعد الطرد المركزي (الشكل 1I).

لتأكيد الإمكانات الدهنية للخلايا preadipocytes المشتقة من SVF ، قمنا بتحفيز الخلايا بوسط تحريض دهني بني يحتوي على 1 نانومتر ثلاثي يودوثيرونين ، 1 ميكرومتر روزيجليتازون ، 1 ميكرومتر أنسولين ، 0.5 مللي متر IBMX ، و 1 ميكرومتر ديكساميثازون. لوحظت الخلايا الشحمية الناضجة بعد 7-10 أيام من الحث الدهني البني ، والتي تتميز بتكوين فجوات غنية بالدهون ملطخة بالزيت الأحمر (الشكل 2 أ). أظهر تحليل النشاف الغربي كذلك زيادة مستويات التعبير للبروتينات الخاصة بالخلايا الشحمية ، بما في ذلك adiponectin و Fabp4 و Pgc1α و Pparγ و Ucp1 وبروتين الميتوكوندريا Cox IV (الشكل 2B ، C). تشير هذه البيانات إلى أن الخلايا preadipocytes المشتقة من SVF من الأنسجة الدهنية حول الأبهر للفأر تظهر إمكانات قوية للشحم.

Figure 1
الشكل 1: عزل الكسر الوعائي اللحمي من الأنسجة الدهنية حول الأبهر للفأر . (أ) يتم تشريح القلب والشريان الأورطي بعناية باستخدام ملقط ومقص جراحي. تشير رؤوس الأسهم البيضاء والصفراء إلى القلب والشريان الأورطي ، على التوالي. (ب) يتم تجريد PVATs المحيطة بالشريان الأورطي الصدري بعناية باستخدام ملقط. ج: الشريان الأورطي المتبقي بعد إزالة PVAT المحيط بالشريان الأورطي الصدري. (د) يتم جمع PVATs في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 2 مل يحتوي على نسبة عالية من الجلوكوز DMEM مع 1٪ v / v البنسلين - الستربتومايسين. (ه) يتم شطف PVATs بالتتابع مع PBS التي تحتوي على 10٪ v / v البنسلين - الستربتومايسين و PBS التي تحتوي على 1٪ v / v البنسلين - الستربتومايسين. (و) فرم PVATs إلى 1 مم3 قطع باستخدام مقص معقم. (ز) نقل PVATs المفرومة إلى أنبوب طرد مركزي سعة 15 مل يحتوي على 6 مل من محلول الهضم ، واحتضان الأنسجة عند 37 درجة مئوية لمدة 30-45 دقيقة مع الهز عند 150 دورة في الدقيقة. (H) إيقاف الهضم وتصفية المعلق من خلال مصفاة خلية 70 ميكرومتر إلى أنبوب طرد مركزي سعة 50 مل. (ط) جهاز الطرد المركزي الراشح عند 1800 × غرام لمدة 10 دقائق؛ تم عزل SVF. الاختصارات: PVAT = الأنسجة الدهنية حول الأوعية الدموية. SVF = جزء الأوعية الدموية اللحمية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: التمايز الأديبوجيني للجزء الوعائي اللحمي من الأنسجة الدهنية حول الأبهر للفأر . (أ) صور تمثيلية للمجهر الضوئي وتلطيخ الزيت الأحمر O للخلايا الشحمية الأولية المتمايزة عن الخلايا السابقة للشريطي حول الأبهر في اليوم 8. قضبان المقياس = 200 ميكرومتر. (B ، C) تحليل النشاف الغربي لمستويات البروتين من adiponectin و Fabp4 و Pgc1α و Pparγ و Cox IV و Ucp1 للخلايا الشحمية الأولية المتمايزة عن الخلايا preadipocytes المحيطة بالأبهر في اليوم 8. تم استخدام اختبارات t للطالب ثنائي الطرف غير المزاوج لحساب الفروق ذات الدلالة النظرية بين المجموعتين. القيم تعني ± SEM. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

نقترح نهجا عمليا وممكنا للعزل والحث الشحمي للخلايا preadipocytes المشتقة من SVF من الأنسجة الدهنية حول الأبهر الفأر. مزايا هذا البروتوكول هي أنه بسيط واقتصادي. تعد الأعداد الكافية من الفئران ضرورية للعزل الناجح ، حيث يمكن أن تؤدي الأنسجة غير الكافية إلى انخفاض كثافة SVF وضعف حالة النمو ، مما يؤثر في النهاية على كفاءة الليبوجين. بالإضافة إلى ذلك ، يعد عمر الفأر عاملا مهما يجب مراعاته حيث تتناقص إمكانات SVF الشحمية مع تقدم العمر. يعد الفصل السريع والدقيق ل PVAT مع تقليل تلوث الأوعية الدموية أمرا بالغ الأهمية. يعد محلول الهضم أيضا مكونا رئيسيا لأن إضافة dispase II إلى كولاجيناز من النوع 1 يمكن أن يحسن معدل الهضم وإنتاجية الخلايا. من المهم إيلاء اهتمام وثيق لعملية الهضم لتجنب فرط الهضم لأنه قد يؤثر على بقاء الخلية. من الضروري اتباع تقنيات معقمة والحفاظ على ظروف الاستزراع المناسبة في جميع أنحاء البروتوكول.

تعتبر الثقافات الأولية للخلايا الشحمية المحيطة بالأبهر ذات قيمة لدراسة خصائص ووظائف PVAT. يوفر العزل والحث الشحمي للخلايا preadipocytes المشتقة من SVF من الأنسجة الدهنية المحيطة بالأبهر للفئران المعدلة وراثيا منصة لاستكشاف المنظم المهم لتمايز PVAT وتكوين الشحم في المختبر. PVAT هو معدل لتضيق الأوعية وإعادة تشكيل الأوعية الدموية بطريقة من الخارج إلى الداخل ، من خلال توليد جزيئات نشطة في الأوعية مثل بيروكسيد الهيدروجين ، أديبونيكتين ، أنجيوتنسين 1-7 ، بالميتات الميثيل ، كبريتيد الهيدروجين ، أكسيد النيتريك ، واللبتين3. تسمح هذه الطريقة المقدمة بإجراء مزيد من الدراسة للحديث المتبادل بين الخلايا الشحمية المحيطة بالأبهر والخلايا البطانية 16 ، وخلايا العضلات الملساء الوعائية (VSMCs) 17 ، والخلايا الليفية العرضية18 ، أو الضامة19 ، مما يوفر نظرة ثاقبة للأدوار المركزية ل PVAT في التسبب في أمراض القلب والأوعية الدموية مثل ارتفاع ضغط الدم وتصلب الشرايين والتضيق وتمدد الأوعية الدموية20،21،22.

بالإضافة إلى ذلك ، فإن العزلة والحث الشحمي للخلايا preadipocytes هي الأسس لدراسة سلالات PVAT وعدم تجانس PVAT. PVATs هي أسرة غير متجانسة بين الأوعية الدموية وداخلها ، تظهر كملامح نسخ متميزة ، والتي قد تسهم في السمات الوظيفية الفسيولوجية والمرضية المتميزة20,23. أفاد Chang et al. أن الفئران التي تحتوي على حذف PPARγ الخاص ب VSMC تفتقر إلى PVAT في المناطق الأبهرية والمساريقي ، مما يشير إلى أن PVAT قد تشترك في نفس الأصول الجنينية مع جدار الأوعية الدموية المحلي24. هناك أدلة على أن PVAT من أصول جنينية مختلفة قد يكون لها أنماط ظاهرية مختلفة25,26. إن PVAT المحيط بالشريان الأورطي الصاعد وقوس الأبهر (AA-PVAT) ، المشتق من خلايا القمة العصبية ذات الأصل الظاهر ، يشبه شكليا ونسخيا الأنسجة الدهنية البنية (BAT)27. في المقابل ، يميل SVF من PVAT المشتق من خلايا القمة العصبية إلى التمايز إلى خلايا دهنية بنية بسهولة أكبر من الخلايا الشحمية البيضاء في المختبر28. ومع ذلك ، فإن الشريان الأورطي البطني PVAT يظهر في المقام الأول النمط الظاهري الأبيض الشبيهبالأنسجة الدهنية 29. يرتبط النمط الظاهري الشبيه ب BAT من PVAT أو بيج PVAT بتأثيرات إعادة تشكيل مضادة للالتهابات ومضادة للأمراض ، مما يلقي الضوء على علاج أمراض القلب والأوعية الدموية عن طريق تعديل النمط الظاهري PVAT19,30. سيوفر هذا البروتوكول حجر الزاوية التكنولوجي على جانب مقاعد البدلاء.

ومع ذلك ، هناك بعض القيود على هذا البروتوكول. نظرا لمحدودية توافر PVAT ، فإن استخراج PVAT-SVF يتطلب عددا أكبر من الفئران. في الحالات التي يكون فيها الطلب مرتفعا على SVF ، قد يكون من الضروري إشراك أكثر من شخص واحد لتسريع التقدم التجريبي. بالمقارنة مع preadipocytes الخالدة ، تتطلب preadipocytes المشتقة من SVF موارد بشرية ومادية إضافية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح ، مالية أو غير ذلك ، للإعلان عنها.

Acknowledgments

تم دعم هذا العمل من قبل المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (82130012 و 81830010) ومشاريع التنشئة للبحوث الأساسية لمستشفى شنغهاي للصدر (رقم المنحة: 2022YNJCQ03).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.2 μm syringe filters PALL 4612
12-well plate  Labselect 11210
15 mL centrifuge tube Labserv 310109003
3,3',5-triiodo-L-thyronine (T3) Sigma-Aldrich T-2877 1 nM
50 mL centrifuge tube Labselect CT-002-50A
anti-adiponectin Abcam ab22554 1:1,000 working concentration
anti-COX IV CST 4850 1:1,000 working concentration
anti-FABP4 CST 2120 1:1,000 working concentration
anti-PGC1α Abcam ab191838 1:1,000 working concentration
anti-PPARγ Invitrogen MA5-14889 1:1,000 working concentration
anti-UCP1 Abcam ab10983 1:1,000 working concentration
anti-α-Actinin CST 6487 1:1,000 working concentration
BSA Beyotime ST023-200g 1%
C57BL/6 mice aged 4-8 weeks of both sexes Shanghai Model Organisms Center, Inc.
Cell Strainer 70 µm, nylon Falcon 352350
Collagen from calf skin Sigma-Aldrich C8919
Collagenase, Type 1 Worthington LS004196 1 mg/mL
Dexamethasone Sigma-Aldrich D1756 1 μM
Dispase II Sigma-Aldrich D4693-1G 4 mg/mL
Fetal bovine serum  Gibco 16000-044 10%
HEPES Sigma-Aldrich H4034-25G 20 mM
High glucose DMEM Hyclone SH30022.01
IBMX  Sigma-Aldrich I7018 0.5 mM
Incubator with orbital shaker Shanghai longyue Instrument Eruipment Co.,Ltd. LYZ-103B
Insulin (cattle)  Sigma-Aldrich 11070-73-8 1 μM
Isoflurane RWD R510-22-10
Krebs-Ringer's Solution Pricella  PB180347 protect from light 
Microsurgical forceps Beyotime FS233
Microsurgical scissor Beyotime FS217
Oil Red O  Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd A600395-0050
PBS (Phosphate-buffered saline) Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd B548117-0500
Penicillin-Streptomycin Gibco 15140122
Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L) Jackson ImmunoResearch  115-035-146 1:5,000 working concentration
Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) Jackson ImmunoResearch  111-035-144 1:5,000 working concentration
Rosiglitazone Sigma-Aldrich R2408 1 μM
Standard forceps Beyotime FS225
Surgical scissor Beyotime FS001

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Akoumianakis, I., Antoniades, C. The interplay between adipose tissue and the cardiovascular system: is fat always bad. Cardiovascular Research. 113 (9), 999-1008 (2017).
  2. Huang, C. L., et al. Thoracic perivascular adipose tissue inhibits VSMC apoptosis and aortic aneurysm formation in mice via the secretome of browning adipocytes. Acta Pharmacologica Sinica. 44 (2), 345-355 (2023).
  3. Xia, N., Li, H. The role of perivascular adipose tissue in obesity-induced vascular dysfunction. British Journal of Pharmacology. 174 (20), 3425-3442 (2017).
  4. Brown, N. K., et al. Perivascular adipose tissue in vascular function and disease: a review of current research and animal models. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 34 (8), 1621-1630 (2014).
  5. Ferrero, R., Rainer, P., Deplancke, B. Toward a consensus view of mammalian adipocyte stem and progenitor cell heterogeneity. Trends in Cell Biology. 30 (12), 937-950 (2020).
  6. Angueira, A. R., et al. Defining the lineage of thermogenic perivascular adipose tissue. Nature Metabolism. 3 (4), 469-484 (2021).
  7. Boucher, J. M., et al. Rab27a regulates human perivascular adipose progenitor cell differentiation. Cardiovascular Drugs and Therapy. 32 (5), 519-530 (2018).
  8. Saxton, S. N., Withers, S. B., Heagerty, A. M. Emerging roles of sympathetic nerves and inflammation in perivascular adipose tissue. Cardiovascular Drugs and Therapy. 33 (2), 245-259 (2019).
  9. Ferroni, L., De Francesco, F., Pinton, P., Gardin, C., Zavan, B. Methods to isolate adipose tissue-derived stem cells. Methods in Cell Biology. 171, 215-228 (2022).
  10. Senesi, L., et al. Mechanical and enzymatic procedures to isolate the stromal vascular fraction from adipose tissue: preliminary results. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 7, 88 (2019).
  11. Andia, I., Maffulli, N., Burgos-Alonso, N. Stromal vascular fraction technologies and clinical applications. Expert Opinion on Biological Therapy. 19 (12), 1289-1305 (2019).
  12. Suh, A., et al. Adipose-derived cellular and cell-derived regenerative therapies in dermatology and aesthetic rejuvenation. Ageing Research Reviews. 54, 100933 (2019).
  13. Bellei, B., Migliano, E., Picardo, M. Therapeutic potential of adipose tissue-derivatives in modern dermatology. Experimental Dermatology. 31 (12), 1837-1852 (2022).
  14. Kraus, N. A., et al. Quantitative assessment of adipocyte differentiation in cell culture. Adipocyte. 5 (4), 351-358 (2016).
  15. Figueroa, A. M., Stolzenbach, F., Tapia, P., Cortés, V. Differentiation and imaging of brown adipocytes from the stromal vascular fraction of interscapular adipose tissue from newborn mice. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (192), (2023).
  16. Ma, Y., et al. Methotrexate improves perivascular adipose tissue/endothelial dysfunction via activation of AMPK/eNOS pathway. Molecular Medicine Reports. 15 (4), 2353-2359 (2017).
  17. Li, X., Ballantyne, L. L., Yu, Y., Funk, C. D. Perivascular adipose tissue-derived extracellular vesicle miR-221-3p mediates vascular remodeling. FASEB Journal. 33 (11), 12704-12722 (2019).
  18. Ruan, C. C., et al. Perivascular adipose tissue-derived complement 3 is required for adventitial fibroblast functions and adventitial remodeling in deoxycorticosterone acetate-salt hypertensive rats. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 30 (12), 2568-2574 (2010).
  19. Adachi, Y., et al. Beiging of perivascular adipose tissue regulates its inflammation and vascular remodeling. Nature Communications. 13 (1), 5117 (2022).
  20. Ye, M., et al. Developmental and functional characteristics of the thoracic aorta perivascular adipocyte. Cellular and Molecular Life Sciences. 76 (4), 777-789 (2019).
  21. Stanek, A., Brożyna-Tkaczyk, K., Myśliński, W. The role of obesity-induced perivascular adipose tissue (PVAT) dysfunction in vascular homeostasis. Nutrients. 13 (11), 3843 (2021).
  22. Queiroz, M., Sena, C. M. Perivascular adipose tissue in age-related vascular disease. Ageing Research Reviews. 59, 101040 (2020).
  23. Fitzgibbons, T. P., et al. Similarity of mouse perivascular and brown adipose tissues and their resistance to diet-induced inflammation. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 301 (4), H1425-H1437 (2011).
  24. Chang, L., et al. Loss of perivascular adipose tissue on peroxisome proliferator-activated receptor-γ deletion in smooth muscle cells impairs intravascular thermoregulation and enhances atherosclerosis. Circulation. 126 (9), 1067-1078 (2012).
  25. Piacentini, L., et al. Genome-wide expression profiling unveils autoimmune response signatures in the perivascular adipose tissue of abdominal aortic aneurysm. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 39 (2), 237-249 (2019).
  26. Wang, Z., et al. RNA sequencing reveals perivascular adipose tissue plasticity in response to angiotensin II. Pharmacological Research. 178, 106183 (2022).
  27. Shi, K., et al. Ascending aortic perivascular adipose tissue inflammation associates with aortic valve disease. Journal of Cardiology. 80 (3), 240-248 (2022).
  28. Fu, M., et al. Neural crest cells differentiate into brown adipocytes and contribute to periaortic arch adipose tissue formation. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 39 (8), 1629-1644 (2019).
  29. Gil-Ortega, M., Somoza, B., Huang, Y., Gollasch, M., Fernández-Alfonso, M. S. Regional differences in perivascular adipose tissue impacting vascular homeostasis. Trends in Endocrinology & Metabolism. 26 (7), 367-375 (2015).
  30. Bar, A., et al. In vivo magnetic resonance imaging-based detection of heterogeneous endothelial response in thoracic and abdominal aorta to short-term high-fat diet ascribed to differences in perivascular adipose tissue in mice. Journal of the American Heart Association. 9 (21), e016929 (2020).

Tags

العزلة ، الثقافة ، الحث الأديبوجيني ، الخلايا preadipocytes المشتقة من جزء الأوعية الدموية اللحمية ، الأنسجة الدهنية حول الأبهر الفأر ، الأنسجة الدهنية المحيطة بالأوعية الدموية (PVAT) ، الخلايا الشحمية البيضاء ، الخلايا الشحمية البيج ، الخلايا الشحمية البنية ، التوازن الوعائي ، أمراض القلب والأوعية الدموية ، خصائص PVAT ، تنظيم PVAT ، الثقافات الأولية ، الخلايا الشحمية حول الأبهر ، الحديث المتبادل ، خلايا الأوعية الدموية ، البروتوكول الاقتصادي ، البروتوكول الممكن ، تكوين الدهون ، تكوين الدهون ، النمذجة في المختبر
العزلة والثقافة والحث الأديبوجيني للخلايا Preadipocytes المشتقة من جزء الأوعية الدموية اللحمية من الأنسجة الدهنية حول الأبهر للفأر
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Liang, M., Huang, Y., Jiang, Y., Hu, … More

Liang, M., Huang, Y., Jiang, Y., Hu, Y., Cai, Z., He, B. Isolation, Culture, and Adipogenic Induction of Stromal Vascular Fraction-derived Preadipocytes from Mouse Periaortic Adipose Tissue. J. Vis. Exp. (197), e65703, doi:10.3791/65703 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter